磷脂酰丝氨酸(PS)是细胞膜的组成成分，在细胞质小叶中尤其丰富，并在许多细胞功能中起重要作用，包括细胞极性的形成和细胞内囊泡运输。在哺乳动物细胞中的一些研究表明PS在通过内体的逆向膜运输中的作用，但是在酵母中，PS主要位于质膜(PM ),在细胞内细胞器中的作用仍然不清楚。此外，据报道，在PS-耗尽的酵母细胞中，极化的内吞位点形成是有缺陷的，但是在内吞机制中的作用还没有被很好地理解。在这项研究中，为了阐明PS在内吞途径中的作用，我们分析了PS耗竭对内吞内化和后内吞转运的影响。我们证明在缺乏PS合酶Cho1p的细胞中(cho1δ细胞)，交配信息素α因子在细胞中的结合和内化受到严重损害。有趣的是，细胞内吞的过程大部分不受影响，但是蛋白质从细胞内的运输反式-高尔基体网络(TGN)到质膜是有缺陷的，细胞表面蛋白的定位严重受损cho1δ细胞。我们还发现，在缺乏Rcy1p和Vps52p的细胞中，PS积聚在细胞内区室中，Rcy1p和VPS 52 p都与通过TGN的核内体到PM的转运有关，并且Snx4p-存在的核内体的数量增加。cho1δ细胞。这些结果表明PS在细胞表面膜蛋白的运输和定位中起着至关重要的作用。

关键词:磷脂酰丝氨酸，内吞作用，再循环，囊泡运输

介绍
磷脂酰丝氨酸(PS)是存在于真核细胞膜中的阴离子磷脂，是胞质小叶的主要成分。已知它在各种生物过程中起重要作用，包括血液凝固、凋亡细胞的吞噬和信号分子的募集(法多克以及其他人, 1992; 兰茨，2003年; 卢卡斯和赵，2011年).此外，已知PS失调与不同的神经系统疾病有关，例如阿尔茨海默病病和帕金森病(妈以及其他人, 2022).已知某些病毒，如人类免疫缺陷病毒和登革热病毒，通过与质膜(PM)外小叶中的PS结合来入侵宿主细胞(穆勒-坦克和莫里，2014年).因此，为了开发这些疾病的潜在治疗靶点，阐明由PS调节的细胞过程是重要的。

先前的研究已经报道PS在PM被极化并且是细胞极性发展所必需的(费尔恩以及其他人, 2011).高度保守的小GTP酶Cdc42调节真核细胞中细胞极性的形成(艾蒂安-曼内维尔，2004年; 皮绍德以及其他人, 2019).酵母酿酒酵母形成朝向交配对象的极化突起，使细胞直接接触(巴拉勒以及其他人, 2000).交配信息素α因子与受体Ste2p的结合导致Cdc24的募集，CDC 24是Cdc42p的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF ),并促进Cdc42p在交配突起顶端的活化，导致肌动蛋白在推定的芽位点聚合(夹馅三明治以及其他人, 2002; 假发以及其他人, 2004).相反，缺乏PS合酶、Cho1p(cho1δ)，显示极化Cdc42p定位的损伤，导致芽出现延迟和有缺陷的交配(费尔恩以及其他人, 2011).因为PS的极化分布需要分泌途径(费尔恩以及其他人, 2011)，细胞内囊泡运输似乎对细胞极性的建立很重要，但PS在囊泡运输中的作用仍未充分了解。此外，还不清楚为什么PS耗尽会导致配对突起形成缺陷。

在过去的十年中，已经开发了几种与PS高亲和力结合的探针，例如乳粘附素的C2结构域(Lact-C2)和evectin-2的PH结构域(evt-2 PH ),并且使用这些探针的研究已经揭示PS定位于内吞途径中的PM和细胞内区室(莫拉切维奇以及其他人, 2010; 内田以及其他人, 2011; 杨以及其他人, 2008).Sun和Drubin已经报道了两种阴离子磷脂，PI(4，5)P2和PS，在网格蛋白介导的酵母内吞位点起始和囊泡形成期间的功能(孙和德鲁宾，2012年).他们证明PI(4，5)P2对于内吞膜内陷是必需的，而PS对于内吞蛋白的有效募集和空间限制是重要的，例如晚期网格蛋白外壳蛋白Sla1p到PM(孙和德鲁宾，2012年).在哺乳动物细胞中的几项研究已经揭示了PS在通过内体的逆向膜运输中的作用(川崎市以及其他人, 2022; 李以及其他人, 2015; 内田以及其他人, 2011).内田以及其他人已经证明PS高度集中在再循环内体(REs)中，从而通过其PH结构域将evectin-2靶向到REs，并控制RE到高尔基体的转运(内田以及其他人, 2011).

EHD1(含Eps15同源结构域的蛋白1)，一种在内吞途径中起作用的动力蛋白样ATP酶，也显示通过与ps(李以及其他人, 2015; 纳斯拉夫斯基和卡普兰，2011年).EHD1与SNX-BAR蛋白介导的逆向转运有关，敲除EHD1导致内吞转铁蛋白从REs到PM的再循环缺陷(李以及其他人, 2015; 麦肯齐以及其他人, 2012).这些观察表明PS在哺乳动物细胞的内体区室中的特殊作用。在酵母中，PS分布在各种细胞器中，包括质膜、高尔基体和液泡(次司以及其他人, 2019)，但目前还不清楚PS是否在内体区室中具有特定的作用。几项研究表明，将PS从细胞膜的细胞外小叶转运到细胞质小叶的4型P-型ATP酶参与内体到高尔基体的转运(古田以及其他人, 2007; 坂根以及其他人, 2006)，表明PS在细胞内小泡运输中的作用。

在目前的研究中，我们发现在PS缺乏的情况下cho1δ细胞，交配信息素α因子在细胞中的结合和内化由于受体在PM的定位减少而受损。我们进一步证明了细胞表面蛋白在PM的定位在cho1δ细胞，这些蛋白质被错误地分类到液泡中。我们还证明了PS缺失导致Snx4内含体数量的增加。这些发现表明PS在细胞表面蛋白向PM的运输和定位中起着至关重要的作用。

材料和方法
酵母菌株
本研究中使用的酵母菌株列于表S1。所有菌株在25℃下生长在补充有2%葡萄糖和适当氨基酸的标准富含培养基(YPD)或合成培养基(SM)中。蛋白质的C末端荧光蛋白标记如前所述进行(丰岛以及其他人, 2014)

荧光显微镜和图像分析
使用配备有×100/NA 1.40 (Olympus)或×100/NA 1.49 (Olympus)物镜和Orca-R2冷却CCD照相机(Hamamatsu)的Olympus IX83显微镜，使用Metamorph软件(Universal Imaging)进行荧光显微术。双色成像使用配备有高速滤光器更换器(λ10-3；Sutter Instruments)，其可以在40毫秒内改变滤光器组。使用上述Olympus IX83显微镜和图像分离器(双视；Optical Insights ),其用565纳米分色镜分离图像的红色和绿色成分，并使红色成分通过630/50纳米滤光器，绿色成分通过530/30纳米滤光器。如上所述，这些分离信号是用一个CCD照相机同时拍摄的。所有细胞在对数早期至中期成像。如上所述，使用同步成像(64.5 nm像素尺寸)获取用于分析红色和绿色信号的共定位的图像。

α因子的荧光标记和内吞分析
如前所述进行α因子的荧光标记(丰岛以及其他人, 2006).对于胞吞作用测定，细胞生长至OD600在0.5毫升YPD中约0.5，短暂离心，并重新悬浮于含有5微米Alexa Fluor 594-α因子的20微升SM中。在冰上孵育2小时后，用冰冷的SM洗涤细胞。在25℃下，通过加入含有4%葡萄糖和氨基酸的SM开始内化

35s标记的α因子内化和结合试验
的准备和内部化35如前所述进行s标记的α因子(丰岛以及其他人, 2005).简而言之，细胞生长到一定程度600在50毫升YPD中约0.3，短暂离心并重新悬浮于4毫升含有1% (w/v) BSA，50 mM KH的YPD中2邮局（post office)4、pH 6和20 μg/ml尿嘧啶、腺嘌呤和组氨酸。添加后35s-标记的α-因子，在不同的时间点取出细胞等分试样，并在pH 1.1缓冲液中洗涤以除去表面结合的α-因子，从而可以测量内在化的α-因子，或者在pH 6缓冲液中洗涤以确定α-因子的总量(内在化和结合的)。通过闪烁计数确定每次洗涤后细胞相关的放射性的量。每个实验至少进行三次。对于结合试验，将生长至对数期中早期的细胞短暂离心，并重新悬浮于含有1% (w/v) BSA和放射性标记的α-因子的50 μl SM中。在冰上孵育2小时后，用冰冷的SM洗涤细胞并测量其放射性。

基于Nanoluc荧光素酶的分泌分析
Nanoluc (Nluc)荧光素酶报告质粒表达如下:使用pNL1.1 (Promega，Madison，WI)作为模板，通过PCR扩增含有MFA1信号序列(nt 1-267)的Nluc片段，并亚克隆到HindIII和XhoI消化的pBlueScript II SK (pBS-Nluc)中，和417-bp的5’UTR的SacI-HindIII片段中TPI1基因，它包含了南酿酒酵母TPI1启动子，使用酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增，并插入到SacI-和Hindi ii-消化的pBS-Nluc (pBS-PTPI1-Nluc)。接下来，200 BP的3’UTR的XhoI-ApaI片段TPI1基因，它包含了南酿酒酵母TPI1将终止子插入XhoI-和ApaI-消化的pBS-P中TPI1-Nluc (pBS-PTPI-Nluc-TTPI).为了创建整合质粒，PTPI-Nluc-TTPI被插入到经SacI和ApaI消化的pRS305 (pRS305-PTPI-Nluc-TTPI).集成pRS305-PTPI-Nluc-TTPI在LEU2基因座，通过EcoRI将质粒线性化，并转化到野生型或突变型细胞中。对于分泌测定，表达Nluc荧光素酶报道基因的细胞生长至OD600约0.5，溶于1.0毫升YPD中，短暂离心，然后重悬于新鲜的800微升YPD中。在每个时间点，将100 μl培养基等分并离心，通过Nano-Glo荧光素酶测定系统(Promega，Madison，WI)测量上清液中的荧光素酶活性。

结果
PS是Ste2受体在细胞表面定位所必需的
先前的研究已经证明PS对于正确的Cdc42定位和细胞极性的建立是必需的，并且PS耗尽导致Cdc42p的去极化，导致芽出现的延迟和随后的有缺陷的交配(费尔恩以及其他人, 2011).因此，首先，我们证实了响应交配信息素α因子的形态学变化(shmoo形态学)是否需要PS合成。在α因子处理后2小时，约82%的野生型细胞呈现shmoo形态，而cho1δ细胞很少这样做(~4%)(图一a)。检查是否cho1δ细胞在α-因子结合或α-因子诱导的信号转导方面存在缺陷，我们接下来研究了α-因子在细胞中的结合和摄取。我们标记了野生型和cho1δ细胞，并观察其定位。我们发现A594-α因子的荧光强度与cho1δ细胞相对于野生型细胞减少(图一b)。相反，在缺乏α因子受体Ste2p的细胞中几乎没有观察到A594-α因子结合(图一c ),证实α因子仅少量结合cho1δ细胞(图一c)。我们还观察到A594-α因子内化的明显延迟cho1δ细胞(图一d)。定量分析将A594-α因子定位分类为仅PM，PM和内体，或内体和空泡显示cho1δ细胞在α因子内化方面存在明显缺陷(图一e)。为了详细检查PS耗竭对α因子结合和细胞摄取的影响，我们使用35s标记的α因子。类似于A594-α因子，35s-标记的α-因子有效地整合到野生型细胞中，而它仅轻微地整合到野生型细胞中cho1δ细胞(图一f)。令人惊讶的是，α因子与cho1与野生型细胞相比，δ细胞减少至约10%,并且结合量几乎与δ细胞相同ste2δ细胞(图一g)。因为A594-α因子与cho1δ单元格，而35s-标记的α-因子很少结合，我们推测PS去除引起的PM脂质组成的变化可能导致A594-α-因子与细胞的非特异性结合。正如预期的那样，我们发现A594-α因子几乎不与ste2δ细胞，但结合到ste2δ细胞缺乏Cho1p，水平与cho1δ细胞(图一b，H)，表明A594-α因子与cho1δ细胞独立于Ste2受体。此外，我们发现cho1δ细胞Ste2p定位明显移至细胞内隔室，这与野生型细胞中的PM相关(图一我)。虽然大多数野生型细胞在PM和液泡中明显表现出Ste2-GFP，cho1δ细胞几乎没有Ste2p的PM定位(图一我，J)。细胞内Ste2-GFP与mCherry融合的Pep4p在野生型和非野生型中都高度共定位cho1δ细胞(图一I)，表明PS耗尽导致Ste2p从PM到液泡的错误分类。


图一
PM中Ste2的本地化需要PS

(A)野生型和野生型的微分干涉对比(DIC)图像cho1δ细胞生长至对数生长期早期，并用α因子处理3小时。条形图代表呈现shmoo形态的细胞百分比。数据显示了三次实验的平均标准偏差(SD)。(B，C)A594-α因子与野生型的结合cho1δ细胞(B)或野生型和ste2δ细胞(°C)。细胞与A594-α因子在冰上孵育2小时，用冰冷的SM洗涤，并通过荧光显微镜和DIC观察。(D)野生型和cho1δ细胞用A594-α因子处理，在洗去未结合的A594-α因子并将细胞加热至25℃后30分钟获取图像，箭头指示A594-α因子在PM的定位。(E)野生型和野生型A594-α因子定位的定量cho1δ细胞。柱状图代表了内在化后30分钟时，仅在PM(蓝色)、PM和内体(黄色)或内体和空泡(红色)处显示A594-α因子的细胞百分比。数据显示了三个实验的平均标准偏差(SD ),每个实验对每个菌株计数50个细胞。(F)在25℃下对指定菌株进行放射性标记的α因子内化分析。每条曲线代表三次独立实验的平均值，误差线表示每个时间点的SD。数据显示为60分钟时野生型细胞中α因子内在化量的相对值。(G)与野生型结合的α因子的相对量，cho1δ或ste2δ细胞。误差线代表至少三个实验的标准差。不同的字母表示显著差异p<0.005 between the cells (i.e., no significant difference for a vs. a, significant difference for a vs. b with p<0.005), one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test. Error bars indicate the standard SD from three experiments. (H) Binding of A594-α-factor to wild-type and ste2Δ cho1δ细胞。如(B，C)中所述观察细胞。(I)ste 2-GFP和Pep4-mCherry在野生型和cho1δ细胞。表达Ste2-GFP和Pep4-mCherry的细胞在YPD培养基中于25℃生长至早期对数期，并通过荧光显微镜和DIC观察。箭头表示Ste2-GFP在PM的定位。(J)在PM处Ste2-GFP的相对荧光强度的量化(n=每个菌株50个细胞)。***,p值< 0.005，不成对t-用韦尔奇校正法测试。比例尺，2.5 μm

PS耗竭不影响内吞小泡的形成和内化
考虑到荧光α因子与PM的结合和内化减少，我们接下来研究了CHO1基因缺失对内吞小泡形成和内化的影响。我们使用Sla1-GFP和Abp1-mRFP作为标记来跟踪内吞小泡的动力学(图2一) (卡松宁以及其他人, 2003).首先，我们对Sla1p和Abp1p进行了同步成像，以分析这些蛋白质在活细胞中的动态行为。在野生型细胞中，Sla1-GFP紧接着Abp1-mRFP募集，如在单个斑块的单个像素宽的线上产生的kymographs所示(图2a)。Sla1-GFP和Abp1-mRFP斑块的相似动力学在cho1δ细胞(图2a)，尽管Sla1-GFP的寿命在cho1相对于野生型细胞的δ细胞(约29.4秒对约35.1秒)。这一结果与先前的观察结果一致(孙和德鲁宾，2012年).我们接下来研究了CHO1基因缺失对内吞小泡动力学的影响。荧光强度和粒子追踪分析显示野生型和野生型的Abp1p斑块cho1δ细胞正常内化(图2c)，虽然Abp1-mCherry在cho1δ细胞与野生型细胞相比也略有延长(约15.1秒对约18.4秒) (图2b)。相反，早期外壳蛋白Syp1p和中期外壳蛋白Ent1p/2p的寿命在野生型和非野生型中几乎相同cho1δ细胞(图2b)。为了进一步研究PS缺失对网格蛋白外壳组装的影响，我们评估了cho1使用Syp1-3GFP的δ细胞(铃木法的以及其他人, 2012).分析活细胞的最大强度Z投影以确定每单位表面积的平均斑块数，并且仅在母细胞中量化斑块密度，其中单个斑块是可区分的。如所示图2d，在cho1δ细胞，相对于野生型细胞，每单位表面积的Syp1p斑块数没有变化。这些结果清楚地表明，内吞小泡的形成和内化正常发生在cho1δ细胞。最后，我们检测了3-三乙基铵丙基-4-对二乙氨基苯基六三烯基吡啶鎓二溴化物(FM4-64)的内化，这是一种亲脂性苯乙烯基染料，用于标记大量的内吞作用。当加入到野生型细胞中时，FM4-64立即被整合到PM中，通过大量的内吞作用被内化，然后在30分钟内被运输到液泡中(图2f，G)。该分析显示cho1δ细胞在膜内化中表现出很小的延迟，这表明细胞的内吞机制没有受到损害cho1δ细胞。


图2
PS耗竭对内吞小泡形成和内化的影响

(A)SLA 1-GFP和Abp1-mCherry在野生型和cho1δ细胞。右侧面板中显示了合并图像中沿线的Kymograph。(B)指定菌株的内吞蛋白SD的平均寿命。n=每种菌株50片。***,p值< 0.005，不成对t-用韦尔奇校正法测试。(C)对于Abp1-mCherry的斑块，荧光强度(红色)和距斑块形成位点的距离(蓝色)作为时间的函数的量化。使用Abp1-mCherry的单色电影对来自每个菌株的十个补丁的数据进行平均。荧光强度随着时间的推移进行光漂白校正。右侧显示了对单个皮质Abp1p斑块的追踪。Abp1-mCherry每1秒显现一次，并在贴片的整个寿命期间获得贴片运动轨迹。绿色和红色圆点分别表示第一个和最后一个位置。(D)sy P1-3 GFP在野生型和cho1δ细胞。中间的图像显示了野生型和cho1δ细胞用Syp1-3GFP标记。以0.2微米的间隔通过整个单元获得Z系列。(E)syp 1-3g FP/微米的定量2野生型SD和cho1δ细胞(n=每个菌株50个细胞)。(F)野生型和cho1δ细胞。在冰上用200微米FM4-64标记细胞15分钟。图像是在洗去未结合的FM4-64并将细胞温热至25℃后30分钟获得的。(G)条形图代表内在化后30分钟呈现定位于液泡的FM4-64的细胞的百分比。数据显示了至少三个实验的平均值，每个实验对每个菌株计数50个细胞。比例尺，2.5 μm

PS是细胞表面蛋白在质膜上定位所必需的
为了阐明Ste2p在前列腺癌中的定位降低cho1δ细胞是由再循环缺陷引起的，我们检验了cho1δ关于GFP-Snc1p的运输，这是一种内吞的细胞外v-陷阱，暂时定位于早期内涵体，并通过表示“横穿”高尔基网络(加兰以及其他人, 2001; 刘易斯以及其他人, 2000).已经表明，影响核内体介导的运输的突变经常导致Snc1p从PM错误定位到核内体或空泡区室(加兰以及其他人, 2001; 刘易斯以及其他人, 2000; 雷焦里以及其他人, 2003).在野生型细胞中，GFP-Snc1p定位于PM，内部结构有一些点状染色(图3a)，如以前的研究所示(刘易斯以及其他人, 2000).有趣的是，在cho1δ细胞中，GFP-Snc1的定位被转移到细胞内隔室(图3a)。定量分析显示GFP-Snc1在PM的荧光强度在cho1δ细胞相对于野生型细胞(图3b)。这些细胞内结构与液泡的标记物Pep4-mCherry显著共定位(图3a)。为了检测细胞表面蛋白在PM的定位是否通常需要PS合成，我们使用了酵母精氨酸渗透酶Can1p，已知其在内吞作用内化后通过TGN再循环到PM(古尔纳斯以及其他人, 2017).与Ste2p相似，大多数野生型细胞显示Can1-GFP在PM的定位，但细胞表面定位明显下降至约1.3%cho1δ细胞(图3c，D)。我们还检测了细胞壁传感器蛋白Wsc1p的定位，该蛋白通过内吞作用和从内体循环回细胞表面来维持(朴以及其他人, 2007; 上野以及其他人, 2014).虽然GFP标记的Wsc1p在野生型细胞中主要定位于PM，但在野生型细胞中定位于液泡cho1δ细胞(图3这表明PS通常是细胞表面蛋白在PM定位所必需的。定量分析显示，只有约2.7%的野生型细胞在液泡中具有Wsc1-GFP，而约90.7%的野生型细胞在液泡中具有ws C1-GFPcho1δ细胞呈现空泡定位(图3f)。为了进一步描述GFP-Snc1定位缺陷的特征cho1δ细胞，我们使用了一种GFP融合的Snc1(en-)突变体，它包含两个突变，V40A和M43A，这两个突变干扰细胞内吞作用并导致GFP-Snc1在野生型细胞(图3g)(刘易斯以及其他人, 2000).我们观察到GFP-Snc1(en-)定位于液泡中cho1δ细胞，表明从TGN到PM的运输有缺陷(图3g，H)。与此相一致的是，GFP-Snc1(en-)在PM的荧光强度在cho1δ细胞相对于野生型细胞(图3我)。为了进一步证实这一点，我们使用NanoLuc (Nluc)荧光素酶报告基因检查了对分泌途径的影响，该报告基因在N末端含有α因子的分泌信号。Nluc荧光素酶报告基因整合到野生型和非野生型染色体中cho1δ细胞，并在两种情况下评估培养基中的荧光素酶活性。在不表达Nluc荧光素酶的野生型细胞(模拟)的培养上清液中检测到很少的荧光素酶活性，而在表达Nluc荧光素酶的细胞中活性稳定增加，直到测量结束(图3j)。有趣的是，培养上清液中的荧光素酶活性cho1δ细胞显著减少，而细胞内活性增加(图3j，K)。此外，我们还研究了cho1δ细胞在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基上，因为分泌转化酶，由SUC2，是酵母细胞在培养基上生长的先决条件(图3l)(诺维克以及其他人, 1980).与使用NLuc荧光素酶报告基因获得的结果一致cho1δ细胞不能在含有蔗糖(图3l)。这些结果综合起来表明cho1δ细胞至少在从TGN到PM的路径上有缺陷，并且再循环回到PM的细胞表面蛋白可能被错误分类到TGN处的液泡中。


图3
PS是细胞表面蛋白再循环到PM所必需的

(A)GFP-sn C1和Pep4-mCherry在野生型或cho1δ细胞。表达GFP-Snc1和Pep4-mCherry的细胞在YPD培养基中于25℃生长至早期对数期，并通过荧光显微镜和DIC观察。(B)量化PM处GFP-Snc1的相对荧光强度。（n=每个菌株60个细胞)。(C)can 1-GFP在野生型和cho1δ细胞。在25℃下，表达Can1-GFP的细胞在补充有2%葡萄糖和低水平氨基酸的合成培养基中生长至早期对数生长期。(D)条形图代表在PM时表现出Can1-GFP定位的细胞的百分比。数据显示了三个实验的平均值±SD，每个实验对每个菌株计数50个细胞。(E)ws C1-GFP和Pep4-mCherry在野生型或cho1δ细胞。如(A)中所述，生长并观察表达GFP-Snc1和Pep4-mCherry的细胞。(F)条形图代表在液泡中显示Wsc1-GFP定位的细胞的百分比。数据显示了三个实验的平均值±SD，每个实验对每个菌株计数50个细胞。(G)GFP-sn C1(en-)和Pep4-mCherry在野生型和cho1δ细胞。如(A)中所述，生长并观察表达GFP-Snc1(en-)的细胞。(H)条形图代表在液泡中显示GFP-Snc1(en-)定位的细胞的百分比。数据显示了三个实验的平均值±SD，每个实验对每个菌株计数50个细胞。(I)量化PM处GFP-Snc1(en-)的相对荧光强度。（n=每个菌株50个细胞)。(J)对所示菌株进行的基于NanoLuc荧光素酶的分泌分析。每条曲线代表三次独立实验的平均值，误差线表示每个时间点的SD。数据显示为0分钟时野生型细胞培养基中荧光素酶活性的相对值。(K)条形图代表野生型和中的细胞内荧光素酶活性cho1δ细胞。数据显示了四次实验的平均值±标准差。(L)显示野生型生长表型的平板，和cho1δ细胞。在25℃将细胞铺在含有蔗糖作为唯一碳源的YPD或酵母蛋白胨糖琼脂(YPSA)培养基上。p值< 0.005，不成对t-用韦尔奇校正法测试。比例尺，2.5 μm

PS传感器在再循环途径有缺陷的酵母突变体的细胞内区室中积累
为了评估PS在细胞表面蛋白再循环中的潜在功能，我们接下来使用牛乳粘附素(Lact-C2)的立体特异性PS结合C2结构域研究了它的亚细胞定位(莱文蒂斯和格林斯坦，2010年; 杨以及其他人, 2008).首先，我们将一种PS特异性荧光探针，GFP融合的Lact-C2 (GFP-Lact-C2)引入到野生型和cho1δ细胞并观察其定位。如前所述，在野生型细胞中，Lact-C2-GFP仅定位于质膜，而在细胞质中大量表达cho1δ细胞(图4一) (费尔恩以及其他人, 2011; 孙和德鲁宾，2012年).如上所述，作为cho1δ细胞在TGN-to-PM途径中存在严重缺陷，但表现出正常的内吞内化，我们推测PS可能暂时定位于细胞内区室，如TGN和内体，并调节再循环途径。先前的研究表明，在缺乏Rcy1p(一种参与细胞表面蛋白再循环的F-box蛋白)的细胞中，Lact-C2-GFP在细胞内膜区室积累，并在那里与mRFP-Snc1共定位(加兰以及其他人, 2001; 马和伯德，2020; 维德凯尔以及其他人, 2000).正如先前报道的，我们观察到GFP-Lact-C2与mCherry-Snc1p在细胞内斑点高度共定位rcy1δ细胞(~90.0%)(图4b，C)。先前的研究也表明rcy1δ细胞Snc1p在早期内体与Tlg1p部分共定位，但不与Sec7p共定位，后者定位于TGN(最好的以及其他人, 2020; 马和伯德，2019).与Snc1p和Sec7p的情况相似，GFP-Lact-C2与存在于Sec7p的TGN(～14.7%)不能很好的共定位rcy1δ突变体(图4c，D)。我们还比较了PS与Hse1-tdTomato的定位，HSE 1-TD tomato是内体区室的标志，但没有观察到共定位(图4e，F)。这些结果表明TGN和内体都不是PS聚集的区域。为了进一步检测PS可能位于的细胞内区室，我们利用了细胞内小泡运输途径有缺陷的其他三种突变体。其中，我们发现Lact-C2-GFP也聚集在细胞内的膜区室vps52δ细胞。这VPS52基因编码GARP(高尔基体相关逆行蛋白)复合物的一个亚单位，该复合物是一种蛋白质复合物，参与蛋白质从内体到TGN的再循环(博尼法奇诺和耶罗，2011年).在大约24%的vps52δ突变体，GFP-Lact-C2位于Snc1p所在的细胞内点，但Sec7p和Hse1p不(图4b–F)。这表明PS从核内体到TGN的转运部分受损。vps52δ突变体。相比之下，GFP-Lact-C2显示出类似于野生型细胞的PM定位VPS3, VPS5或者VPS27编码早期至晚期内体、晚期内体至TGN或晚期内体至液泡运输所需蛋白质的基因(图4一) (鲍尔斯和史蒂文斯，2005年).这些观察表明PS有可能被内吞，并通过内体和TGN区室循环回PM。


图4
PS在具有缺陷内吞-再循环途径的酵母突变体中的定位

(A)Lact-C2-GFP和mCherry-Snc1在野生型和所示突变细胞中的定位。表达Lact-C2-GFP和mCherry-Snc1的细胞在25℃的YPD培养基中生长至对数生长期早期，并通过荧光显微镜观察。(B)在野生型和所示突变细胞的细胞内区室中Lact-C2-GFP和mCherry-Snc1的共定位的定量。误差线表示来自至少三个独立实验的SD。共定位的百分比计算为定位在细胞内mCherry-Snc1点中的Lact-C2-GFP的比率(n= 100)。(C，D)Lact-C2-GFP和Sec7-mCherry (C)或Hse1-tdTomato (D)在野生型或指定突变细胞中的定位。如(A)中所述，培养并观察细胞。(E，F)野生型和指定突变细胞中Lact-C2-GFP和Sec7-mCherry (D)或HSE 1-TD番茄的共定位的定量。误差线表示至少三次独立实验的标准偏差。共定位的百分比计算为定位在Sec7-mCherry或HSE 1-TD番茄斑点中的Lact-C2-GFP的比率(n= 100).比例尺，2.5 μm

PS缺失导致内体区室数量的增加
由于PS似乎暂时定位于TGN和内体，我们接下来研究了PS缺失对这些区域的影响。首先，我们检测了Kex2的定位，已知其定位于TGN和内体区室。Kex2p是一种位于TGN的信息素加工蛋白酶，被转运到内体，然后以逆转录酶依赖的方式再循环回到TGN(刘易斯以及其他人, 2000; 海员以及其他人, 1998).在…里cho1δ细胞Sec7p驻留的TGN的数量几乎与野生型细胞相同(图5a，B ),但是液泡处的Kex2-GFP的荧光强度显著增加(图5c)。这些观察表明，从内体到TGN的修复途径在cho1δ细胞。接下来，为了确定对核内体的影响cho1δ细胞，我们检测了Snx4p的定位，Snx4p是分选连接蛋白复合物的一个亚单位，介导从内体到TGN(海特马以及其他人, 2003).GFP-Snx4斑点在野生型和转基因番茄中都与HSE 1-TD番茄内含体共定位。cho1δ细胞(图5d)。有趣的是，我们发现这些GFP-Snx4位点的数量显著增加。cho1δ细胞(图5d，E)。这些观察结果表明PS缺失影响了从核内体到TGN的转运，导致核内体区室数量的增加。


图5
PS缺失导致Snx4p内含体数量增加

(A)野生型中Kex2-GFP和Sec7-mCherry的定位cho1δ细胞。表达Kex2-GFP和Sec7-mCherry的细胞在YPD培养基中于25℃生长至早期对数期，并通过荧光显微镜观察。(B)对(A)中显示的驻留Sec7p的TGN的数量进行定量。数据显示平均值SD(n=每个菌株30个细胞)。(C)量化液泡中Kex2-GFP的荧光强度。在PM处Ste2-GFP的相对荧光强度的定量(n=每个菌株50个细胞)。(D)sn x4-GFP和HSE 1-TD番茄在野生型和cho1δ细胞。如(A)中所述，培养并观察细胞。(E)对(D)中展示的Snx4p-驻留的内涵体的数量进行定量。数据显示平均值SD(n=每个菌株30个细胞)。***,p值< 0.005，不成对t-用韦尔奇校正法测试。用于PS定位和功能的2.5 μm(F，G)比例尺模型。在野生型细胞(F)中，PS定位于PM和再循环途径中的细胞内隔室。在…里cho1δ细胞，从核内体到TGN的转运被抑制，导致Ste2p、Can1p和Kex2错分至液泡。这cho1δ细胞在从TGN到PM的囊泡运输中也有缺陷。详见正文。红色T条表示在缺少Cho1p的情况下显示缺陷的步骤。

讨论
在这项研究中，我们已经表明PS合成对于细胞表面蛋白的定位是重要的。先前的一项研究表明，细胞缺乏CHO1由于Cdc42p的极性受损，基因的交配效率显著降低，CDC 42 p的极性是形成交配突起(费尔恩以及其他人, 2011).在这项研究中，它也显示了PS的损耗cho1δ细胞导致磷脂酰乙醇胺(PE)含量减少，但Cdc42的积累与PS的存在和极化相关，而与PE含量的变化无关(费尔恩以及其他人, 2011).在目前的研究中，我们证明了cho1δ细胞在细胞表面蛋白的定位上存在缺陷。因此，看起来交配效率的下降cho1δ细胞是由Ste2p从TGN到PM的有缺陷的运输引起的(图5f，G)。虽然已知与α-因子结合触发Ste2p通过内吞途径转运到液泡(希克和里兹曼，1996年; 丰岛以及其他人, 2009)，还不清楚在没有α-因子的情况下Ste2p是否被循环回PM。在我们之前的研究中，我们发现缺乏Arf-GAP Glo3p的细胞表现出与细胞表面结合的α因子显著减少(川田以及其他人, 2015).这glo3δ突变体在核内体到TGN的运输中有明显的缺陷，表明Ste2p不能有效地循环回PM(川田以及其他人, 2015).在…里cho1δ细胞，包括Ste2p在内的几种细胞表面蛋白被错误地转运到液泡中。我们还发现，GFP-Snc1(en-)突变体，不被内吞，定位于质膜和液泡，表明TGN到质膜的转运没有被完全破坏。这些观察结果表明，分泌和再循环途径的缺陷会降低Ste2p在PM的定位cho1δ细胞(图5g)。在野生型细胞中，我们提出Ste2p也是组成性内吞的，但随后从内体区室被取回至TGN，并再次穿梭回到细胞表面(图5f)。

一些研究报道了PS是细胞内囊泡运输所必需的cho1δ细胞在内吞位点形成中表现出缺陷(孙和德鲁宾，2012年).还表明，在cho1δ细胞Sla1p不优先定位于小芽中，而小芽中通常聚集了内吞肌动蛋白片(孙和德鲁宾，2012年).类似于这些先前的观察，我们已经表明大多数cho1δ细胞失去了内吞位点的极化定位。然而，定位于内吞作用最早期的Syp1p的定位、寿命和数量似乎大多正常，表明突变体内吞作用位点的形成没有受到严重影响。此外，野生型和野生型肌动蛋白贴片动力学几乎相同cho1δ细胞。因此，仍然不清楚为什么Sla1p和Abp1p的寿命延长cho1δ细胞，需要进一步的研究来确定PS在内吞途径中的作用。

在哺乳动物细胞中，已知PS在再循环内体(内田以及其他人, 2011).PS优先定位于再循环的内体，并且通过Lact-C2的过表达掩盖细胞内PS抑制了从REs到高尔基体的膜运输(内田以及其他人, 2011).在逆向运输过程中，动力蛋白样ATP酶EHD1通过其PS结合能力被招募到内体(李以及其他人, 2015).EHD1促进了管状囊泡载体从内涵体的分裂，PS的减少降低了EHD1在包含snx 1(snx 1-BAR复合物的一种成分)的内涵体中的定位，导致分裂缺陷(德奥以及其他人, 2018; 卡姆卡尔以及其他人, 2019; 川崎市以及其他人, 2022).在酵母中，已经证明SNX-BAR蛋白，Snx4-Atg20二聚体，也优先结合和重塑含PS的膜，从而从内体输出富含PS的膜以促进自噬和液泡膜融合(妈以及其他人, 2018).此外，以前的研究报道，酵母Drs2p(IV型P-型ATP酶家族中的一种磷脂移位酶)将PS翻转到内体膜的胞质小叶，这对于在内体处产生膜曲率是至关重要的(许以及其他人, 2013).这种Drs2p翻转酶活性是Gcs1内体定位所必需的，通过其+ALPS基序和早期内体与TGN(许以及其他人, 2013)，表明PS在这些细胞器之间的囊泡运输中起作用。我们目前的发现也表明了PS在细胞表面蛋白再循环中的普遍重要性。在缺乏Rcy1p或Vps52p的细胞中，我们已经证明ps积聚在介导内体到高尔基体运输的胞膜区室。相反，在缺乏Vps3p、Vps5p或Vps27p的细胞中，ps定位似乎是正常的。Vps3p是参与早期至晚期内体成熟的CORVET复合体的亚单位(诺德曼以及其他人, 2010)，而Vps5p是逆转录酶复合体的一个亚单位，介导从前囊内体区室到TGN的转运(诺思韦尔以及其他人, 2000; 海员，2007年).Vps27p在多囊体(MVB)分选过程中将ESCRT机制招募到内体(卡茨曼以及其他人, 2003).已知这些蛋白质的缺失会导致将货物错分至异常的内体结构或液泡(鲍尔斯和史蒂文斯，2005年).因此，Lact-C2在颗粒物质中的正常定位表明PS定位于早期的内体，而不是运输到晚期的内体。这一想法与先前的观察一致，即通过Snx4家族分选连接蛋白从早期内体逆向分选PS对于确保液泡融合发生在后期阶段是重要的(妈以及其他人, 2018).我们的发现是含有Snx4p的内含体的数量增加cho1cells也支持这个想法。