介绍
质粒是天然存在于细菌中的圆形、双链、自主复制的 DNA 分子。它们允许遗传物质的交换，从而赋予进化优势，例如，通过编码抗生素抗性、细菌间竞争因子或毒力因子的基因。(1,2)天然质粒的分子量从 1000 到 400,000 个碱基对不等，并且经常被非编码 DNA 夸大。(3)
工程质粒用于基因克隆和蛋白质表达。它们至少由三部分组成：DNA 复制起点、选择标记和多克隆位点。起源对于维持质粒至关重要，并决定其每个细胞的拷贝数及其不相容性组。(4)如果来自不同不相容组的质粒携带不同的选择标记，则可以一起使用。选择标记是迫使细胞保留质粒以保持活力的基因，例如在存在抗生素或缺乏必需营养素的情况下。最后，多克隆位点包含核酸内切酶限制位点，允许将感兴趣的遗传物质插入质粒中。在真核生物中，例如酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞，大多数表达载体充当穿梭质粒，通常在大肠杆菌中操作以与上述相同的方式，但具有在真核宿主中使用所需的附加特征，例如转录调控序列。历史上，工程质粒是通过限制酶消化获得的 DNA 片段构建的。因此，它们通常含有过量的非编码 DNA，使它们大于所需的大小（在大多数情况下 >3.5 kbp）。过量的 DNA 会带来限制，因为较小的质粒可以克隆较大的基因片段。此外，由于转化效率与质粒大小成正比，因此质粒中过量的非编码DNA会阻碍蛋白质工程、合成生物学和生物技术应用所需的大型DNA文库的生成。(5)尽管存在这些限制，但很少有人努力减少工程质粒中的非编码 DNA。为此，我们引入了“来自渥太华大学的质粒”(pUdO)，这是一组 28 个尺寸非常小的质粒。我们通过创建福氏志贺氏菌III 型分泌系统基于转录的分泌活性报告基因的改进版本来证明 pUdO 的实用性 (6)并进一步衍生用于在培养的哺乳动物细胞中表达蛋白质的质粒。

结果与讨论
细菌 pUdO 的设计、构建和验证
pUdO 由四个部分组装而成，分别为复制起点（紫色）、多克隆位点（蓝色）、桥（绿色）和抗生素抗性基因（红色；图 1 A）。多克隆位点和桥片段在整个质粒组中是不变的，并且是通过基因合成获得的。每个 pUdO 中的多克隆位点包含用于常规克隆和 Golden Gate 克隆的 IIP 型和 IIS 型限制位点，允许单锅消化和连接多个 DNA 片段。(8−11)这些限制性位点两侧是强单向转录终止子以及两个用于测序目的的通用引物结合位点（图 S1）。该桥包括一个双向转录终止子和两个通用引物结合位点以方便测序（图S1）。通过 PCR 从源质粒中分离出可变的复制起点和抗生素抗性基因（表 S1-S3）。对所选择的四个复制起点和七个抗生素抗性基因进行改组产生了 28 个细菌质粒（表 1）。质粒按照 pUdO#x 命名法命名，其中数字 (#) 表示复制起点（表 S2），字母（x）表示抗生素抗性基因（表S3）。

图 1. pUdO 质粒的设计、构建和验证。(A) pUdO 质粒的一般图谱。thrLABCt、arcAt、L3S2P21t：终止符；M13R、M13F、T7、T3：通用引物。(B) 通过用核酸内切酶Eco RI消化来验证 pUdO#x 质粒的分子量，并通过 1% 琼脂糖凝胶中的电泳进行分析。泳道 1 和 30 标记为 M：DNA 分子量梯；以千碱基对为单位的分子量显示在凝胶的左侧；泳道 2-29 标记有 pUdO#x 命名法的 #x（表 1 ）：用Eco RI消化 500 ng 的每种质粒。(C) 所选 pUdO 的碱基对大小与大肠杆菌中用作表达载体的相关对应物的碱基对大小相比。(D) 将lacp :: GFPsfm2插入 pUdO#c。(E)通过流式细胞术对 pUdO#c 中的lacp :: GFPsfm2产生的荧光进行定量， N = 3。显示中值 RFU ± 1 个标准差（误差条）。通过执行单向方差分析和 Tukey 多重比较测试来测试统计显着性（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）；N = 3。

选定的四个复制起点(#)属于不同的不相容组(表S2和S4 )：A组，pUC(#=1)；B 组，p15a (# = 2)；C 组，pSC101（# = 3）；非典型，pBBR1 (# = 4)，意味着原则上可以在同一单元中维持多个不同的 pUdO。pUdO1x 中使用的 pUC 源在每个细胞中保持 500 至 700 个拷贝。(12)pUdO2x 中的 p15A 复制起点在每个细胞中维持 10 至 12 个拷贝。(13)pUdO3x 中使用的 pSC101 复制起点在每个细胞中保留大约 5 个拷贝。(12)最后，pUdO4x 中的 pBBR1 复制起点在每个细胞中保持大约 5 个拷贝。(14)前三个复制起点允许在肠杆菌科细菌中维持质粒，而 pBRR1 是广泛的宿主范围复制起点，在博德特氏菌属、弧菌属、根瘤菌属和假单胞菌属中也有功能。 (15)简而言之，pUdO 具有四个复制起点之一，每个细胞维持 5 至 700 个拷贝的拷贝数，可用于调节感兴趣基因的表达水平。
选择标记与复制起点一起决定细菌共同维持质粒组合的能力。为了实现兼容性的灵活性，选择了七个抗生素抗性基因（x）：氨苄青霉素（x = a）、氯霉素（x = c）、卡那霉素（x = k）、壮观霉素（x = s）、四环素（x = te） 、甲氧苄啶 (x=t) 和博莱霉素 (x=z)（表 1、S3 和 S4）。选择甲氧苄啶和博莱霉素抗性基因是因为它们的大小较小（即分别为237 bp 和375 bp）。此外，抗生素抗性基因被放置在与多克隆位点终止子相同的链上，以使插入感兴趣的遗传物质的该区域免受上游启动子的影响。
多克隆位点包括与 M13-rev 通用引物互补的序列、Xma I/ Sma I 限制性位点、 thrLABC ( thrLABCt )转录终止子、多克隆位点本身、合成转录终止子 L3S2P21、HindIII限制性酶切位点位点，以及与 M13-fwd 通用引物互补的序列（图 S1和表 S4）。可以通过使用 M13-fwd 和 M13-rev 引物进行测序来确认克隆是否成功。Xma/ Sma I 和HindIII 限制性位点可用于将终止子和多克隆位点区域与感兴趣的遗传物质交换。所选择的终止子是最强且最不易重组的。(16)应该注意的是，用户必须包含一个启动子来表达其感兴趣的基因。由于多克隆位点侧翼的终止子在正向链上最有效，因此建议将启动子插入该链上。如果感兴趣的 DNA 片段的转录隔离并不重要，则可以将插入片段放置在反向链上。多克隆位点包含 16 个 6 或 8 bp 的 IIP 限制性位点，这些位点可被一些最常见、可靠且经济实惠的限制性酶切割，产生 5' 或 3' 粘性末端或平端。包括两组兼容的粘性末端限制位点（即，EcoRI 和 MfeI，以及 ii．XbaI、NheI 和 SpeI）。该区域的侧翼是三个串联的 IIS 型限制位点，可用于 Golden Gate 克隆（即 BsaI、BbsI 和 SapI）。为了减少对目的基因的假定翻译干扰，我们避免在 5' 端插入起始密码子，并在多克隆位点两端的三个阅读框中引入终止密码子（图 S1）。
该桥包括与 T7 通用引物互补的序列、三个终止密码子（在三个阅读框中）、一个 AscI 限制性位点、arcA 的双向转录终止子（ arcAt ）、一个 AvrII 限制性位点、三个终止密码子（在三个阅读框中）阅读框），以及与 T3 通用引物互补的序列（图 S1和表 S4）。在桥片段中插入双向arcAt，以减轻假启动子对多克隆位点插入基因表达水平的影响。AscI 和 AvrII 限制性位点在 pUdO 系列的大多数质粒中都是独特的，从而允许arcAt的交换与感兴趣的遗传物质或arcAt上游或下游遗传物质的克隆。因此，如果希望使用桥作为第二个克隆位点，则可以使用 T7 和 T3 通用引物对该区域进行测序。
pUdO#a 的第一个子集是通过四个片段的组装获得的。其他质粒通过两片段组装交换抗性基因而衍生自pUdO#a。每个 pUdO 的完整序列均使用 M13R、M13F、T3 和 T7 通用引物通过 Sanger 测序进行验证，这些引物在多克隆位点和桥中具有互补序列（图 1 A）。此外，通过琼脂糖凝胶电泳验证了每个 pUdO 的分子量，其中 28 个质粒中的每一个都用酶Eco RI 消化，该酶识别多克隆位点内的单个限制性位点。正如预期的那样，每个线性化的 pUdO 根据其预测的分子量范围从 1417 到 3241 bp 进行迁移（图 1 B 和表格1）。pUdO 的小尺寸是由于修剪了多余的 DNA，这种多余的 DNA 在原始来源质粒中很常见，但在单个组件的扩增过程中被丢弃。例如，pUdO1a 和 pUdO1k 比其众所周知的对应物 pUC18、pQE-30 和 pET-28a 小（图 1 C）。此外，pUdO1z 和 pUdO1t 的大小与 pICOz 相当，后者是有史以来最小的质粒之一。(17)值得注意的是，与 pICOZ 相比，pUdO1z 和 pUdO1t 的尺寸较大，本质上是由于它们具有更大的多克隆位点、添加了三个终止子以及与提供附加功能的通用引物互补的四个区域。此外，在质粒组装过程中，我们偶然获得了缺乏多克隆位点的祖先质粒（anc）pUdOanc-a和pUdOanc-t（表1 ）。因此，它们的分子量分别为 1193 和 1844 个碱基对，小于其完整对应物 pUdO1a 和 pUdO1t。pUdOanc-a 和 pUdOanc-t 可用于通过等温组装或通过使用桥中的 IIP 型限制位点进行克隆。
我们还评估了复制起点对基因表达的影响。Lac p::GFPsfm2 由 Golden Gate 使用 BsaI 克隆到 pUdO#c 系列中（图 1 D），然后转化到大肠杆菌(DH10B) 中。使用流式细胞术，测量含有以下质粒的菌株的荧光（平均值±标准差）：pUdO1c（130.4±7.8RFU）、pUdO2c（27.1±4.5RFU）、pUdO3c（21.6±1.6RFU）和pUdO4c（13.2±7.8RFU）。 2.1 RFU）（图1E）。这些数据表明，仅根据复制起点的选择就可以将表达水平调节超过10倍。此外，复制起点2、3和4提供了相似的表达水平，这在寻求以几乎相等的摩尔比表达复合物或途径的组分时可能被证明是有用的。
基于 pUdO 的改进型 III 型分泌报告基因
pUdO 中包含强终止子，以促进包含多个顺反子的合成系统的构建，并且来自虚假启动子的转录干扰最小。为了评估 pUdO 的这一特性，我们选择基于转录的分泌活性报告基因 (TSAR) 作为案例研究，它监测人类细菌病原体福氏志贺氏菌中 III 型分泌系统 (T3SS) 的活性。(6)T3SS 是一种注射器形状的蛋白质分泌装置，一群病原菌和共生菌使用它来定殖真核生物。(18)志贺氏菌T3SS是描述最好的之一(19)并且一直是在小鼠肠道中传递抗炎分子的合成生物学方法的焦点。(20,21)
T3SS是志贺氏菌侵入上皮细胞所必需的。 (19)为此，T3SS 在细胞外环境中的关闭状态（非活动）和与质膜接触时的开启状态（活动）之间切换。在开启状态下，T3SS 中心的通道打开，允许释放到宿主细胞细胞质中的底物通过。这些底物改变宿主质膜的性质以有利于志贺氏菌的摄取，从而形成含有志贺氏菌的液泡。在该隔室中几分钟后，T3SS 诱导其破裂，将志贺氏菌释放到细胞质中，并在细胞质中进行复制，并且其 T3SS 被关闭。(22,23)
当 T3SS“开启”时，包括ipaH7.8在内的一组基因的转录会受到转录激活剂 MxiE 的强烈上调。(24,25)这使得 TSAR 的设计成为可能，它利用了ipaH7.8 ( ipaH7.8p ) 启动子和快速成熟的 GFPsfm2 ( ipaH7.8p :: GFPsfm2 ) 编码序列之间的转录融合。(6)因此，当 T3SS 处于开启状态时，携带ipaH7.8p :: GFPsfm2的 WT志贺氏菌会发出绿色荧光（图 2 A）。相比之下，缺乏 MxiE (Δ mxiE ) 的菌株无论其 T3SS 的激活状态如何，都不会发出绿色荧光，尽管它能够侵入宿主细胞。此外，TSAR 与组成型表达的rpsM p::荧光蛋白（例如BFP、CFP和RFP）报告基因相结合，该报告基因在所有细菌中都有活性（图 2）A）。这两个顺反子一起可以追踪宿主细胞内单个细菌的 T3SS 活性。(6)

图 2. pTSAR3.#t 识别已激活 T3SS 的细胞内细菌。(A) 描述WT 中ipaH7.8p :: GFPsfm2和rpsMp ::荧光蛋白（例如BFP、CFP或RFP ）活性的示意图，以及当T3SS 不活动（关闭）时（如在细胞外）中的Δ mxiE 环境中，或当 T3SS 活跃时，如与质膜或含有志贺氏菌的液泡接触时。红叉表示ipaH7.8p在给定条件下缺乏活性。(B) 人上皮HeLa细胞与人上皮HeLa细胞共感染实验原理志贺氏菌。pTSAR3.#t 具有可区分的rpsMp ::荧光蛋白被引入 WT（红色）和 Δ mxiE（蓝色）志贺氏菌中，用于共感染 HeLa 细胞（洋红色圆角矩形）。由于rpsMp具有组成型活性，因此它可以跟踪细胞内和细胞外细菌，并根据荧光波长区分 WT 和 Δ mxiE细菌细胞。与质膜接触后，两种菌株都会激活其 T3SS，以通过形成含有志贺氏菌的液泡来诱导其摄取。在此过程中，WT 上调ipaH7.8p ::GFPsfm2，而 Δ mxiE则未能做到这一点。因此，WT 液泡志贺氏菌由于rpsMp（红色）和ipaH7.8p（绿色）发出的荧光重叠而变成黄色，而细胞内 Δ mxiE由于rpsMp（蓝色）发出的荧光和缺乏荧光而始终呈蓝色来自ipaH7.8p。液泡破裂后，T3SS 失活，并且ipaH7.8p :: GFP sfm2在胞质 WT志贺氏菌中逐渐下调（红色的）。值得注意的是，在此使用的实验条件下，GFPsfm2 的基础水平的恢复并未完成。(C–G) 与 WT 和 Δ mxiE S.福氏菌共感染的 Hela 细胞单层显微照片，其中含有指定的 pTSAR3.#t，并用鬼笔环肽-Alexa Fluor 647 复染。叠加中使用的伪彩色在独立的标签中标出。灰度通道。(C) WT pTSAR3.1t (mCerulean) 和 Δ mxiE pTSAR3.4t (mcherry)，(D) 野生型 pTSAR3.4t (mCherry) 和 Δ mxiE pTSAR3.5t (eBFP2)，(E) 野生型 pTSAR3。 5t (eBFP2) 和 Δ mxiE pTSAR3.4t (mCherry)，(F) 野生型 pTSAR3.6t (mScarlet) 和 Δ mxiE pTSAR3.5t (eBFP2)，以及 (G) 野生型 pTSAR3.7t (e2Crimson) 和Δ分别为mxiE pTSAR3.5t (eBFP2)。T3SS 处于活动状态（开启）的胞内细菌用空箭头表示；T3SS 不活跃（关闭）的胞内细菌用箭头表示；T3SS 不活跃（关闭）的胞外细菌用实心箭头表示。

在这里，我们通过从 pTSAR1ud2.4s插入ipaH7.8 :: GFPsfm2和rpsMp :: mCherry衍生出新一代 pTSAR 质粒(6)和 L3S3P21 终结器(16)进入 pUdO1a 主链，产生 pTSAR3.4t。从该质粒中，我们衍生出 pTSAR3.1t (mCerulean)、3.3t (DsRed T3 S4T)、3.5t (eBFP2)、3.6t (mScarlet) 和 3.7t (E2-Crimson)（表 2）。选择这些荧光蛋白是因为它们涵盖了广泛的激发和发射波长(26−30)并可与GFPsfm2结合使用。为了确认 pTSAR3.#t 保留了原始 T3SS 调节的胞内细菌特异性表达，将 HeLa 细胞与携带不同 pTSAR3.#t 的WT 和 Δ mxiE细胞共感染，这使我们能够通过荧光显微镜区分这些菌株（图 2 B） ）。与之前的发现一致，(6)当位于上皮细胞内时，野生型而非 Δ mxiE在感染后 60 分钟显示 GFP 荧光（图 2 C-G），而在细胞外 WT 细菌中未观察到 GFP 信号。这些观察结果表明，正如第一代 pTSAR 所报告的那样，携带 pTSAR3.#t 的志贺氏菌侵入培养细胞后，TSAR 信号是稳健的。

应该指出的是，几种 pTSAR3.#t 组成型产生的荧光蛋白可以通过配备适当激光器和滤光片组的流式细胞仪进行监测。然而，pTSAR3.3t 及其前身 pTSAR1.3 非常适合此应用，因为它们产生 DsRed（图 3 A），其荧光可由大多数流式细胞仪测量。因此，为了比较 pTSAR3.3t 和 pTSAR1.3 的性能，我们使用流式细胞术测量了Δ mxiE和 Δ ipaD中ipaH7.8p :: GFPsfm2和rpsM p:: DsRed各自的中值荧光强度，其中先前已显示在体​​外发射最小和最大的 TSAR 荧光。(6)正如预期的那样，在 Δ mxiE中观察到最小的 TSAR 信号，而在 Δ ipaD中，MxiE 是组成型活性的，(19)在含有 pTSAR1.3 (49.5 ± 4.9 RFU) 或 pTSAR3.3t (188.3 ± 5.7 RFU) 的细胞中观察到强烈的 TSAR 信号，信噪比分别增加了 165 倍和 471 倍 (Δ ipaD /Δ mxiE）（图 3B和S2）。之前，我们观察到当 TSAR 活跃时，位于 TSAR 下游的 DsRed 表达出现人为增加。(6)事实上，pTSAR1.3 在 Δ ipaD (19.1 ± 0.5 RFU)中产生的 DsRed几乎是 Δ mxiE (10.7 ± 0.9) 中的两倍，而携带 pTSAR3.3t 的相同菌株产生了类似的荧光（17.9 ± 1.7 至 19.5 ± 2.3，分别）（图3B和S2）。总之，pTSAR3.3t 比其前身 pTSAR1.3 提供了更高的 TSAR 信噪比和更一致的 DsRed 表达。pTSAR3.3t 中包含更强的终止子可能解释了rpsMp::DsRed与ipaH7.8p::GFPsfm2之间绝缘性的增强。pTSAR3.3t 增强的 GFP 信号可能源于至少两个因素。首先，pTSAR3.3t中使用的GFP的Shine Dalgarno效率更高。(6)其次，添加更强的终止子可能会导致更短的 3'UTR，从而通过防止停滞核糖体触发的衰变机制来稳定 mRNA。(31)最后，值得注意的是，这些质粒的两个顺反子各自的方向不同（图3A）。这以及两个构建体组装中的其他变化也可能有助于提高 pTSAR3.3t 的性能。

图 3. pTSAR3.3t 以更高的灵敏度测量 III 型分泌系统活性，而不影响 DsRed 的组成型表达。(A) pTSAR1.3 和 pTSAR3.3t 的图谱。(B) 通过流式细胞术测量携带 pTSAR1.3 或 pTSAR3.3t 的 Δ mxiE和 Δ ipaD S. 福氏中的 GFPsfm2 和 DsRed 荧光信号。显示了中值 RFU ± 1 个标准差（误差线）。通过执行单向方差分析和 Tukey 多重比较测试来测试统计显着性（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）；N = 3。

虽然 pTSAR3.3t 可用于显微镜检查，但不推荐使用，因为 DsRed 的发射光谱与 GFPsfm2 的发射光谱重叠。因此，其他 pTSAR3.#t 是显微镜应用的首选。因此，我们接下来使用其前身 pTSAR1ud2.4s 作为基准检查了 pTSAR3.4t 在共焦显微镜中的性能（图 4 A）。我们用携带 pTSAR1ud2.4s 或 pTSAR3.4t的野生型福氏链球菌感染 HeLa 细胞（图 4B）。为了比较它们的性能，我们测量了大约 200 个细菌的 mCherry 和 GFP 荧光信号的像素强度，一式三份，并将它们分为低（T3SS“关”）和高（T3SS“开”）两个亚群。在高 GFP 亚群中，我们在 pTSAR3.4t 中观察到更高的 GFP 信号（增加 1.6 倍），表明它可以以更高的灵敏度检测 T3SS 的活性（图 4 C，上图）。由于后者及其前身 pTSAR1ud2.4s 对 GFP 使用相同的 Shine-Dalgarno，这表明终止子是使 pTSAR3.4t 更亮的关键元素。测试pTSAR3.4t是否改善了rpsMp :: mCherry与ipaH7.8p的绝缘性，我们比较了两个亚群中rpsMp :: mCherry的平均荧光。与 pTSAR3.3t 在流式细胞术中获得的结果相比，pTSAR3.4.t 在该指标中的性能与其前身 pTSAR1ud2.4s 相比没有任何改进（图 4 C，下图）。这种差异可能源于 pTSAR 1.3 和 pTSAR1ud2.4s 构建的差异（图 3 A 和4 A），(6)来自实验设置，或两者兼而有之。在流式细胞术实验中，我们研究了比显微镜实验中更均匀的志贺氏菌群体。事实上，Δ ipaD是一种组成型分泌菌株，表现出均匀的高 TSAR 信号，而 Δ mxiE缺乏激活 GFP 表达所需的转录激活剂，表现出均匀的低 TSAR 信号。相比之下，显微镜实验中使用的 WT 菌株形成异质群体，因为细菌在感染人类单层细胞期间不同步。因此，个体细菌可能会根据它们之前激活 T3SS 后经过的时间显示出不同水平的荧光。(6)尽管如此，pTSAR3.#t 系列的结构比原始系统更好，性能也更好。展望未来，改进的 pTSAR3.#t 系列应用于监测志贺氏菌中 T3SS 的活性。

图 4. pTSAR3.4t 通过荧光显微镜以更高的灵敏度测量 III 型分泌系统活性。(A) pTSAR1ud2.4s 和 pTSAR3.4t 的图谱。(B) 被携带 pTSAR1ud2.4s 或 pTSAR3.4t 的野生型 (WT)福氏链霉菌感染的 HeLa 细胞单层的显微照片。箭头指向具有高 GFP 表达的细菌。(C) 具有低 GFPsfm2 平均荧光像素强度（<平均值 + 标准差）和高 GFPsfm2 平均荧光像素强度（>平均值 + 标准差）的细菌细胞亚群中 GFPsfm2 和 mCherry 荧光的定量。通过执行单向方差分析和 Tukey 多重比较测试来测试统计显着性 (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; ****p < 0.0001); N = 3。

pUdOm：用于在哺乳动物细胞中表达的 pUdO
为了扩展 pUdO 的实用性，我们通过在多克隆位点侧翼添加哺乳动物特异性转录启动子和终止子，从原始 pUdO 主链衍生出一组 16 个哺乳动物表达载体 (pUdOm#.#)（图 5和表3） 。对于启动子，我们选择了已充分表征的巨细胞病毒 (CMV) 启动子和增强子序列，该序列可在多种哺乳动物细胞系中产生稳定的表达。(32−34)将巨细胞病毒启动子-增强子序列插入原始 pUdO 多克隆位点的上游（图 5 A）。为了扩大 pUdOms 表达的动态范围，我们制作了几个额外的质粒，并对 CMV 启动子/增强子序列进行了截短（图 5 A 和表 3）。(35−38)最后，为了终止转录，我们在多克隆位点下游插入牛生长激素 (BGH; pUdOm#odd.#) 或猿猴病毒 40 (SV40; pUdOm#even.#) 多腺苷酸化信号（图 5 A） 。这两个已建立的转录终止子用于多种哺乳动物表达载体，(39,40)与流行的 pcDNA3.1 中使用的 BGH 终止子一起。请注意，pUdOm#.1 或 pUdOm#.2 不包含 5'UTR，因此用户可以插入自己选择的其中之一。为了方便起见，我们还提供了 pUdOm1.0 和 pUdOm2.0，它们在多克隆位点上游携带 5'UTR 和 SP6 通用引物（表 3）。

图 5. 哺乳动物 pUdO 质粒与传统哺乳动物表达载体相当。(A) 源自 pUdO1a（氨苄青霉素）、pUdO1c（氯霉素）、pUdO1t（甲氧苄啶）和 pUdO1z（博莱霉素）的 pUdOms 总图（表 2）。通过截短 CMV 增强子（浅灰色）和启动子（深灰色），氨苄青霉素抗性 pUdOm 进一步扩展。显示了截短构建体的 CMV 增强子和启动子的长度。最后，质粒含有多克隆位点（MCS；蓝色）和 BGH（绿色）或 SV40（紫色）终止子。方框插图：pcDNA3.1 与最长 (pUdOm1.1) 和最短 (pUdOm6.1) pUdOm 质粒的碱基对大小。(B)用所示的含有萤火虫荧光素酶的pUdOm转染HEK293细胞。转染后 24 小时测量发光（N = 4 或 5)。发光(RLU) 被归一化为pcDNA3.1 的发光。通过执行单向方差分析和 Tukey 多重比较检验计算显着性值（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001），并显示在图 S3中。(C) 高表达 pUdO 质粒与 pcDNA3.1 具有相同的转染效率。通过将 GFP 阳性细胞数除以计数细胞总数来计算转染百分比。条形图是（点； N）的平均值±一个标准差（误差条）= 3 次转染，每个样品最多计数 10,000 个细胞）。通过执行单向方差分析和 Tukey 多重比较测试来测试统计显着性（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）；N = 3。 (D) 单通道膜片钳记录显示 pUdOm2.1 质粒（右）表达的胎儿（γ 亚基；顶部）和成人（ε 亚基；底部）乙酰胆碱受体与 pRBG4 表达的通道无法区分（左边）。比例尺为 25 ms 和 5 pA。

为了量化 pUdOm 在哺乳动物细胞中表达蛋白质的能力，我们将萤火虫荧光素酶克隆到每个 pUdOm 中，然后将它们瞬时转染到 HEK293 细胞中并测量荧光素酶活性（图 5 B）。两个最长的（pUdOm#.1 vs pUdOm#.2）和两个最短的（pUdOm#.4 vs pUdOm#.5）CMV 启动子之间的荧光素酶活性和表达没有显着差异（图5B和S3）。因此，我们将 pUdOm#.1 和 pUdOm#.2 称为“高表达”层，将 pUdOm#.4 和 pUdOm#.5 称为“低表达”层，而 pUdOm#.3 构成“中表达”层。表达”层。每个表达层之间存在大约 5 至 7 倍的变化，高表达质粒（pUdOm#.1 或 pUdOm#.2）的表达水平与 pcDNA3.1 和 pcDNA3.0 无法区分。跨终止子（pUdOm1.# 与 pUdOm2.#）但在同一表达层内的比较表明，终止子不会影响表达水平（补充图 S3）。最后，当选择不同的 pUdO（即 pUdO1c、pUdO1t 和 pUdO1z）作为 pUdOm 主干（即 pUdOm3.1、4.1、5.1、6.1、7.1 和 8.1）时，总体表达水平几乎没有变化，表明抗生素抗性基因对表达有边际效应。
为了比较转染效率，我们使用流式细胞术确定 pUdOm1.1 和对照 pcDNA3.1 表达 GFP 的细胞百分比（图 5 C）。我们发现pUdOm1.1的转染效率与常用的pcDNA3.1没有区别。此外，用 SV40 终止子替换 BGH 终止子（pUdOm1.1 与 pUdOm2.1）不会影响转染效率（图 5）C）。为了确保pUdOms能够有效替代传统的表达载体，我们将人类肌肉型乙酰胆碱受体的α-、β-、δ-、ε-和γ-亚基克隆到pUdO1m2.1主链中用于单通道膜片钳实验。pUdOm2.1 主链包含与 pRBG4 相同的 CMV 启动子和 SV40 终止子，pRBG4 是广泛用于人类肌肉型乙酰胆碱受体膜片钳研究的载体。(41)我们发现，从 pUdOm2.1 主干表达的成人（含 ε）和胎儿（含 γ）人乙酰胆碱受体的单通道行为与 pRBG4 表达的乙酰胆碱受体没有区别（图 5 D），这表明 pUdOms 可以有效替代标准哺乳动物表达载体。

结论
我们报道了一系列简洁质粒的设计和应用，并证明了它们在大肠杆菌、福氏链球菌、哺乳动物细胞系以及铜绿假单胞菌中的实用性。(42)它们的微型尺寸、强终止子的使用以及使用传统或金门克隆插入感兴趣的遗传物质的能力将使 pUdO 在分子、合成和细胞生物学中的众多应用中具有优势。pUdO 的设计具有灵活性，可以轻松生成用于其他模型生物或底盘的衍生物。