介绍
深部皮肤外伤，如物理损伤、烧伤或手术后，伤口可发生过度愈合反应，释放促纤维化因子和炎症因子，导致成纤维细胞
过度增殖和过度沉积和降解，一到三个月后细胞外基质（ECM），诱导增生性疤痕（HS）1呈红色或紫红色，形状不规则，
突出于皮肤表面，常伴有不同程度的瘙痒和神经痛2。严重的热射病不仅影响患者的外观，还会导致功能障碍，给患者的生
活带来不利影响3。

HS 的治疗取决于身体部位和疤痕挛缩的严重程度4。目前，可用的治疗方式包括口服药物、局部和病灶内类固醇的应用、
休息/固定疗法、压迫疗法、间充质干细胞疗法、冷冻疗法、激光疗法、放射疗法、脂肪移植、手术切除等，每种疗法都有
不同的特点。成功程度1,4,5。皮肤纤维化引起的HS的治疗是一个复杂的过程，发病机制尚不完全清楚6。迄今为止，还没
有药物被批准作为纤维化的完全抑制剂7，但一些药物如紫草素（SHI）已被用于治疗皮肤纤维化。它是一种从传统药用植
物中分离出来的萘醌，如图 1 和 1 所示。1a 和 1b，由于其抗炎、抗促性腺激素和抗肿瘤特性，历史上一直用于治疗麻
疹、喉咙痛和烧伤8,9。多项研究的数据提供了证据支持 SHI 作为增生性疤痕新疗法的潜在用途10,11。

自噬是一种高度保守的细胞过程，在许多生理和疾病过程中发挥着重要作用，并由饥饿和缺氧等各种应激源诱导12。研究
表明，与正常皮肤组织相比，疤痕组织中轻链3（LC3）、Beclin1和蛋白水平下调，自噬能力降低可能与HS发病有关13。因
此，自噬与疤痕的形成和发展密切相关。研究表明，SHI 在 BXPC-3 人胰腺癌细胞等临床条件下诱导自噬14和人黑色素瘤
A375细胞15，但SHI诱导的疤痕成纤维细胞自噬尚未见报道。

本研究通过考察不同浓度的SHI对人增殖性疤痕成纤维细胞活性的影响及自噬体活性的变化,进一步探讨SHI诱导的自噬对人
增殖性疤痕成纤维细胞表达的调控作用及分子机制。分析，为SHI治疗人类增生性疤痕奠定新的理论基础。

方法
细胞培养
肥厚性疤痕源性成纤维细胞（HSF）分离自三名不同的参与者（病因：烧伤；年龄：20至44岁），HS出现至少六个月，并在
宁夏总医院烧伤外科接受过疤痕切除术医科大学（中国银川），并提供知情同意书。简而言之，将收集的组织样本用磷酸
盐缓冲溶液（PBS）在室温下洗涤30分钟并切成小片。然后，分别用 0.05% 胰蛋白酶（Gibco, Grand Island, NY, United
States of America）和 0.1% I 型胶原酶（Gibco, Grand Island, NY, United States of America）在 37°C 下消化 2
小时。来自消化的组织样品的细胞通过 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM，Gibco，Grand Island，NY，2和 37°C。
培养的细胞在第四代和第七代之间用于进一步研究16。

天狼星红染色
提取物SHI粉由中国药品生物制品检定所生产。天狼星红 (SR) 染色用于分析细胞中的胶原蛋白。将细胞接种于48孔板中，
用10%FBS培养基培养24小时，然后加入2、1.75、1.5和1.25μM SHI。24小时后，将0.1％v/v SR（Solarbio，北京，中国
）加入孔中90分钟，然后用CKX53倒置显微镜（Olympus，东京，日本）带摄像头拍摄图像17 号。

细胞活力测定
使用阿拉玛蓝 (AB) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States) 检测细胞活力，观察 SHI 引起的 HSF 的活力。
然后对 HSF 活力的变化进行量化，并在 Infinite 200 Pro 酶标仪（Tecan，Mannedorf，瑞士）中在 λex 560 nm 和 λ
em 590 nm 处测定花期16。使用方程式计算存活率百分比。

透射电子显微镜
用1.75 μM SHI处理细胞12或24小时，然后收集在无血清培养基（SFM）中作为对照组。细胞用2.5%戊二醛（Solarbio，北
京，中国）固定2小时，并用1%四氧化锇（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）处理2小时。然后，通过一系列梯
度乙醇脱水并在60°C聚合48小时后，将样品嵌入环氧树脂（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，美国）。使用 EM UC7 超薄
切片机（Leica，Solms，德国）将样品切成 60 至 80 nm 的超薄切片，并用 2% 乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。使用
HT7700 TEM（日本东京日立）获取图像。

LC-MS/MS 无标记定量蛋白质组学和生物信息学分析
收集经SHI处理24小时的HSF和未处理的HSF以制备全细胞裂解物。使用二辛可宁酸 (BCA) 试剂盒（ThermoFisher,
Wilmington, DE, United States of America）测量蛋白质浓度。将二硫苏糖醇 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
United States of America) 和碘乙酰胺 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States of America) 添加到蛋白质
溶液中，并在室温下避光孵育 15 小时。分钟，然后与胰蛋白酶一起孵育过夜。使用 5 μM 颗粒、内径 4.6 mm、长度
250 mm 的 300Extend C18 柱（Agilent, Santa Clara, CA, United States of America）通过高 pH 反相高效液相色谱
(HPLC) 对胰蛋白酶肽进行分级。将胰蛋白酶肽溶解在 0.1% 甲酸中（溶剂 A，Fluka，Buchs，瑞士）并使用 98% 乙腈中
的 0.1% 甲酸进行分离（溶剂 B，ThermoFisher, Wilmington, DE, United States of America）。所产生的梯度为6至22
％溶剂B 0至40分钟，22至35％溶剂B 40至52分钟，35至80％溶剂B 52至56分钟和80％溶剂B 56至60分钟。 EASY-nLC 1000
UPLC 系统（ThermoFisher, Wilmington, DE, United States of America）上的流速为 700 nL/分钟。

质谱分析在 Orbitrap FusionTM lumos (ThermoFisher, Wilmington, DE, United States of America) 上进行。初级MS
的扫描范围为350至1,550 m/z，扫描分辨率为60,000。二次扫描分辨率为15,000，通过Maxquant搜索引擎（v 1.5.2.8）检
索数据。将差异蛋白信息上传至UniProt-GOA数据库（https://www.ebi.ac.uk/GOA），以丰富和分析差异表达蛋白的基因
本体（GO）功能。

增生性疤痕来源的成纤维细胞的自噬测定
96孔板的每个孔在10％FBS中接种10,000至20,000个细胞24小时，然后用溶解有甲基亚砜的1.75μM SHI（DMSO，Sigma-
Aldrich，St.Louis，MO，United States of America）处理24小时，DMSO和SFM作为对照组。收集三名患者的细胞数据，
实验重复三次。使用 MAK138-1KT 自噬测定试剂盒（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）测量 HSF 的自噬体。

通过具有 DAPI 通道的显微镜系统（Echo Laboratories，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）对细胞进行成像，并使用
Tecan Austria GmbH Infinite M200 PRO 酶标仪测量 360 和 520 nm 处的荧光吸光度。

使用Image J软件（NIH，Bethesda，MD，美国）自动识别和定量细胞中的自噬体，并通过GraphPad Prism版本7（GraphPad
Software，波士顿，马萨诸塞州，美国）比较不同组之间的自噬水平。统计分析使用单因素方差分析 (ANOVA) 和学生 t
检验。

蛋白质印迹分析
通过蛋白质提取试剂盒（KeyGEN，南京，中国）裂解细胞。采用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。通过SDS凝胶电泳分离蛋白质
并转移至聚偏二氟乙烯膜上2.5小时。膜用5%脱脂牛奶室温封闭1小时。将膜与兔单克隆抗人 LC3 (Santa Cruz
Biotechnology, Dallas, TX, United States of America)、P62 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)、
Beclin1 (Proteintech, Manchester,英国）、AMP 激活蛋白激酶 (AMPK) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA,
United States of America)、p-AMPK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
(mTOR)（圣克鲁斯生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州，美利坚合众国），

使用增强型化学发光试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）目视检测蛋白质。

RNA提取和实时定量聚合酶链式反应
通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）观察SHI处理的HSF基因表达的变化，并以氯喹（CQ，Sigma-Aldrich，St. Louis，
MO，United States of America）作为对照组。24小时后，从细胞中提取总RNA。使用NanoDrop2000分光光度计(Thermo
Fisher, Wilmington, DE, United States of America)测量RNA浓度，并将RNA反转录成cDNA，然后进行qRT-PCR。PCR热循
环条件为95℃30秒，95℃15秒，60℃30秒，40圈18。

为了量化 LC3 I/II、AMPK 和 ULK 的基因表达，通过 2 -ΔΔCt方法分析相对表达并标准化为 GAPDH。每个样品至少分析
三次。

免疫组织化学
猪全层烧伤增生性疤痕模型的建立如前所述11。将猪随机分为两组，作为仅注射生理盐水的正常对照组和仅注射SHI的SHI
组。在第0周、第1周、第2周、第4周和第8周收集经盐水溶液和SHI处理的猪的HS，并用福尔马林固定用于免疫组化。干燥
、脱蜡和复水后，将组织与 LC3 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, United States of America) 和 P62 (Cell
Signaling Technology, Beverly, MA, United States of America) 在 4°C 下孵育过夜。

统计分析
使用Prism-GraphPad软件7.0进行统计分析。所有数据均表示为平均值±平均值标准误差 (SEM)。使用方差分析进行多重比
较，P < 0.05 被认为是显着的，而 P < 0.01 的值被认为是极其显着的。

结果
紫草素对增生性疤痕成纤维细胞的抑制作用
检查了 SHI 对细胞生长能力和细胞胶原蛋白表达的影响。HSF 细胞与 2、1.75、1.5 和 1.25 μM SHI 一起孵育 24 小时
。采用SR法测定细胞中胶原蛋白含量，采用Alamar Blue（AB）法测定细胞活力。如图所示图1c，与对照组相比，随着SHI
浓度的增加，细胞形态变化和胶原代谢减少。如图所示图1d，与对照组相比，SHI以剂量依赖性方式显着抑制HSF细胞的生
长。

紫草素诱导增生性疤痕源性成纤维细胞自噬
通过 TEM 观察 SHI 处理后 HSF 的细胞内自噬体聚集图1e。SHI处理细胞后12和24小时，与对照组相比，自噬体累积增加
，并且出现超微结构变化。SHI处理24小时的HSF细胞中自噬量高于12小时。12小时时，SHI处理的HSF细胞出现明显水肿且
变圆。细胞伪足退化，细胞核增大，核仁轻微移位。细胞线粒体丰富，出现肿胀，膜内基质变轻，个体内质网应激闭合成
环形成自噬，自噬溶酶体（ASS）大量存在。对照组细胞整体结构正常，细胞膜完整，存在少量ASS。24小时时，SHI处理后
的HSF细胞明显收缩并呈现凋亡趋势，细胞器明显增多、肿胀、聚集。线粒体丰富，稍肿胀，嵴断裂、缩小，ASS大量存在
。对照组细胞整体轻度水肿，ASS数量较少。

通过自噬检测试剂盒测量 SHI 诱导的自噬相关的自噬体变化，该试剂盒为测量 HSF 中的自噬提供了简单直接的程序。如
中所示无花果。1f和1g，24小时后，与对照组相比，SHI处理的HSF中自噬体形成增加（P <0.01）。结果表明，1.75 μM
SHI刺激的HSF中自噬体增加，这表明SHI可以诱导HSF发生自噬。

本研究使用无标记定量蛋白质组分析系统地研究了 HSF 中 SHI 的潜在机制。总共对3,554个蛋白质进行了定量，并通过GO
富集对蛋白质进行了功能分析。结果发现差异蛋白在自噬相关的生物过程中显着富集，如图所示图1h，发现18个与自噬相
关的差异表达蛋白，如图表2，证明SHI诱导的HSF与自噬过程密切相关。

紫草素通过 AMPK/mTOR 信号通路增加肥厚性疤痕衍生成纤维细胞的自噬
进行蛋白质印迹分析以研究自噬相关蛋白的表达水平。如图所示无花果。2a –图2d，SHI处理HSF细胞24小时后，Western
blotting结果显示，与对照组相比，LC3II/I和Beclin1的表达显着增加，P62的表达显着减少，这表明SHI可以诱导HSF发生
自噬。还观察到 SHI 可能通过 AMPK 通道调节自噬。如图所示无花果。2e –如图2i所示，与对照组相比，SHI上调p-AMPK
和mTOR的表达，下调AMPK和p-mTOR的表达。

为了进一步研究SHI诱导自噬的机制，添加CQ来阻止自噬体-溶酶体融合，如图所示无花果。2j和2k。与单独使用SHI相比，
SHI与自噬抑制剂CQ联合显着提高了细胞活性，并且SHI促进自噬对HSF的活性起到了抑制作用。可以清楚地看到添加 SHI
后细胞形态的变化。在用 SHI 处理的细胞中，CQ 阻断了自噬对 HSF 活力的影响，并且与单独用 SHI 处理的细胞相比，
与 SHI 和 CQ 一起作用的细胞高 13.6% ± 0.5% (P < 0.01)。然而，CQ 并没有改变 SHI 处理后细胞的形态。

qRT-PCR结果显示，SHI处理的HSF中自噬相关基因LC3I/II、AMPK和ULK的表达表现出一定的抑制作用。无花果。2l–2n。
SHI治疗组LC3 I/II表达显着低于SHI+CQ组（P < 0.01），SHI组与SFM组间LC3I/II表达无显着性差异。与SHI和SFM组相比
，CQ和SHI处理的细胞中LC3-II的积累减少，但SHI处理的细胞中AMPK和ULK的表达显着降低，CQ处理后显着增加。

猪全层烧伤增生性疤痕模型中蛋白表达
该研究建立了动物疤痕模型来检测 SHI 诱导的自噬。免疫组化结果显示无花果。由图3a~3d可知，抗原含量越高，分布密
度越高，阳性结果颜色越深。与对照组相比，SHI组猪疤痕组织中LC3阳性细胞数量增多，而P62表达减少。治疗第2周后，
SHI组LC3表达量最高（P < 0.05），随后随时间缓慢下降，第7周接近对照组。P62的表达在给药后1周和2周下降，之后缓
慢恢复到正常水平。

讨论
HS的形成主要是由于ECM过度沉积以及HSF的异常增殖和迁移造成的19。ECM 的过度产生是许多纤维化疾病的共同特征，可
能是由活化的淋巴细胞和巨噬细胞的旁分泌信号或成纤维细胞分泌的自分泌因子引起的20,21。为了维持组织稳态，细胞生
存和细胞死亡之间必须保持良好的平衡，也可以认为是自噬和凋亡之间的平衡22。有文章提出疤痕增生和消退可能与成纤
维细胞自噬和细胞凋亡有关23。

自噬被认为是纤维化、组织重塑和 ECM 沉积的重要调节因子24。它通过细胞因子调节成纤维细胞的增殖，降解纤维蛋白并
减少其在 ECM 中的沉积。研究表明，过度自噬刺激成纤维细胞自噬死亡，从而抑制其增殖，改善增殖性疤痕的形成25,26
。其他研究发现疤痕组织中LC3-II和Beclin1的表达水平显着降低13。自噬和疤痕修复是非常复杂的过程，需要从多个角度
探讨其机制。

检测自噬的方法包括荧光显微镜、蛋白质印迹、流式细胞术和电子显微镜27。在本研究中，SHI 用于诱导 HSF 中的自噬。
在电子显微镜下，观察到 SHI 增加了线粒体液泡、细胞器肿胀以及细胞中 ASS 的丰富存在。其他实验结果表明，SHI可诱
导自噬体形成，并存在多种与自噬相关的差异表达蛋白，与饥饿诱导的自噬相似，证明SHI诱导的HSF与自噬过程密切相关
。

LC3、Beclin1 和 P62 是重要的自噬相关蛋白28。LC3现在广泛用于监测自噬，自噬发生后，LC3-I转化为LC3-II，LC3-II
的量与自噬体的数量有明显的相关性29。P62 是一种泛素结合支架蛋白，可以通过与 LC3-II 直接相互作用来招募吞噬细
胞30。当自噬被诱导时其表达量较低，而当自噬受到抑制时其表达量则积累31。Beclin1 是一种自噬特异性蛋白，可以调
节自噬体的形成，并通过与多个结合伙伴相互作用诱导和抑制自噬途径32。本研究发现HSF中自噬相关标记基因Beclin1和
LC3II/LC3I的上调和减少表明SHI治疗后可以激活自噬，因此自噬的激活可能是修复HS的机制之一。

本研究进一步检测了 SHI 诱导的自噬过程中 HSF 细胞的 AMPK 通路。一些报道表明 AMPK/mTOR 信号通路参与自噬的调节
33,34。在能量匮乏等应激条件下，AMPK作为能量分子传感器被激活以调节自噬35是自噬的正调节因子，通过抑制 mTOR 活
性来主动调节自噬36。mTOR是自噬的负调节因子，通过磷酸化ULK1以维持其处于非活性状态来抑制自噬37。

本研究发现SHI增加了p-AMPK的表达并降低了p-mTOR的表达。它促进 AMPK 磷酸化并减弱 mTOR 磷酸化，并能促进 HSF 的
自噬。作用机制可能与抑制AMPK/mTOR信号通路的激活，影响下游自噬相关蛋白的表达有关，因此可以认为是一种促进自噬
的药物。

核心蛋白LC3II/LC3I、Beclin1、p-AMPK和mTOR活性增强，而P62、AMPK和p-mTOR活性降低，表明SHI通过激活自噬发挥作用
。此外，CQ还用于进一步验证SHI是通过自噬激活发挥作用的。ULK对代谢状态敏感，在低能量或营养条件下，AMPK通过直
接磷酸化和激活ULK1来促进自噬，而mTOR则通过抑制ULK1激活来抑制自噬33。进一步的实验发现，自噬流抑制剂CQ可以抑
制LC3-I向LC3-II的转化，引起AMPK和ULK活性上调，导致自噬流受损。

为了进一步确定 SHI 促进的疤痕修复是否与体内自噬调节相关，本研究测量了不同时间段猪疤痕模型中的自噬水平。免疫
组织化学结果显示，与对照组相比，LC3 II 的表达在两周??后达到峰值，表明 SHI 促进猪疤痕模型中的自噬。总的来说
，这些结果表明AMPK/mTOR信号通路参与了SHI促进HSF的自噬，但不能完全排除SHI是否调节其他自噬相关信号通路。

结论
这项研究表明，SHI 促进 HSF 细胞的自噬，并可能通过 AMPK/mTOR 信号通路诱导自噬来促进疤痕修复。这些发现支持了
SHI作为治疗人类热射病的潜在药物的潜力，并为热射病的早期临床治疗提供了新的靶点。需要更多的研究来评估 SHI 是
否参与其他信号通路或自噬和凋亡调节背后的关键分子机制。