背景
了解细胞组织如何出现是发育生物学的主要挑战之一。任何特定阶段的细胞都是经过几轮细胞分裂的结果。因此，将连续细胞分裂事件的历史重建为细胞谱系树对于理解细胞模式至关重要[ 1,2,3 ]。在适合延时显微镜的情况下，存在各种程序来跟踪细胞及其分裂（ALT [ 3 ]、LineageTracker [ 4 ]、MorphographX [ 5]， ETC。）。然而，在某些情况下，在图像采集之前需要组织固定。在植物中，由于不存在细胞迁移，仍然可以通过递归回溯细胞分裂事件，从生成的静态图像推断细胞谱系。这要求图案足够定型，或者生物学家可以使用线索来识别子细胞。线索之一是在组织生长过程中可以保留的细胞几何形状。专家的眼睛所掌握的知识可能很难转化为算法[ 6 ]。

随着深度学习方法的出现，神经网络将越来越多地用于预测谱系，就像在其他生物王国中一样[ 7 ]，但需要更多的手动注释数据来训练网络。此外，迄今为止，生物图像信息学界还没有提出用户友好的工具来帮助生物学家从静态图像重建细胞谱系[ 6 ]。

在这里，我们提出了一个集成在 ImageJ/Fiji [8,9,10] 中的图形界面，用于从静态3D图像堆栈重建谱系树。界面设计直观，实验者可以轻松地以递归方式链接和注释单元格。

执行
这项工作的目的是开发一种工具，用于根据发育组织或生物体中细胞的标记图像交互式构建谱系树。为了构思这个工具，我们选择了 ImageJ/Fiji，这是一种被实验科学家广泛使用的用户友好软件。ImageJ/Fiji 包含插件开发功能。我们在此框架内用 Java 开发了 TreeJ 插件。

图。1
图1
TreeJ 界面和主要用户交互。TreeJ界面显示拟南芥芽顶端分生组织的表面。B姐妹细胞的结合，重建细胞谱系树的基本步骤。C从它们的共同祖先节点中拉出一组姐妹细胞。D使用treeV 格式保存C 中构建的树。TreeV 格式包含 2 个数组（以灰色显示），分别存储树结构和注释。在这个例子中，第二个数组是空的，因为树没有被注释

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图2
图2
使用 TreeJ 进行细胞谱系重建和注释：用植物胚胎进行说明。TreeJ界面显示拟南芥122 细胞胚胎可追溯到四代细胞。B 3D 胚胎原始图像（比例尺：10）。C B所示图像的 3D 分割。D带标签的内部树节点的输出图像。E输出回溯后的图像，外部零件。F输出回溯后的图像，内部部分。使用 ImageJ 3D 查看器进行 3D 渲染 [ 11 ]

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图形用户界面
创建的插件将当前图像嵌入到图形界面中（图 1 A）。TreeJ 界面由三部分组成。2D 图像或 3D 图像堆栈的当前切片显示在中间，以允许直接点击交互来选择要链接的单元格。右侧面板显示用于构建、标记和提取树和子树的按钮。左侧面板框架显示正在进行的树并提供输入/输出按钮。根据用户的问题，可以生成不同的输出。

输入
TreeJ 与任何区域分割软件获得的大量标记图像兼容。该界面可以在 8 至 32 位的任何 2D 或 3D 标签图像上启动。标签可能是不连续的（即，丢失标签），这在应用于分割图像的后处理操作时经常遇到。对输入图像的唯一假设是分割标签严格为正；如果存在，标签 0 应该是分段结构的背景（限制在下面的“树文件”段落中解释）。

树底层结构
在内部，TreeJ 根据用户输入指令构造二叉树结构。Java 类已用于通过存储单元信息的节点对象来组织树。）、一个用户注释（用空字符串初始化）和两个子单元的标签（初始化为 None ）组成。输入分割中存在的非母细胞，即树的叶子）。

打开插件后，图像中存在的单元（即标签）会生成叶子（没有链接子单元的节点）。然后，可以通过用户分配单元链路来创建新节点（图 1B）。为每个新创建的母细胞分配一个新的细胞标签。该标签自动定义为并附加到创建的节点。新节点还存储链接单元（即子单元）的标签。此过程逐步构建一棵树（或几棵不相交的树），该树显示在界面的左侧面板中（图 1 C）。

树形文件
TreeJ 允许以名为treeV（文件扩展名.treeV）的自制格式保存和加载重建的树。treeV 文件是一个 ASCII 文件，包含两个数组：一个对树进行编码，另一个对每个单元格的注释进行编码。对于包含n 个细胞的胚胎，树 V 的初始结构（即没有谱系）将是：

图一
其中两条灰线是treeV数据，是第i个单元格的标签。

树被存储为一个列表，其元素数量与最高标签编号相同，通常对应于添加到重建母细胞数量的输入细胞数量（上表中的 n ）（图1 D）。通过匹配列表的索引和单元格的标签，树结构可以仅编码在一个数组中。数组中的每个位置对应一个单元格。数组中任意位置存储的值给出了相应母单元的标签。

对于构建的树的根，分配值 0 以指示不存在母细胞。这意味着 TreeJ 隐式假设输入分割中没有单元格被标记为 0。否则，会导致分配不匹配。

注释作为按单元格标签索引的字符串数组保存在treeV 文件中。默认情况下，每个单元格的注释都是空字符串。TreeV 文件可以由 TreeJ 加载以继续、编辑或可视化先前的谱系重建。为了在其他软件中传输谱系，Newick 格式也可用作保存格式。

结果：TreeJ 功能
实验者的观察有时无法通过算法追踪，需要保存和结构化以便分析和共享。在植物上皮细胞中，谱系是生物学家可以从细胞模式直观推断出的数据之一。树数据结构可用于表示和利用此类观察结果。TreeJ 提供了这些结构和实验人员之间的接口，以生成、纠正、注释和可视化细胞谱系。

谱系重建
用户通过递归配对姐妹细胞来重建谱系树（图 1B）。要链接两个单元格，用户必须单击图像上的一对单元格或在专用字段中手动输入其标签值。验证配对会导致将新节点添加到树中、合并单元格对以及自动更新显示。

可以在树的任何深度轻松纠正错误。取消链接按钮通过分裂回任何选定的母单元来撤消错误的配对。

图3
图3
原真皮域中的细胞谱系重建。使用 ImageJ 3D 查看器 [ 11 ] 生成的 TreeJ 输出的 3D 可视化以及回溯过程中 TreeJ 帧中显示的树的 3D 可视化的组合。通过递归跟踪细胞分裂回到 16 细胞胚胎阶段所考虑域的祖细胞而获得的输出。包含 t 个步骤的回溯

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注释单元格和子树
TreeJ 允许引入生物学上重要的信息，例如细胞身份或特定解剖领域的定位。细胞谱系树的每个节点都可以用任意文本标识符进行标记。此注释可以在配对单元时或稍后完成。相同的标签可以用于不同的细胞（母细胞和子细胞），从而支持整个域的注释（参见图 2A中显示的树）。

输出
在谱系树重建过程中的任何时候，用户都可以创建修改后的标签图像的独立副本，因此可以使用 ImageJ 中可用的任何工具对其进行可视化和分析（请参阅下面的应用程序中开发的示例）。TreeJ 还允许创建包含由其母细胞标签指定的子树的细胞子集或共享相同标签的细胞子集的图像（图 1  C和图 2 D）。这为验证重建的谱系和分析定量选择的解剖领域提供了进一步的机会。

重建的树形图可以保存为 PDF、treeV 或 Newick 文件格式。TreeV 是一种自制格式，可以作为 TreeJ 的输入，从而允许在多个会话中进行谱系重建和更正。Newick 是一种被其他工具识别的通用树格式，用于进一步的树处理。

应用领域
拟南芥胚胎的谱系重建
拟南芥早期胚胎发育在几何形状和图案方面是一个典型的过程[ 12,13,14 ]。从一个独特的细胞开始，胚胎在不到十个细胞代的时间内建立了主要的组织和器官。组织模式是胚胎发育的一个重要方面，它出现在该过程的早期。在第三代，建立顶底轴，在第四代细胞，原胚层由具有不对称体积比的周缘分裂形成。在第 4 代细胞之后，在 16 细胞胚胎中，分裂开始发生变化。

由于种皮的厚度，必须固定胚胎才能研究其细胞组织（请注意，可以使用实时成像跟踪胚胎发育[ 13 ]，但分辨率不够准确，无法在 3D 中正确分割细胞）。固定发育时间的使用使细胞模式动力学的研究变得复杂，但由于细胞壁几乎固定了细胞组织，所以仍然可以推断出谱系。例如，为了跟踪第四代下游原真皮和内部结构域之间体积不对称的演变，我们考虑了 122 个细胞的胚胎（第七代）。细胞壁用碘化丙啶染色[ 15 ]（图 2B）。获取的 3D 图像被分割为形态分割ImageJ插件[ 16 ]（图 2C）。当存在错误时，手动更正分段。

我们使用 TreeJ 重建谱系树（图 2 A）。递归地，根据细胞形状的兼容性以及胚胎发育的专业知识来推断姐妹细胞（图 3）。一旦胚胎被追踪回16细胞阶段，我们就注释了对应于原胚层（Ext）和内部组织（Int）的母细胞（图 2A）。

文献中描述了早期胚胎发育过程中细胞分裂几乎是同步的[ 17 ]。随着成像方法的改进，时间分辨率显示出细胞分裂之间的延迟。这一现象在较老的胚胎谱系树中很常见[ 12 , 13 ]。同样，在 122 细胞胚胎上使用 TreeJ，重建的谱系呈现出细胞代沟。在重建的谱系中观察到不平衡的树（图 2A和图 3）。与内部组织相比，原胚层至少有一个额外的细胞世代。

使用 TreeJ 的标签图像提取功能，我们将表皮或内部组织祖先的细胞分为两幅不同的图像（图 2D）。然后，我们利用 ImageJ 中包含的工具分析了两种组织之间体积和细胞数量的差异。我们使用 MorphoLibJ 包的分析区域 3D 功能提取每个图像中的细胞体积。我们观察到，原胚层（73 个细胞）中存在的细胞多于内部组织（49 个细胞）中的细胞。这一结果与报道的代际转变一致[ 13 ]。此外，内部细胞的平均体积为（平均值±sd）和
对于外部细胞。这些体积分布也与之前的报告一致[ 12 ]。

利用TreeJ当前的视图图像提取功能，我们还获得了第四代回绕单元的体积。我们从第 4 代胚胎的四个不同部分中分离出重绕细胞（使用 ImageJ 工具获取来自 [ 18 ] 的标记图像）。然后，我们计算了回绕 122 细胞胚胎的每个四分之一的顶端和基底域中原真皮细胞和内部细胞之间的平均体积比。顶端和基底域的平均体积比分别为和。因此，原胚层和内部组织之间的体积不对称[ 12 , 14 ]在超过两代细胞后仍然存在。

拟南芥胚胎发育的重建动力学
对固定在不同发育阶段的多个胚胎使用 TreeJ，可以重建胚胎发生动力学的近似值 [ 19 ]。我们注释了 33 至 257 个细胞之间的 36 个胚胎的内部和原胚母细胞。使用 python 脚本，将 TreeJ 的注释与分割图像结合使用，计算细胞体积的分布（图 4 A）和每个胚胎的每个组织的体积（图 4 B）。按细胞数量对胚胎进行排序使我们能够重建这些数量的时间演变。

图4
图4
拟南芥胚胎发育过程中细胞和结构域生长的动态。对 36 个胚胎（来自 [ 19 ]）（点）的测量，按细胞总数排序。A内部和外部（原胚层）细胞的生长动态。误差线：sem B内部和外部（原胚层）域的生长动态

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图5
图5
拟南芥根细胞的分组和注释。A、B使用 ImageJ 3D 查看器 [ 11 ] 进行 3D 可视化，分别是通过形态分割ImageJ 插件 [ 16 ]获得的分割，俯视图和侧视图。树重建和标记后的C TreeJ 接口。D，x从 1 到 5）和每个层重建树。分配给分组单元的标签包含图层名称和位置编号。乙
使用 ImageJ 3D 查看器对位置 1 处的三层进行基于标签的选择（顶视图）获得的图像进行 3D 可视化

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观察到这两个区域的平均细胞体积呈整体下降趋势（图 4 A）。这种趋势与早期胚胎发生期间细胞增殖相对较快的速度一致[ 14 ]。尽管连续时间之间平均细胞体积存在波动，但由于细胞之间和胚胎之间的差异，原胚层细胞和内部组织细胞之间的平均体积存在显着差异。假设内部组织的体积较大可以用细胞数量较少来解释，因为细胞生成延迟。与内部组织的体积相比，原胚层的总体积较高（图 4B）与这种解释是一致的。

这些结果说明了 TreeJ 如何通过固定观察来帮助分析和揭示不同领域动态的全局趋势，这要归功于除了细胞谱系重建之外还可以执行的手动注释。

TreeJ的其他应用
TreeJ 通过链接单元来促进树的重建。将细胞连接在一起的原因可能是由于谱系关系，但也可能是由于任何其他类型的关系，如空间关系或功能关系。在下面的示例中，我们说明了如何将 TreeJ 用于细胞注释和分组，而与任何谱系关系无关。

图6
图6
每个组织 ( A ) 和每个细胞类型 ( B )沿细胞体积根轴的纵向演化。前三个根层中五个等距位置处的细胞体积。在内皮层和表皮（蓝色）或皮质（绿色）之间应用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫测试：* ( ) 和 *** ( )。B五个相同位置的毛母细胞和毛母细胞的细胞体积。毛母细胞和毛母细胞分布之间应用的柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验显示没有显着差异 (ns)

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植物根部沿其纵轴显示出定型的放射状组织[ 20、21 ]（ 图5 ）A、B）。该组织是从根尖出现的，根尖分生组织中的一组干细胞不断分裂，参与根的生长。干细胞呈放射状组织以产生组织放射状组织。根分生组织中的每个干细胞都位于组织层中细胞文件的起点，并确保其纵向生长。靠近根分生组织的细胞是最年轻的，细胞年龄随着细胞沿纵轴的位置而增加。因此，在固定根中，纵轴揭示了时间尺度。跟踪分裂的需要在根中不太相关，但其他细胞关系可以是相关的并且很容易由实验者确定。

根的区域化取决于几个因素。纵轴可以分为几个部分[ 22 , 23 ]：首先是根分生组织的分裂部分，然后是细胞生长的伸长区，然后是细胞结束发育以完全发挥功能的成熟区。沿径向轴线，同心组织具有不同的功能（图 5 ）A）。从外到内，首先是构成表皮的外部细胞，形成抵抗内部组织生长的承重屏障，然后是形成皮质（储存组织）的细胞。第三层细胞是内皮层，是一种过滤组织，保护由中柱鞘（产生侧根）和维管组织组成的内部组织。

给定沿两个轴的根组织，人们可以询问不同层（径向轴）在发育（纵向轴）过程中如何表现。大多数关于根的发育研究都是在 2D 中进行的，尽管最近 3D 测量引起了人们的兴趣 [24,25,26]，以便根据各种参数（位置、功能等）更精确地对细胞事件进行表型分析。使用 TreeJ，我们可以构建元数据来按细胞类型和年龄来分析细胞组。

我们沿着 3D 分割根图像从分生组织区选择了五个等距位置（图像采集和分割的协议与胚胎相同）。在每个位置，来自每个组织层（表皮、皮质或内皮层）的细胞被分组为单独的树，并由相应的位置和层注释（图 5C）。在这里，我们利用 TreeJ 中的可能性将任意数量的不相交树存储到单个表示中（图 5 ）D）。请注意，在本申请中，细胞以任意顺序链接并合并在树中，而不考虑它们的实际谱系关系，因为树被用作按位置和按组织对细胞进行分组的方式。使用 TreeJ 基于标签的图像创建功能，为每棵树生成一个单独的图像以提取测量值（图 5 E）。每组的平均细胞体积（位置+层）是根据使用 MorphoLibJ 包的分析区域 3D 插件获得的细胞体积测量值计算的 [ 16 ]（图 6 A）。统计分析显示表皮和皮质层的平均细胞体积增加相似（Kolmogorov-Smirnov (KS) 检验，
）。由于不对称形成性分裂产生内皮层和皮质细胞，内皮层含有较小的细胞（KS 检验； [ 27 ]。这些观察结果与最近报道的 3D 分析一致 [ 24 ]。

表皮由两种类型的细胞组成：毛母细胞（产生根毛）和毛母细胞 [ 28 , 29 ]。先前的 2D 描述显示这两种细胞类型之间存在不同的形状 [ 30]。由于毛母细胞更宽，而毛母细胞更细长，我们使用 TreeJ 来评估它们的 3D 体积在根尖是否不同。我们通过细胞相对于皮层细胞的空间位置来区分这两种细胞类型，并使用 TreeJ 对每种类型的细胞进行手动分组。如上所述，在每个位置链接和标记的细胞可以很容易地分成两个不同的图像，并且可以单独分析两种细胞类型，我们使用 python 脚本在五个纵向位置上自动化了这一过程。尽管成毛细胞和非成毛细胞的体积之间存在轻微的系统偏移，并且沿纵轴明显增加，但我们没有观察到显着差异（图 6B）。该结果与最近的 3D 观察结果一致 [ 24]但可能需要进一步分析，包括更大的样本，以检查分析区域末端可能的生​​长分歧。TreeJ 对于此目的很有用。

通过这些应用程序，我们展示了 TreeJ 提供了将静态图像中包含的任何单元格关系存储在唯一文件中的可能性。该文件可以在 ImageJ/Fiji 之外使用，并且可以轻松访问实验者的注释。

结论
使用 TreeJ，可以轻松构建、可视化细胞谱系，并从静态分段图像导出。格式化的树表示显示相对分裂率，并且可以用作系统的表型以在个体或突变体之间进行比较。使用 TreeJ 可以增强静态图像的谱系重建过程的稳健性，并提供标准化的表示形式，促进社区之间的沟通和共享。除了细胞谱系重建之外，TreeJ还支持与细胞谱系相关的进一步分析。借助 TreeJ 图像导出功能，可以从共同的前体中提取后代或将单元组织倒回到以前的配置。下游树重建的许多分析可以在 ImageJ/Fiji 生态系统内进行。然而，为了执行新的测量或分析，可以使用专用的 python 脚本等来提取和分析重建的树。TreeJ 可用于任何分段组织，无论是动物还是植物。

未来的发展包括基于机器学习方案的先前条目的配对[ 31 ]或注释[ 32 ]的自动化。可以使用 TreeJ 输出创建的参考数据集来训练 AI 模型。