背景
减数分裂是一种独特的细胞过程，被认为在真核生物中已经进化过一次[ 8 ]。该过程或其前体已在植物以外的物种中使用各种因素诱导[ 6,7,9 ]。梅德拉诺等人，[ 13] 提供了从具有六个基因异位表达的体细胞诱导生殖细胞样表型的证据，随后，这些细胞中的 1% 经历了减数分裂。这些结果表明体外减数分裂诱导在植物中也是可能的，同时可能只需要有限数量的因素。如果可能的话，体外减数分裂诱导将使植物育种者能够通过避免开花的需要来最大化每年生长的世代数量。在这里，我们的目标是提供一种资源来确定在没有花的情况下从有丝分裂向减数分裂转变的关键调节因子，这是实现体外育种的关键步骤。

植物研究的单细胞方法是几十年前建立的[ 4 ]，但最近的发展使单细胞成为一种强大的研究工具。重大进展包括单细胞 RNA 测序 [ 12 ] 或植物发育阶段的伪时间速度评估 [ 17 ]。原生质体、小孢子和细胞核也已被分离出来，并用作通过荧光激活细胞分选来研究单个细胞群的方法[ 1,2,18 ] ，从而能够在细胞类型水平上收集数据。最近，我们提出并构建了一种双荧光工具，用于利用从愈伤组织中分离的原生质体以高通量检测减数分裂样诱导[ 5]，Cook 等人，未发表，图 1）。潜在的低诱导率和许多潜在的诱导因素要求该系统可以扩展以同时分析许多细胞。我们在拟南芥中开发了这个工具，因为该物种拥有大量的遗传资源和突变体，而且世代周期之间的时间很短。此外，尽管拟南芥是双子叶植物，但细胞周期过程在植物中是保守的。MiMe 突变体提供了这方面的证据，其中细胞将进行有丝分裂而不是减数分裂。三个基因的突变导致了拟南芥和水稻的减数分裂中断[ 15 ]。

图。1
图1
用于高通量减数分裂样诱导检测的双荧光标记系统。RFP 和 GFP 荧光拟南芥根图像（左）。减数分裂样诱导后使用非等位基因荧光系统在原生质体中进行染色体分离检测的描述（右）。描述为同时含有 GFP 和 RFP 的细胞用同一较大圆圈内的红色和绿色椭圆来标识，仅含有 RFP 的细胞用红色圆圈表示，仅含有 GFP 的细胞用绿色圆圈表示，非荧光细胞由白色圆圈表示。RFP 和 GFP 基因分别用染色体上的红色和绿色小圆圈表示

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该方法论文详细汇编了各种协议，以实现减数分裂诱导测试，同时提供使用微流体装置来调整我们的系统的机会。这项工作的目标是：（i）提供开发用于研究单细胞的高通量系统的详细程序，同时还提供转换国际公认的 .fcs 格式文件的管道 [ 21 ]，https://isac- net.org/page/数据标准) to.csv 文件以使用开源软件进行分析。(ii) 严格评估复杂的多边形门控技术和开源阈值，以 (iii) 确定在模拟减数分裂诱导研究（大量二倍体细胞中的单倍体细胞）中检测小群体变化所需的最小荧光通道数量。

材料和方法
植物材料开发协议
使用根癌农杆菌介导的转化开发了两个纯合拟南芥品系，每个单基因座插入品系，一个携带35S::eGFP::NosT，另一个携带35s::mRFP::NosT。将拟南芥生态型 Col-0（转基因和野生型）种子放入微量离心管中，在 70% 乙醇中表面灭菌 5 分钟，在 1:1 漂白剂中表面灭菌 10 分钟（不超过 20 分钟）。将种子在无菌条件下冲洗 5-7 次，并在 4°C 的 1 mL 无菌水中分层 4 至 7 天。分层后，将种子铺在含有全强度 MS 培养基的方形板上（图 2；[ 16]]）。每方格播种四粒二倍体植物种子。然后将含有种子的平板在 23-24°C 下以 16/8 小时的光/暗循环进行孵育。用于杂交的二倍体植物可以直接播种在土壤上，7天后分层或从MS平板转移到土壤中，并在相同的光照和温度条件下继续生长。为了开发 GFP/RFP F1 植物，我们轻轻地从 GFP 系植物中去雄未开放的花蕾，并将来自 RFP 系植物的花粉施加到暴露的雌蕊上（图 2，[ 11 ]）。单倍体 RFP 植物是在 Ravi 和 Chan 之后开发的 [ 20]，其中 RFP 行是男性捐赠者。长角果成熟后，收集种子并在 37°C 下干燥 12-24 小时。随后将种子储存在 4°C 的干燥管中。

图2
图2
开发高通量减数分裂样诱导分析系统的步骤摘要

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愈伤组织起始
如上所述种植 F1 GFP/RFP 种子和对照（RFP、GFP 和 WT 基因型），每个平板大约有 15 至 20 颗种子。让幼苗在光照条件下生长20至23天(图 2和3 )。可以对 F1 进行基因分型以确保不存在交叉污染，但我们发现这是不必要的。在无菌条件下，我们使用镊子和剃刀去除叶子碎片并将其放置在愈伤组织诱导培养基上（图 3：修改自[ 23 ]）。将板用封口膜覆盖并置于 23-24°C 完全黑暗的环境中。大约一到两个月后，出现足够的愈伤组织用于原生质体分离。注意——为了获得最佳结果，愈伤组织应每 2 至 4 周进行传代培养。

图3
图3
愈伤组织诱导培养基。愈伤组织起始步骤示意图。愈伤组织图像是在叶子碎片在 CIM 上黑暗中生长 27 天后拍摄的。愈伤组织图像经过增强，更加清晰

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原生质体分离
对于原生质体分离，我们使用了 Yoo 等人修改的方案。( 26，参见食谱）。将八至十毫升含有粗酶和纤维素酶的无菌酶混合物添加到培养皿中。将白色愈伤组织块添加到混合物中并在无菌条件下使用刀片切成小块。注意——更健康的愈伤组织会产生更多的原生质体。将混合物在层流罩中在黑暗中孵育约3小时。温育后，旋转混合物以帮助原生质体分离的释放，然后将 W5 添加到混合物中，每次 1 mL，直至 5 mL，使最终体积为 13 至 15 mL。使用切割的 1000 µL 移液器吸头旋转样品并通过 40 µM 过滤器进入干净的 50 mL Falcon 管（此时无菌并不重要）。将另外 5 毫升 W5 添加到含有愈伤组织的培养皿中，旋转，并再次通过 40 µM 过滤器。所得混合物应约为 20 mL。注意——尽可能用箔纸覆盖溶液以避免光漂白。使用吊桶离心机在 100 转下对样品进行离心g ×5 分钟，使用减少的制动和加速。除去上清液，将 5 mL W5 添加到含有细胞的 Falcon 管中，然后轻轻重悬。将细胞转移至 15 mL 圆底管中，并使用适度的制动和加速以 100 g ×2 分钟离心。再次去除上清液并添加MMG至所需的细胞浓度。

尖峰测试
为了测试系统并比较分析技术，将少量来自单倍体 RFP 系的愈伤组织衍生的原生质体添加到来自二倍体 GFP/RFP 基因型的愈伤组织衍生的原生质体中，将细胞充分混合在一起，然后将样品通过用于分析的流式细胞仪。

流式细胞术和数据分析
将储存在 MMG 溶液中的新鲜分离的原生质体通过流式细胞仪运行，并使用 0.2 µm 过滤的 1X PBS 作为仪器鞘液。原生质体的 GFP 和 RFP 荧光分析是使用爱荷华州立大学生物技术流式细胞术设施办公室的荧光补偿，使用工厂直接的、未经修改的 BD FACSCanto（BD Biosciences；San Jose，CA）进行的。流式细胞仪设施工作人员使用 BD Biosciences 细胞仪设置和跟踪校准珠系统定期监测仪器性能。通过使用适当的单色对照样品，在每个实验中验证仪器校准和数据分析的门控。所用激光器的波长为 488 nm，功率为 20 mW，GFP 发射滤光片为 525/50 nm，RFP 发射滤光片为 610/20 nm。使用光散射和自发荧光特性的组合来鉴定完整的原生质体。BD FACSDiva (v.8.0.1) 软件用于多边形门控的一般数据采集和分析。对于阈值处理，FlowCal [3 ] 和 R 版本 4.1.3 [ 19 ] 以及包 ggplot2 版本 3.3.6 [ 24 ]、dplyr 版本 1.0.8 [ 25 ] 和 ggpubr 版本 0.4.0 [ 10 ] 用于文件转换、阈值处理和可视化。

统计方面的考虑
我们探索了三种基于门的分类方法。每个分类器将数据分为四组，并生成 RFP、WT、GFP + GFP/RFP 的计数（结合 GFP 和 GFP/RFP 的计数）。然而，这些计数存在错误分类，特别是 WT 类实际上包含 RFP 或 GFP/RFP 细胞。因此，为了适应错误分类的细胞，我们采用多项式模型，该模型在所有三个分类器中都是一致的。

结果
为了确定检测大型二倍体细胞群中模拟配子所需的荧光通道数量以及是否可以使用开源分析，对多边形门控和阈值（质量、RFP 和 GFP；或仅 RFP 和 GFP）进行了比较。图 4是来自 BD FACSDiva (v.8.0.1) 软件的多边形门控技术的一个示例，其中原始数据最初根据自发荧光特性分类为原生质体，然后使用前向和侧向散射进一步细化以确定与原生质体一致的物理特征。细化后，根据 RFP 和/或 GFP 荧光来定义细胞。对于阈值设定，多个通道的最大和最小值与开源软件一起使用来定义质量原生质体（如果使用质量阈值）以及红色和绿色荧光细胞（表 2）。对图4中的值 进行估计，以得出质量阈值（质量、RFP 和 GFP）的最大和最小平均荧光强度值（表 2）。此外，与使用侧向散射和 FITC.A 或 PE.CF594.A 来定义 RFP 和 GFP 范围的多边形门控相比，仅使用 FITC.A 和 PE.CF594.A 进行阈值分析来定义 RFP 和 GFP对于每个细胞群。

图4
图4
使用 BD FACSDiva (v.8.0.1) 软件进行多边形门控的细胞分类示例。值是质量值阈值的基础

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表2 基于平均荧光强度值的阈值
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表2提供了两种阈值技术所使用的最小和最大平均荧光强度值。质量阈值使用 FSC.H、SSC.H、BV605.A 和 BV510.A，而 FITC.A 和 PE.CF594.A 用于定义 RFP 和 GFP。质量阈值仅应用于一种阈值方法（质量、RFP 和 GFP），而 GFP 和 RFP 阈值则应用于两种阈值方法。

为了比较这两种阈值方法，我们评估了细胞群在 RFP 和 GFP 阈值方面的位置。图 5提供了来自不同基因型（RFP、GFP、GFP/RFP 和 WT）的重叠、未分类细胞群的可视化，并标记了 FITC.A 和 PE.CF594.A 阈值。这为 RFP 和 GFP 阈值的有效性提供了证据，可以使用我们的分析管道进一步微调。无论质量阈值如何，来自 RFP 植物系的细胞都可以通过 FITC.A 和 PE.CF594.A 阈值得到很好的解释。当使用质量阈值时，可以更好地考虑来自 WT 和 GFP 植物系的细胞。此外，来自 GFP 和 GFP/RFP 植物基因型的细胞在任一阈值分析中都没有很好地分离。

图5
图5
阈值确定。仅 RFP 和 GFP 的阈值（左）。质量、RFP 和 GFP 的阈值（右）。颜色代表来自单个样本或多个样本排序的所有细胞，没有 RFP 和 GFP 阈值（应用最多 10,000 个）。红色代表来自 2022 年 5 月 2 日和 2022 年 6 月 24 日整理的 RFP 系的愈伤组织原生质体。绿色代表来自 2022 年 2 月 5 日和 2022 年 6 月 24 日的 GFP 系的愈伤组织原生质体。金色代表 2022 年 2 月 5 日和 2022 年 6 月 24 日整理的来自 GFP/RFP（植物 #10）基因型的愈伤组织原生质体。紫色代表 2022 年 1 月 13 日 GFP/RFP (Plant#12) 基因型的愈伤组织原生质体。黑色代表 2022 年 1 月 13 日 WT 系的愈伤组织原生质体。黑色虚线代表用于分析的 RFP（PE.CF594.A；水平）阈值和 GFP（FITC.A；垂直）阈值

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我们观察了来自二倍体 GFP/RFP 基因型的细胞群，这些细胞群掺有来自单倍体 RFP 系的细胞，以比较多边形门控和阈值（图 6）。Wald 检验用于测试使用每种门控分析方法的 RFP 细胞的可检测性（表 3）。为此，通过各自的分析（即多边形门控或阈值）对每个GFP/RFP对照进行分析，并使用相同的分析与掺入进行比较（表 3）。

图6
图6
荧光原生质体分析。将单个细胞的流式细胞术数据分析相对于 RFP (PE.CF594A) 的对数和 GFP (FITC.A) 的对数绘制出来。仅 RFP 和 GFP 的阈值（顶行）、质量、RFP 和 GFP 的阈值（中行）、多边形门控（底行）。每行从左到右：0.0% RFP 增加、0.28% RFP 增加、1.18% RFP 增加、3.89% RFP 增加。黑色和紫色点代表分类为WT的细胞，绿色点代表分类为GFP的细胞，金色点代表分类为GFP/RFP的细胞，红色点代表分类为RFP的细胞。掺入百分比由多边形门控确定。两种阈值技术的轴限制都在 2 到 4 之间。每个散点图的直方图显示在附加文件1中

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表 3 RFP 标识
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如图 6中可以看出，所有三种分析类型都将RFP分类的细胞与分类为GFP和GFP/RFP的细胞进行群体分离。当不应用质量阈值时，似乎存在两种 RFP 分类细胞群，一种是不同的，另一种接近 GFP 和 GFP/RFP 分类细胞群。在所有三项分析中，除了 GFP/RFP 分类细胞之外，GFP 并不是一个独特的群体。此外，分类为WT的细胞和分类为GFP的细胞的分隔线也没有定义。

由于来自 RFP 系的细胞被掺入来自 GFP/RFP 基因型的细胞中以模拟减数分裂诱导，因此我们确定了检测到的 RFP 细胞的数量占细胞总数的比例以进行比较（表 3）。每种门控技术的数据均通过多项模型进行分析（参见“统计考虑因素”）”）以估计错误分类后存在于尖峰中的 RFP 细胞的百分比。Wald 检验的 p 值提供了强有力的证据，表明所有门控方法均可观察到低至 0.3% 的尖峰。对于最低掺入样品，仅对没有质量阈值的 RFP 和 GFP 进行阈值化导致检测到 0.16% RFP 细胞，并且与没有掺入的 GFP/RFP 样品相比，获得 0.013 的 p 值（表 3）。然而，与其他门控方法相比，多边形门控对检测到的 RFP 细胞百分比提供了更大的估计。将质量、RFP和GFP阈值以及仅GFP和RFP阈值检测到的RFP细胞比例回归到去除影响点后通过多边形门控获得的检测到的RFP细胞比例，并使用回归系数来衡量总体差异检出率（图 7）。这些简单线性回归分析表明，以多边形门控为基线，质量、RFP 和 GFP 阈值以及仅 RFP 和 GFP 阈值的估计回收率分别为 86% (SE 4.2%) 和 78% (SE 5.9%) ）， 分别。

图7
图7
回归数据。根据质量、RFP 和 GFP 的阈值（左）以及仅 GFP 和 RFP 的阈值（右）对从多边形门控获得的检测到的 RFP 细胞比例进行检测的 RFP 比例的回归

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讨论
使用我们概述的系统确定在检测减数分裂样诱导方面做出明智决策所需的数据点提供了证据，表明 RFP (PE.CF594.A) 和 GFP (FITC.A) 荧光是我们的系统可以评估的最低限度。通过减少做出决策所需的大量收集数据，该系统可以通过使用低成本微流体设备轻松扩展，这些设备正在得到越来越深入的研究[ 14]。通过微流体，我们设想研究人员采用经过候选减数分裂诱导因子处理的愈伤组织培养物并分离原生质体。然后，这些细胞可以通过配备激发激光器和两个检测器（RFP 和 GFP）的微流体装置，并分析荧光细胞群的变化。无需多个检测器，微流控设备可以取代流式细胞仪进行减数分裂诱导测试，因为它们可以用最少的硬件构建，并且仍然为减数分裂诱导评估提供可靠的数据，同时也为并行设备运行打开了大门。

开源数据分析包（例如本研究中使用的数据分析包）使研究人员能够以最少的资源充分利用所提供的工具。此外，所提供的管道允许研究人员将 .fcs 文件转换为 .csv 文件，以便在收集数据后他们可以微调和评估其分析，而无需熟练的流式细胞术专家。无需原生质体质量门控即可对阈值进行微调，从而提供了用户友好且高效的分析系统，该系统可以在命令行编码中以最少的背景轻松扩展。需要注意的是，由专业人士进行的多边形选通提供了重要的检测，并且在分析中进行了更精细的检测（图 4 ））。然而，无论采用何种分析技术，在本研究分析的所有加标样品中仍然发现 RFP 群体分布存在显着差异。

本文介绍的方法的优点是，可以在实验室环境中使用任何植物研究实验室都可以找到的设备在大约 66 天的时间内测试减数分裂诱导因子。此外，一旦建立愈伤组织，可以采用良好的做法将愈伤组织培养物保存几个月，从而为减数分裂诱导因子测试提供恒定的材料来源。该系统还消除了对染料和其他试剂的需求，因为荧光标记已经存在于基因组中。然而，我们系统的缺点之一是使用拟南芥在对作物物种进行测试时，我们很可能需要调整体外诱导减数分裂的条件或因素。此外，要求组织进行愈伤组织形成非常耗时，并且目前在某些物种中是不可能的。因此，我们不一定建议这是体外育种计划中使用的减数分裂样诱导的最佳系统，但应将其用作识别诱导因子的工具。