一、简介

伊氏锥虫是委内瑞拉稀树草原马科动物锥虫病的病原体。马科动物，特别是马，被广泛用于粗放的养牛业，因此马的健康是牛生产的一个重要因素。

虽然对当地伊氏锥虫分离株引起的感染的超微病理学有一些了解 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]，但应该指出的是，重要的遗传 [ 5 ] 和寄生虫学 [ 6 ] 变异性虽然已经在不同品系的行为中得到了证明[ 6 ]，但对其对脾脏的影响一无所知，更不用说关于马源的两种品系对该器官的比较作用了。

脾脏是插入血流中的淋巴器官，具有三个主要功能：吞噬血流中的红细胞和细胞碎片（当需要红细胞时产生造血灶）；供应淋巴细胞、浆细胞以及细胞和体液特异性免疫防御的抗体；排出所含血液以满足增加的循环需求的能力[ 7 ]。因此，研究原型血液锥虫对该器官的影响对于了解伊氏锥虫的生物学具有重大贡献。

为了证明伊氏锥虫应激下脾脏的连续超微结构改变并比较评估诱导的亚细胞变化，我们用两种本地伊氏锥虫马品系建立了实验性小鼠感染，一种来自Equusasinus，另一种来自E. caballus。

2。材料和方法

2.1. 从 E. asinus、E. cabalus 中获取伊氏锥鞭毛体

T. evansi 锥鞭毛体来源于“Terecay”养牛场（委内瑞拉，瓜里科州，卡拉博索市）自然感染的 E. asinus 和来自“Mantecal”镇（委内瑞拉，阿普雷州，曼特卡尔市）自然感染的 E. caballus 的稳定化免疫抑制的 Balb/C 小鼠 [ 8 ]，与红细胞分离 [ 9 ] 并保存在液体 N 2 ‎[ 10 ] 中直至使用。

2.2. 寄生虫接种和对照组

实验设计由三组组成，每组 10 只小鼠（NMRI 雌性，体重 20 克）： 第 1 组，皮内感染从 E. asinus 获得的伊氏锥虫的小鼠。第 2 组，小鼠皮内感染来自 E. caballus 的伊氏锥虫。第3组，对照小鼠（皮内接种盐水溶液）。第 1 组和第 2 组小鼠被悬浮在 0.1 ml 0.02 M + 1% 葡萄糖磷酸盐溶液，pH 7.0 (GSPB) 中的 20 只锥鞭毛体感染。

2.3. 寄生虫血症、血细胞比容和手术脾脏消融

从感染后第三天、日间和感染后开始，每组各选择一只小鼠（感染E. asinus株的小鼠、感染E. cabalus株的小鼠、接种生理盐水的小鼠。对照组）。

为了对寄生虫进行计数，我们使用具有 Neubauer 规则的血细胞计数器计数室和连续 GSPB 稀释液以获得所需的浓度。另外，记录这些小鼠的血细胞比容。为了收集脾组织样本，小鼠在麻醉作用下死亡。通过乙醚气氛手术消融，取出脾脏并系统地切成2mm 3 的部分。

2.4. 电子显微镜技术

将脾碎片用卡诺夫斯基溶液（Millonig缓冲液中的2.5%戊二醛、37%甲醛；pH 7.4，320 mOsm）固定，在Millonig缓冲液中洗涤，在1%四氧化锇溶液中后固定（相同的缓冲液、pH和渗透压），浸没在蒸馏水中并在浓度递增的乙醇系列中脱水（50% - 100%）。不久之后，这些碎片被环氧丙烷渗透并包含在环氧树脂中[ 11 ]。使用电子显微镜（CM-10；飞利浦，荷兰）观察对比的[ 12 ][ 13 ]超薄切片（60-80 nm）。

2.5. 超微结构定量分析和统计分析

对获得的显微照片进行数字化、定性分析和定量研究。以网状脾细胞(RS)为对象，利用ImageJ软件计算50个细胞的胞质面积(CA)和核面积(NA)。为了从定量的多变量范围来看待问题，还计算了长核轴和短核轴的长度、线粒体面积以及核面积/细胞质面积比（数据未显示）。

在证实正态性和方差齐性的假设后，使用STATISTICA V.8.0软件通过方差分析（ANOVA）[ 14 ]、简单线性回归（SLR）[ 14 ]对获得的数值数据进行定量处理和对应分析（COA）[ 15 ]，采用MVSP V.2.1软件。该图形以标准误差图的形式呈现，COA 以连续的点云形式呈现。所有测试均在 p < 0.05 时完成。用不同批次的小鼠和寄生虫重复实验三次。该调查符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南（NIH 出版物第 85-23 号，1985 年修订）中规定的规范。

3。结果与讨论

由于寄生虫血症（P）和血细胞比容（H）是评估哺乳动物一般健康状况的相关指标，我们的第一个方法是通过这些变量。

定量分析表明 P 存在显着差异，具体取决于伊氏锥虫起源（即 E. asinus 或 E. caballus）（p = 0.00）、时间（p = 0.00）和菌株起源-时间相互作用（p = 0.00）。在其他方面，F值的测试表明与应变起源（p = 0.00）、时间（p = 0.00）和应变起源-时间相互作用（p = 0.00）相关的显着差异

另外，感染马源菌株的小鼠脾脏恶化的最早指标是通过感染后第 3 天的电子致密细胞质来定义的（图 1）。

一般来说，脾脏超微结构的性质变化是进行性的，其特征是高水平的组织解体和纤维化，表现为细胞凋亡、坏死细胞和细胞破坏（包括RS）。变化的亚细胞特征包括固缩和不规则的细胞核、深染、改变和/或外围染色质、电子致密细胞质、肿胀的线粒体、扩张的高尔基体池、自噬体和凋亡小体。

在分别感染了从 E. asinus 和 E. caballus 获得的菌株的小鼠中，从第 9 天和第 7 天开始，在脾脏中就发现了锥虫，而在感染了驴菌株的小鼠中，从第 7 天开始，从第 3 天开始，亚细胞异常就很明显了。接种来自马的寄生虫的动物。

显微记录清楚地表明了这些变化和锥鞭毛体的存在。事实上，从感染后第 7 天起，接种驴品系的动物的脾脏就显示出最初的损伤迹象，其特征是巨噬细胞表现出电子透明的细胞质和肿胀的线粒体（图 2）。

随着实验感染的进展，寄生虫出现在脾脏中。从用马源菌株接种的动物的脾脏中感染后第7天开始，以及从从E. asinus获得的菌株感染后第9天开始，锥虫就很明显（图3）。

寄生虫的超微结构形态没有明显的特殊迹象，这是由通常可识别的哺乳动物的锥虫特征定义的。

感染的最后阶段以明显的组织解体和深层亚细胞变化为特征。由来自 E. asinus 的寄生虫引发的感染的特征是在紊乱的组织中含有凋亡细胞，而由源自 E. caballus 的锥虫引发的感染则表现为普遍的空泡化以及高度的细胞破坏。

RS超微结构的定量分析显示了变化。细胞质区域显示出明显的显着改变。方差分析表明，细胞质区域中观察到的差异是由于分离株来源 (p = 0.00)、时间 (p = 0.00) 和相互作用分离株的来源时间 (p = 0.00)（表 1）。此外，SLR 表明感染来自 E. caballus 的伊氏锥虫的小鼠的变化速度比接种 E. asinus 的小鼠更快

这种说法得到了所提出的线性模型的高可预测性的证实，因为 E. asinus 和 E. caballus 的回归系数 (r) 分别为 -0.9200 和 -0.9653。这些回归系数又与对照的回归系数不同，对照的回归系数一致为-0.9071（表2）。

在其他方面，可变核区域的行为表现出重要的变化，具体取决于寄生虫的来源、时间和隔离源-时间相互作用。方差分析确定与观察到的差异相关的概率水平对于隔离源为 p = 0.00，对于时间为 p = 0.00，对于隔离源与时间的相互作用为 p = 0.00；高 F 值，特别是分离源的 F 值，进一步强调了这些差异（表 1）。分析还证明了每种寄生虫分离株变化的显着性以及核区域变化的线性，感染来自 E. caballus 的伊氏锥虫分离株的动物比感染来自 E. asinus 的伊氏锥虫分离株的动物的核区域变化更快（表 2）。上述陈述得到了线性模型的高预测性水平的证实，因为 E. asinus 和 E. caballus 衍生分离株的回归系数 (r) 分别为 -0.9968 和 -0.9943；控件的行为完全不同（表 2）。

RS 细胞质和核区域的比较分析表明，与对照组相比，细胞面积显着减少。统计特征显示，感染来自卡巴鲁斯寄生虫的小鼠的脾脏改变更为严重。

对应分析 (COA) 是一种描述性/探索性多变量技术，用于以图形方式分析一组分类变量中的依赖/独立关系。该模型具有对应于的点云

原始超空间中变量的数值大小被缩小并绘制在新的缩小的二维空间中。重叠的云象征着同一性，而分开的云则象征着差异；云越接近或分开，它们所代表的过程就越相似或不同。此外，特定云的不间断连接被解释为所代表现象的连续性。该过程能够将原始八变量超空间（包括细胞核面积/细胞质面积比）压缩为包含两个轴的笛卡尔坐标图。结果最终显示了时间上的显着变化，并清楚地界定了实验组和对照组之间的区别。由于点云表现出某种并行行为，因此实验组中的变化序列趋势在感染初始阶段相对相似。另一方面，后期阶段明显不同。根据云的形式及其在平面上的分布，可以说这两种趋势与对照组不同且非常不同。COA 模型无疑区分了感染来自 E. asinus 或 E. caballus 的伊氏锥虫的小鼠与对照小鼠之间的变化特征（根据云的形式及其在平面上的分布，可以说这两种趋势与对照组不同且非常不同。COA 模型无疑区分了感染来自 E. asinus 或 E. caballus 的伊氏锥虫的小鼠与对照小鼠之间的变化特征（根据云的形式及其在平面上的分布，可以说这两种趋势与对照组不同且非常不同。COA 模型无疑区分了感染来自 E. asinus 或 E. caballus 的伊氏锥虫的小鼠与对照小鼠之间的变化特征（图5）。

宿主与寄生虫的关系是一个复杂的相互作用系统，通过生化、生理、寄生虫学和生态适应等多种特征变得明显，并辅以各种适应机制，使寄生虫能够逃避宿主的免疫反应。

伊氏锥虫感染表现出不同的解剖病理学症状，包括脾肿大 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20]。在这方面，我们的结果证明了脾超微结构的改变导致了不同的寄生虫学表达，具体取决于伊氏锥虫来源（E. asinus 或 E. caballus）。方差分析证实了曲线轮廓提供的寄生相异性想法。此外，方差分析还定量证实了血细胞比容曲线中显示的差异。根据感染源的不同，健康指标（寄生虫血症和血细胞比容）表现出不同的行为。这可能表明锥虫的来源（就适应而言）与其成功定殖和利用新宿主的能力之间存在关系。

除了寄生虫通过特定蛋白水解分泌物的可能能力发挥作用之外，脾脏的变化也可能与伊氏锥虫引起的肝脏改变有关[ 3 ]，因为肝脏恶化可以升高门静脉压力。事实上，晚期肝肿大会增加门静脉流量，并使血液可以通过门静脉和静脉静脉流经侧支系统[ 22 ]。门脉通量增量由内脏组织（胃、肠、胰腺和脾）的血管舒张决定，这反过来又允许流向这些器官的血流量增加[ 23 ]。

显微照相结果还显示脾内锥虫。在缺乏确凿证据的情况下，由于伊氏锥虫是一种典型的单形血液锥虫，我们认为脾脏中寄生虫的存在是循环锥鞭毛体的结果，由血液循环本身驱动进入脾实质。

损伤的第一个定性透射电子显微镜指示是存在大量脾脏碎片。这种残留物的存在可能是由于受感染的脾脏中发生的红细胞吞噬作用和细胞碎片吞噬作用所致。寄生虫诱导的病理过程的发生可以通过将观察到的超微结构变化和 RS 定量变化与对照组中观察到的变化进行比较来证明。然而，个体超微结构修饰不能通过特定特征来区分。观察到的变化出现的经过时间和过程本身的速度的差异（以 SLR 直线的斜率表示）可能表明寄生虫的内在差异，因为其他作者 [ 24]] 已经确定伊氏锥虫群体之间的形态对比能够表达特定的生化、生理和/或病理行为。SLR 模型提供的细胞质和核 RS 区域变化方程的差异表达表明了所描述现象的差异。

RS的定量分析还揭示了研究变量变化过程中的细微差异。ANOVA 和 SLR 分析表明，不同寄生虫来源（驴或马）的变异来源和实验感染持续时间存在差异。之前我们已经证明了[ 25 ]伊氏锥鞭毛体的维数与实验感染这些菌株的小鼠的一些血液学属性之间的定量关系。

4。结论

综上所述，我们可以说，源自 E. asinus 和 E. caballus 的当地伊氏锥虫引起的病理过程的定性和定量表达在 RS 变化速度上通过特定的趋势模式有所不同，特别是在超微结构特征上在感染晚期阶段。结果表明，不同的锥虫来源具有不同的致病性。COA 展示了一系列变化，并根据锥虫来源（E. asinus 或 E. caballus）提供了不同病理行为的证据。最后，对结果的分析表明，不同的局部伊氏锥虫菌株引起的各种脾超微结构改变的诱导，以及与卡巴勒斯锥虫寄生虫一致相关的更大应激。