介绍
与自体移植相关的生物手术佐剂的开发用于局部刺激骨愈合仍然是组织工程研究的一个重要领域1。理想的补充生物材料应
具有多种特性，包括成骨和骨传导特性；不诱导宿主的免疫反应；刺激血管生成；并完全被骨骼取代，其数量和质量与宿
主相似2。

从这个角度来看，富含血小板的血浆（PRP）是一种无毒且非抗原性的自体血液来源部分，包含大量白细胞和血小板。PRP
可能负责生长因子的合成和增加表达，增加成骨细胞增殖和细胞外基质合成，促进骨愈合的相关条件3,4。由于Marx在使用
血小板浓缩物时证明了人工骨缺损中新骨的形成更大、更快，因此它成为治疗颅面骨缺损的有前途且重要的替代方案，因
为其在临床实践中易于应用且效果良好。5。

尽管有这些吸引人的生物学特性，但仍建议在其成分中添加纤维蛋白，从而对通常的 PRP 进行改进。PRF 模仿自体疤痕基
质，添加纤维蛋白胶和经典血小板浓缩物6,7。PRF由四分子结构聚合的纤维蛋白基质组成，掺入血小板、白细胞、细胞因
子和造血干细胞，可以改善骨再生8,9。

因此，本研究的目的是评估单独使用 PRF 以及与颗粒自体骨结合对兔颅骨非严重缺损的骨修复，以评估其骨传导和骨诱导
作用。

方法
根据机构动物护理和使用委员会批准的方案（方案编号 1896/2017），使用 15 只既往无疾病的白色新西兰雌性兔子（140
至 170 天；2,456 - 3,502 克）。将兔子饲养在温度可控（~20 至 23°C）的房间内，并维持 12 小时的光暗循环。

手术过程
用5%盐酸氯胺酮以60mg/kg的速率联合甲苯噻嗪以10mg/kg的速率将动物麻醉。当动物在处理过程中不动时，麻醉被认为是
有效的。

手术区域预先剃毛并进行无菌准备。无菌屏障限制了手术视野。该区域骨膜下注射 1 mL 2% 利多卡因和 1:100,000 肾上
腺素。进行中线真皮骨膜切口（5cm），提起皮肤骨膜瓣以暴露颅骨表面。在大量盐溶液冲洗下用环钻制造四个直径为 8.3
毫米的缺陷。将自体骨碎片磨成颗粒用于自体移植。缺陷已被填补：

具有来自骨颗粒的自体骨；

与 PRF 相关的颗粒自体骨；

仅限 PRF；

无移植材料（作为对照=假手术）。

随后，使用 4 根单尼龙线闭合伤口。随后，再次用聚维酮碘（PVPI）对该区域进行消毒，并将动物转移到与术前相同的条
件下。抗生素预防持续三天。

富含血小板的纤维蛋白制造
在每只动物的颈外静脉上收集 8 毫升血液，并立即以 1,800 rpm 离心（Monteserrat 型号 80-2B）10 分钟（RCF 凝块 =
182 g）。PRF 膜使用 Intraspin 离心装置（45° 转子角度，凝块处半径 50 毫米，使用 10 毫升玻璃涂层聚丙烯管最大
半径为 80 毫米）生产。

真空管中未使用任何添加剂。离心后，可以从凝块中识别出PRF。使用无菌镊子将凝块分离并移除。然后使用无菌镊子将
PRF 从管底部取出，并立即应用于手术床上，单独或混合到自体移植物中。

组织加工
术后两周、四周和六周后，通过静脉注射戊巴比妥 100 mg/kg 对动物实施安乐死（每组 5 只动物）。每个颅骨都被暴露
，并且每个标本都用带有超声手术尖端模型 H-SG1 的压电电机在手术编程中以 150% 功率和充分冲洗进行适当切割，其中
最初划定每组的区域。压电超声的目的是获得薄且精确的骨切割，保持细胞结构完整。每个颅盖标本碎片在 10% 缓冲福尔
马林中固定两天，然后在 20% 甲酸溶液（20 mL 甲酸 PA、60 mL 蒸馏水和 20 mL 36% 福尔马林）中脱钙一周和柠檬酸钠
五天。

将样本用自来水洗涤，用浓度递增的乙醇脱水，在二甲苯中澄清，并包埋在石蜡中。使用切片机（RM2155，Leica
Microsystems GmbH，Nussloch，德国）从每个标本上切下连续切片（3 μm），并用 Masson 三色染色以检测骨再生区域
。

从每个样本中获得 64 张载玻片。在适当的组织学扫描仪中对它们进行扫描以获得组织学图片。每张显微照片均在
Adob??e Photoshop CS6 软件中打开，并从进行所有测量的缺陷中心绘制一个直径为 6,027 μm 的圆。使用魔棒工具，从
扫描的照片中去除所有骨外组织（图。1）。这样，只有骨组织保留在所选区域内并被测量。所有测量均由同一操作员执行
并以 jpeg 格式保存。

将显示感兴趣区域的显微照片导出至 Image Pro Plus 软件版本 4.5（Media Cyber??netics，美利坚合众国）以获得每张
幻灯片中的总骨面积和骨形成百分比。

统计分析
计算每张幻灯片中的骨百分比。Shapiro-Wilk 分析用于确定数据的正态性。Mann-Whitney 检验用于比较自体移植物×自
体移植物+PRF 组以及对照×PRF 组在每个术后时期的骨修复百分比。P < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果
组织形态学评估
前面总结了每组的组织学结果和术后时间的简要描述。图2显示了以箱线图表示的组织形态计量数据，比较了自体移植物×
自体移植物+PRF组在每个术后时间的骨修复百分比。图3显示了自体移植物和混合至PRF组的自体移植物的组织学图示。

自体移植（图3 )：术后第2周，自体骨周围骨缺损处可见骨小梁细而旺盛。众所周知，新骨形成组织中存在纤维（图3a）
。第四周，再生组织的微观方面相似，但骨组织数量有所增加（图3c）。六周后，在缺损处发现了具有突出髓质组织的松
质骨。与分析第四周相比，骨组织的增加轻微。在此期间，松质骨组织的存在很明显，周围有茂盛且结构良好的髓质脂肪
组织。图3e )；

自体移植物与 PRF 混合（图3）：在第二个（图3b）和第四（图3d）术后几周，应用PRF的骨修复的组织学方面与仅使用自
体移植物的治疗相似。第六周，骨骼区域在形态良好的髓质组织中显示出充满活力的紧凑而坚固的哈弗氏骨岛

脉冲重复频率（图5 )：该组的微观方面在所有时间段都表现出与对照组相似的再生模式。然而，众所周知，与假手术组相
比，胶原蛋白密度和松质骨小梁组织的数量都更大。

讨论
本研究通过术后第二周、第四周和第六周的组织学和组织形态计量学分析，评估了单独使用 PRF 以及与自体移植混合使用
对兔颅骨非严重缺损骨修复的效果。PRP 的使用显示骨量局部增加，尤其是六周后。插入 PRF 的标本中骨沉积的增加单独
发生或与自体移植物相关，表明 PRF 诱导骨新生。据报道，PRF的作用似乎与其成分有关，创造了支持骨新生的微环境
6,10,11。

PRF 中应考虑的一个基本变量是血小板的存在，其含量是血凝块的五到十倍12,13。大量的血小板释放大量的生长因子，从
而增加血管生成的速度并改善伤口愈合区域的骨分化。证实了这一前提，转化生长因子-β（TGF-β）的合成和分泌似乎是
血小板在血管生成和成骨过程中合成的基本细胞因子14。TGF-β 的自分泌和旁分泌细胞刺激导致间充质祖细胞扩增为成骨
细胞祖细胞15,16。因此，TGF-β还通过选择性丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和Smad2/3途径，以及TGF-β与Wnt和BMP之间
的合作，促进骨祖细胞增殖、早期分化和向成骨细胞谱系的定型。负责成骨细胞分化17 号。

与 TGF-β 的分泌相关，血小板在激活后也会从其 α 颗粒产生胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)18，这是激活RUNX-2的重要
生长因子19，不仅改善成骨表达，还改善再生部位的磷酸酶碱性和矿物质沉积20。值得注意的是，当 IGF-1 磷酸化是前成
骨细胞干细胞中的受体时，这种生物作用会产生底物胰岛素受体底物-1 (IRS-1) 的细胞内激活，进而导致 Akt 激活，从
而有助于IGF-1 的生存信号21从而导致骨传导和骨诱导中骨蛋白 RUNX-2 的增加6。

另一方面，纤维蛋白的存在似乎在修复过程中至关重要。它的存在产生了由凝块内形成的细纤维蛋白纤维组成的微孔，可
以作为细胞粘附的支架，以及用于输送血小板产生的生长因子22。

应该强调的是，储存在纤维蛋白中的生长因子逐渐释放到周围组织可能被认为很重要，因为它延长了生长因子的活性，这
对于组织工程来说是理想的，并且可能与 PRF 的成功相关，特别是与 PRP 相比，在多项研究中不仅未能促进成骨，而且
在骨修复过程中产生了病理性微环境，正如我们小组所证明的3,14,23。

尽管 PRF 有许多被认为有益于成骨的内在作用，但与对照组或自体移植组相比，骨修复早期的结果并未显示出成骨的显着
增加。这些结果与之前的研究不同，之前的研究表明使用 PRF 时成骨活性显着增加24。结果的这些差异可能归因于 PRF
制造25。

因此，可能导致早期修复期缺乏稳健的成骨的一个因素可能归因于离心中使用的管的类型26。在这种背景下，Tsujino 等
人。27证明在含有二氧化硅的试管中离心的 PRF 会导致纤维蛋白 PFR 网中该成分的掺入和污染。Masuki 等人证明了二氧
化硅的有害存在。28等人证实，二氧化硅微粒吸附在骨膜细胞表面，由于相互作用，诱导骨膜细胞凋亡，细胞增殖和活力
显着降低，血小板被破坏。

此外，米龙等人。29证明无论使用的离心方法如何，用玻璃管生产的 PRF 膜比用塑料管生产的 PRF 膜大（约 200%）。这
些效应综合起来似乎表明 PRF 管对结果有更大的影响，并可能部分解释本研究中修复早期阶段缺乏旺盛的成骨作用。

近年来，PRF 的制造发生了巨大的变化，以提高其成骨能力。每分钟转速和施加到管上的重力等因素可能会改变 PRF 对成
骨的影响。上述每个参数都可能影响 PRF 再生的成功率。先前已经描述过，由于较高的细胞含量和生长因子积累，以较低
离心速度制造的 PRF 凝块可改善生长因子释放和细胞行为。这样，PRF 制造方案应详细描述，因为这些参数影响成骨25。

结论
这项研究表明，当单独使用或与自体移植联合使用时，PRF 的使用可增加兔颅骨中产生的非严重缺损的骨修复。