一、简介

干细胞（SC）的特点是具有自我更新能力和分化成各种细胞谱系的能力。干细胞根据发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞能够分化成所有细胞类型。目前干细胞的主要来源是骨髓、脐带血和脂肪组织[ 1 ]。需要寻找新的、更好的干细胞来源来促进治疗研究。

成体干细胞，如皮肤干细胞，已成为研究兴趣的来源，并且可以提供在再生医学中具有潜在用途的细胞库；为此，识别和隔离是必要的。皮肤含有不同的干细胞群[ 2 ]，分布在毛囊间表皮、毛囊和皮脂腺中。干细胞控制组织稳态和伤口修复；它们存在于承载和维持干细胞的生态位或微环境中 [ 3 ] [ 4 ] [ 5]。毛囊是自我更新的结构，在整个生命周期中自我循环和重建。每个毛囊永远经历三个阶段：快速生长阶段（生长期）、细胞凋亡或退化阶段（退行期）和休息阶段（休止期）[ 6 ][ 7 ]。毛囊干细胞 (HFSC) 存在于毛囊外根鞘 (ORS) 内称为“凸起”的结构中，该结构充当多能 SC 的储存库，并从皮脂腺导管的插入点延伸到立毛肌的附着部位 [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11]。如果干细胞（包括 HFSC）的生态位不被破坏，就永远不会失去再生能力。SC 离开凸起并向下增殖，形成一条长的线性细胞轨迹，即 ORS [ 12 ]。

从解剖学的角度来看，毛囊已被证明对小鼠和人类来说都是一个挑战[ 13 ]，因为缺乏可以使用光学显微镜观察的明显解剖特征，毛囊的尺寸相对较小，并且目前还没有普遍采用的方法来鉴定和分离干细胞作为培养物中的纯且可存活的群体[ 14 ][ 15 ]。因此，我重点关注毛囊突出区域的干细胞，该区域具有巨大的增殖潜力。

这些特性使它们成为用于皮肤和头发等组织再生或治疗脱发等疾病的理想候选者。我们的假设表明，干细胞群驻留在凸起区域，其维持受到微环境的影响，如果提供关键因素，它们可以保持为未分化的成体干细胞，具有很高的自我更新潜力。因此，确定使凸出细胞在体外维持其表型和活力的条件是必要的。本研究探索小鼠和人类 HFSC 的体外分离、培养和表征以及特定标记；还研究了小鼠和人类毛囊之间的差异。

2. 方法

2.1. 组织样本

触毛毛囊取自新生（2 至 3 天大）小鼠 (n = 32) 的头部和身体。所有动物均购自 Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel 的动物设施。此外，经委内瑞拉中央大学科学学院伦理委员会批准并书面知情同意，从 30 至 58 岁整容患者 (n = 10) 中收集了多余的健康人类头皮皮肤。

此外，还从两名自愿捐献者（一名 32 岁女性和一名 37 岁男性）的身体各个部位（面部、腿部和手臂）获取了人类毛囊样本；几根毛囊完整的毛发被拔掉。将生长期毛囊和触毛新鲜解剖并在显微镜下分成单个毛囊单位。

2.2. 组织分离和培养

处死新生小鼠，在70%酒精中保存10分钟，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤2次，持续5分钟。将组织修剪成小片（4 mm × 4 mm），将皮肤碎片在 DMEM/F12（1:1；Gibco-BRL）中的 0.25% 分散酶 II（多粘芽孢杆菌，Gibco，BRL）中孵育 12 - 4°C 下 18 小时。首先在乳酸林格氏溶液中冲洗头皮组织，并去除多余的脂肪组织。在生长期小心地挤出毛囊，通过可见的毛球和完整的 ORS 进行识别，并在解剖显微镜下仔细选择。用 F-12 冲洗两次后，将毛囊转移到 35 毫米培养皿中。然后，通过用细针在 ORS 增大点处进行两个横向切口，将隆起区域从上毛囊切除。所有手术过程均在无菌环境中进行。再漂洗两次后，将凸起物以每皿 20 个的密度转移到新培养皿中，浸入 Dulbecco 改进的 Eagle 培养基（DMEM，Gibco）和 Ham 的 F12 培养基（3:1；Gibco）中，补充有 10%胎牛血清 (FBS; Gibco)、10 ng/ml 表皮生长因子 (Invitrogen)、5 g/ml 氢化可的松、5 g/ml 胰岛素 (Sigma-Aldrich)、200 mmol/L L-谷氨酰胺 (Gibco) 和抗生素（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）。培养物在 37°C 和 5% CO 条件下孵育 10 ng/ml 表皮生长因子 (Invitrogen)、5 g/ml 氢化可的松、5 g/ml 胰岛素 (Sigma-Aldrich)、200 mmol/L L-谷氨酰胺 (Gibco) 和抗生素（100 U/ml 青霉素和 100 g /ml 链霉素）。培养物在 37°C 和 5% CO 条件下孵育 10 ng/ml 表皮生长因子 (Invitrogen)、5 g/ml 氢化可的松、5 g/ml 胰岛素 (Sigma-Aldrich)、200 mmol/L L-谷氨酰胺 (Gibco) 和抗生素（100 U/ml 青霉素和 100 g /ml 链霉素）。培养物在 37°C 和 5% CO 条件下孵育2空气中，每周更换培养基两次。首先将人头皮组织在乳酸林格氏溶液和含双倍浓度抗生素（青霉素 G，100 μg/ml 和链霉素，100 μg/ml）的 Ham's F12 中冲洗。该溶液用作运输介质以维持无菌条件和最佳生理条件。接下来，将样品用70%酒精快速清洗，并按照与小鼠皮肤样品相同的方式进行切片。

2.3. 亚文化和放大

原代培养3-4天后进行集落形成；通过与 0.125% 胰蛋白酶 (Sigma) 和 0.02% EDTA (Sigma) 的 1:1 混合物在 37°C 下孵育 5 - 10 分钟来收集细胞。将分散的细胞以 2500 rpm 离心 5 - 10 分钟，然后重新铺在组织培养瓶中涂有明胶（小鼠）和 I 型胶原（人）的 35 毫米培养皿中，每 3 - 4 天更换一次培养基。细胞每7天常规传代一次。每周，对细胞进行胰蛋白酶消化（Gibco），并连续传代大量培养物，直到生长能力耗尽。为了保存，如上所述从培养皿中消化细胞。

用培养基冲洗一次后，将细胞重悬于1ml含10%二甲亚砜（Sigma）的胎牛血清中，转移至冷冻管中，并置于4℃、-20℃和-80℃冰箱中。 C容器轮流。此外，24小时后，将一些细胞转移至冷冻管中的液氮罐中。

2.4. 生长曲线的测定

将特征为圆形的细胞以 1 × 10 - 4 个细胞/孔的密度接种到 4 × 6 孔板中。培养 2 天后，在第 2、4、6 和 8 天，对三个孔进行胰蛋白酶处理 (Gibco) 并使用 Malassez 室进行手动计数。根据每个时间点的平均细胞数计算生长曲线。

2.5. 免疫组织化学染色

将细胞铺在 35 mm 培养皿中，用 PBS 洗涤 2 次，持续 5 分钟，并在甲醇中固定 5 分钟。通过与 1% H 2 O 2一起孵育来阻断过氧化物酶和非特异性抗体的结合/甲醇和血清在室温下孵育 10 分钟，然后与小鼠和人中的一抗（抗小鼠 CK15、克隆 LHK15；Thermo Fisher）、小鼠中的抗小鼠分化簇 CD34 IgG (eBioscience) 和抗-人 CD200 IgG (eBioscience)，按 1:100 稀释，4°C 过夜 30 分钟。然后将细胞洗涤 3 次，持续 5 分钟，以去除未结合的一抗，并与二抗（试剂盒）在 37°C 下孵育 10 分钟；通过洗涤 3 次 5 分钟去除未结合的第二抗体，并通过 DAB 试剂盒 (Dako) 进行可视化。细胞质呈棕色的细胞为阳性细胞。当需要识别凸起区域时，用苏木精进行复染。

2.6. 免疫荧光染色

将铺在 35 mm 培养皿中的细胞用 PBS 洗涤 2 次，持续 5 分钟，并如上所述在甲醇中固定 5 分钟。切片用1:30稀释的10%马血清封闭，室温25分钟，然后与小鼠和人的第一一抗（抗小鼠CK15（Thermo，克隆LHK15），抗小鼠CD34 IgG（小鼠抗人 CD200 IgG (eBioscience) 和人抗人 CD200 IgG (eBioscience)，按 1:100 稀释，室温 90 分钟。连续洗涤 3 次后，与第二一抗（FITC 缀合的羊抗小鼠 IgG）孵育小鼠和人的 CK15、小鼠的抗大鼠 IgG 生物素 (eBioscience)、人类的抗小鼠 IgG 生物素 (eBioscience)，按 1:100 稀释，室温 30 分钟。载玻片洗涤 3 次，然后用链霉亲和素 PE (eBioscience) 30 分钟，检测 CD34 和 CD200。然后对载玻片进行清洗、复染，并用含有 DAPI（Vector Laboratories）的封固剂进行处理。使用倒置显微镜相差显微镜和落射荧光显微镜（Axiovert 40，Zeiss）观察标记的细胞。

一般来说，对观察到的细胞的形态进行描述性分析，对荧光反应强度进行评估的半定量分析（强、中度、轻度）以及对DAPI、CD34、和CD200进行计数。

按以下方式对培养物中CD34、CD200和DAPI的免疫反应进行定量分析：免疫染色后，由同一观察者对小鼠中表达CD34和人中CD200表达阳性反应的细胞进行两次计数。为此，需要根据Zurita 等人使用的方法，使用 ImageJ 程序在免疫荧光显微镜中考虑代表总面积等于 0.0243 mm 2的 400× 图像的叠加。和阿莫等人。[ 16 ][ 17]]。根据培养物中免疫反应模式研究毛囊突出区球形细胞直径与现场记录荧光强度的关系，分类为：小=10-13μm，中=14 - 16 μm，大 = 17 - 20 μm，以及荧光程度（轻度、中度和强烈），根据 Zurita 等人的修改方法。和铁德等人。[ 16 ][ 18 ]。

2.7. 细胞冷冻保存和解冻

将毛囊突出部的细胞重悬于由DMEM：F12组成的冷冻培养基中，添加20％FBS和10％甘油，并保存在70℃下备用。为了解冻细胞，将冷冻管放入 37% 蒸馏水中，直到样品溶解并出现在营养基础培养基中。然后，将其居中5分钟，将细胞沉淀重悬于基础培养基中并接种于4孔板(Nunc)中。使用台盼蓝排除染料在 Neubauer 室中对细胞进行计数。

将微培养物以 0.5 至 1 个细胞/孔接种到 96 孔板中，涂有 1% 明胶（小鼠）和 1% 胶原蛋白 I（人类）（BioCoat，BD Biosciences）。每天仅观察含有单个细胞的孔的增殖。培养基的构成如前所述。7天后，用70%乙醇固定培养物并用伊红染色。

2.8. 统计分析

为了评估流式细胞术数据，应用配对学生 t 检验来比较亚群的细胞数百分比或 FSC 值。显着性水平设为 p ≤ 0.05。

确定突出区域中 CD34（小鼠）和 CD200（人）阳性和阴性的细胞百分比相对于用 DAPI 标记的细胞核代表的细胞总数，其中观察和记录根据培养的初始阶段（小鼠为 45 天，人类为 7 天）和培养的最后阶段（小鼠为 210 天，人类为 45 天），在一段时间内有四个视野。 Amoh 等人的修改方法。[ 17 ]。

3. 结果

3.1. 毛囊的分离

通过真皮-表皮分离来分离完整的毛囊。人类毛囊的突出区域比小鼠毛囊的突出区域要好（图 1(A)-(C)）。培养板表面涂有 1% 明胶（小鼠）和 1% 胶原蛋白（人），可改善细胞对培养板表面的粘附。来自小鼠的胡须和毛囊以及来自成年人（头皮和脱毛）的毛囊的细胞位于原代培养物中。最初，细胞从凸起区域周围的外植体缓慢生长，小鼠细胞表现出不同的形态（图2（A）-（D）），而人类细胞大多呈圆形，尺寸较小，呈多边形（图2（E）- (H))，毛囊移植后3-4天内；与后来积累的其他细胞类型一起。随着细胞的增殖，图2）。人类细胞群主要由上皮样细胞组成，呈多边形，核心有一个或两个核仁，有时组织成群；偶尔观察到有丝分裂，可能存在类似于桥粒的细胞间结合（图 2(E)-(H)）。

在凸起细胞培养的早期阶段发现的最显着的形态特征是外观折光细胞，圆形，小

小鼠细胞中，部分细胞呈细胞角蛋白 15 阳性（图 3 (A)），部分细胞呈干细胞标记 CD34 呈阳性（图 3 (B)、图 3 (C)），而 CD200 呈阳性（图 3） (D)，图 3 (E))，在人类中。其他细胞类型也以较小的数量显现，但始终存在。这些细胞按出现频率排列为：成纤维细胞样细胞、间充质样细胞、脂肪细胞样细胞、黑素细胞样细胞、朗格汉样细胞、巨噬细胞样细胞（图 3 (B)、图 3(C)) 和神经元样细胞（图未显示）。总体而言，在原代培养物建立期间，小鼠细胞维持45天，人类细胞维持30天。在小鼠细胞中发现了比人类细胞更异质的群体，没有衰老的证据，并且细胞的行为表现出自发分化潜力，因此捕获的凸起细胞并不代表纯群体。

3.2. 毛囊凸起区域的分离

在初步鉴定和收获生长的毛囊后，在光学显微镜下分离并切除小鼠和人类毛囊隆起区域的细胞，并将其分别放入明胶和胶原蛋白包被的平板中，分别用于小鼠和人类细胞。在原代培养物中，小而圆形的细胞占主导地位。对加工后的毛囊进行酶处理，产生了在小鼠（图 4(A)-(D)）和人类细胞（图 4(E)-(G)）中具有相同表型的细胞群。形态学上，光镜观察这些细胞为折光细胞，呈圆形，中央核和核仁突出且常染色，细胞质稀少，直径约10～15μm，最大20μm，可形成集落。细胞悬浮

用胰蛋白酶进行酶消化以扩增并均质化群体。一些菌落形成，在培养的最初几天就可见。这些细胞增殖，而其他细胞类型则表现出随时间减少的趋势。

我们还观察到，传代培养物显着增加了几代细胞的数量，并使其均质化，HFSC 的增殖能力更强（图 4 (B)、图 4 (F)、图 4 (G)、图 4 (H) ）；图 5和图 6）（表 1），在小鼠中维持培养物约 8 个月，在人类细胞中维持培养物约 2 个月，保留其表型，并且没有显示与衰老相关的特征。然而，在人类中，获得了更均质的细胞群，其具有小尺寸和缺乏细胞质的圆形特征，并且通过脱毛更容易进入毛囊。

3.3. 培养中毛囊突出区域的细胞群分析

至于球形细胞大小与CD34 +和CD200 +抗体的荧光程度之间的关系，统计研究表明细胞大小与荧光强度之间存在反比关系(p < 0.05)(图7 )。直径较小（10 - 13 µm）的细胞更频繁且荧光更强烈。

此外，通过比较培养初始阶段（小鼠，45 天和人类，7 天）每个视野中CD34 +和 CD34 -小鼠细胞以及 CD200 +和 CD200 -人类细胞的数量来确定球形细胞的隔热效率。）和培养物生长的最后阶段（小鼠，210 天，人类，45 天），根据每种培养物的动力学（图 8）。CD34 +细胞的百分比为 77.16% 和 83.62%，而对于人类细胞，CD200 +分别为91.12%和91.32%，表明识别CMRPFP的抗体呈阳性的细胞比例很高。此后，形态与脂肪细胞相似的细胞集落形成，主要在小鼠细胞中出现，显示脂滴，苏丹III细胞质染色呈阳性（图9）。

3.4. 细胞增殖的测定

3.4.1. 成长曲线

随着时间的推移记录的小鼠和人类毛囊突出区域的活细胞数量（图10）确定了一个滞后期，在接种细胞后的前 2 天内显示出非常缓慢的增长，然后在前 6 天内增加了增殖指数增长培养数天后，小鼠细胞的增殖能力下降，而人类细胞直到培养第 8 天才显示出显着的生长。

3.4.2. MTT 检测

孵育48小时后，我们使用MTT方法测量细胞活力（图11）。前4天观察到适度的生长增殖，随后直到第六天呈指数增长，之后观察到种群数量下降和增殖速度减慢的趋势。数据表明活细胞的行为与上面获得的生长曲线相似。

还已知培养物中活细胞的绝对数量与通过添加DMSO释放的细胞内累积的代谢MTT的量之间存在线性关系。从曲线图可以看出，每个物种的 MTT 代谢量不同。观察到小鼠和人类代谢的 MTT 之间存在显着差异 (p < 0.05)。小鼠细胞培养物产生比人类细胞更多的 MTT 甲臜。

增殖测定与培养物中细胞的特征增殖模式一致，在滞后期、指数期或对数期和稳定生长期之间（图10和图11），我们发现在小鼠和小鼠中进行传代培养所需的时间。人类可以对应6天。

3.4.3. 细胞冷冻保存和解冻

通过冷冻保存第9代和第15代的小鼠细胞，在储存12天和随后的解冻后保持形态和增殖能力。它们通过从储存中恢复而保持其特性，显示出均匀的形态（球形），并且在小鼠中检测出 CD34 阳性，在人类细胞表达中检测出 CD200 阳性（图未显示）。然而，人体细胞的核心很小。

3.4.4. 小鼠毛囊突出区分离克隆细胞的培养

由于已经可以确认了解 CRPFP 体外行为的重要性，因此需要进行彻底的分析来确定细胞的特性。鉴于所用方法无法获得 100% 纯培养物，因此开发了一种基于显示感兴趣表型的细胞克隆的方法，通过稀释测试进行克隆微量培养，以检查容量小鼠和人 RPFP 分离细胞的自我更新和分化。在一些每孔有一个细胞的孔中观察到了这一点，类似于上述球形细胞，其在播种后的前 3 天内增殖并形成集落。早期，在小鼠细胞中，3-4天内即可观察到少量的细胞分裂，

4。讨论

本研究允许在体外分离、表征和扩增分别来自小鼠和人类毛囊的CD34 +和 CD200 +干细胞，这些干细胞在培养物中大部分是纯净且有活力的群体；从鉴定毛囊隆起区域干细胞开始[ 8 ][ 9 ][ 19 ]，并开发一种经过修改的方法[ 20 ]-[ 26 ]，这是完成这项工作的基本部分，高度了解了解小鼠和人类毛囊干细胞的体外行为。

在整个毛囊和触毛的原代培养物的建立过程中，观察到了与天然组织类似的几种不同的表型。已证实，在突出区域，小、圆形、难治性细胞（小鼠CD34 +和人类 CD200 +）的生长，在由异质细胞群组成的单层中辐射，在小鼠中生长 5 - 7 天，在人类中生长 12 - 15 天，与之前的报道一致[ 8 ][ 9 ][ 27 ][ 28 ]。在人类毛囊中，大多数细胞呈多边形，可能对应于角质形成细胞，与其他作者报道的类似[ 24 ][ 27 ][ 29]。然而，在触须科中，这些群体主要是异质的，以梭形细胞为主；沿着培养细胞的边缘，我们发现了各种延长，可能对应于其他细胞类型中的神经细胞和黑素细胞[ 28 ][ 30 ][ 31 ][ 32 ]和小鼠毛囊[ 9 ]。这种分布表明，小鼠和人类的毛囊代表了多能角质形成细胞干细胞的重要储存库，人类比小鼠更容易获得，主要是因为前者倾向于分化为角质形成细胞。

同样，异质群体的存在和表达的增殖潜力可能是由于粘附在小鼠毛囊上的真皮组织（通常大于人类毛囊）以及培养基和个体的年龄，这些都是影响细胞增殖的重要因素。组织中存在的细胞的生长和多样性可以证明这些差异是合理的。

此外，在毛囊球部（真皮乳头）的培养中，与小鼠和人类的凸起区域不同，我们发现，从外植体中产生了异质细胞群，具有可见但稀有的圆形细胞，这可能表明存在更多数量的分化细胞。所有这些都表明，为了避免异质细胞群的生长，突出区域细胞的操作和分离至关重要。

为了证实所获得的结果，对完整小鼠毛囊细胞的原代培养物进行 ICQ 测定，结果显示，除了形态与干细胞不同的其他细胞类型中 CK15 表达外，圆形细胞中也有中等程度的 CK15 表达，这与之前的研究相关。 IHQ 结果 [ 19 ] 可能表明 CK15 不是 CM 特异性抗体，并且从卵泡中分离的细胞并不代表纯 CM 群体。同样，小圆形细胞可能对应于具有一定分化程度的CM。从这个意义上说，它们与人原代上皮祖细胞中原位和体外的 CK15 表达一致，如 [ 33]所示。]。关于 ICQ 和免疫荧光，在大多数来自小鼠滤泡和触毛的圆形细胞中观察到 CD34 呈阳性反应，在人类 RPFP 中观察到 CD200 呈阳性反应，表明它们可以对应于具有 CM 特征的细胞，与其他作者报道的类似[ 4 ][ 34 ][ 35 ]。

然而，观察到对抗体没有反应的圆形细胞，这可能对应于具有一定分化程度的细胞。此外，在轮廓不规则且可能具有空泡的大细胞中发现阳性表达，这可能对应于巨噬细胞[ 36 ]，因为CD34抗体也在造血细胞中表达，其存在可能与毛囊周围巨噬细胞对皮肤上皮细胞活化的贡献有关。干细胞[ 37 ]。

一旦我们注意到外植体中毛囊细胞增殖的起源，我们就探索了来自突出区域的细胞作为成体 CM 来源的生长潜力和特性，对突出区域进行了解剖，如其他研究所示作者[ 21 ][ 29 ][ 38 ]，这允许分离细胞；通过从最少数量的卵泡中扩增培养物中的这些细胞，我们能够避免其他细胞类型的污染。为此，还需要特定的培养基条件，作为通过胰蛋白酶酶促分解通过后续传代培养提供的生长因子，以获得并维持由具有相同表型的细胞组成的均质培养物。

作为研究发展的起点，并且由于有关 CRPFP 特征的可用信息稀缺，本研究将凸起区域细胞的免疫表型描述为：直径在 10 至 20 μm 之间的球形细胞，中心核呈圆形且突出，缺乏难处理的细胞质；表明蛋白质合成活性高的特征，类似于基底层的表皮 CM 和其他作品中描述的细胞 [ 8 ][ 29 ][ 34]。我们认为，为了获得球形细胞，需要对 RPFP 进行细致且彻底的分离；否则，获得的异质群体将主要是类似于间充质细胞的梭形细胞。相比之下，来自人类毛囊球部真皮乳头的间充质干细胞（CMM）已被培养并被描述为梭形[ 39 ]，与本研究中描述的凸起区域中的圆形细胞非常不同。

干细胞显示细胞大小与荧光程度之间呈反比关系，这表明在小鼠和人类细胞中，直径较小（10 - 13 μm）的表达量更大（p < 0.05），结果与所描述的结果一致巴兰登和格林 (1985) [ 40 ]。同样，这些研究人员指出，直径在 10 至 12 μm 之间的细胞比 20 μm 细胞具有更高的集落形成效率 [ 40 ]，集落形成效率与细胞直径成反比，并且 CK15 −和 CD200 +细胞小于人类的CK15 +和 CD200 +细胞 [ 41 ]。

另一方面，在继代培养物中，在各代中观察到细胞群显着增加，这使得它们均质化并形成集落；这些细胞的特征是球形细胞占主导地位，保持未分化的表型。结果表明，在突出区域主要发现具有高增殖能力和分化潜力的细胞，这与之前的结果一致[ 4 ][ 8 ][ 24 ][ 27 ][ 29 ][ 42 ][ 43 ]。

从这些结果我们认为，小鼠的细胞增殖比人类更大，这可能是由于个体的年龄所致，因为这会影响培养物中细胞的行为。众所周知，随着患者年龄的增长，获得活细胞的难度及其增殖能力显着下降[ 44 ]。此外，累积群体通常被用作生物学年龄指数，其中更大的增殖潜力可能表明细胞在生物学上比其他成体细胞更年轻[ 45 ]。

类似地，在小鼠中连续进行传代，持续时间为 240 天，这一观察结果与 Nath 等人的观察结果一致。[ 46 ]，他们报道这些细胞连续培养超过1年（>100次传代）而没有改变其表型。在人类细胞中，连续传代，持续时间在 45 至 60 天之间，与 Oh 等人获得的结果相似。[ 42 ]，他证明了从人类毛囊中培养 CM 的可能性，并且在 50 天的培养过程中不会引起细胞表型的显着变化。这表明细胞的表型在培养过程中可以长期维持[ 8 ][ 43 ][ 47 ][ 48]。此后（小鼠240天，人类60天），我们的结果显示，形成了形态与脂肪细胞相似的细胞集落，主要是小鼠细胞，细胞质内有脂滴，苏丹III细胞质染色呈阳性，这表明细胞质中存在脂滴。表明向脂肪细胞分化，并且可能表明突出区域的生态位中存在不同的 CM 群体，或者细胞向脂肪形成谱系分化。

这些结果与免疫标记一致（小鼠 45 天时为 77.16%，人类 7 天时为 91.12%，小鼠 210 天时为 83.62%，人类 45 天时为 91.32%），这表明培养基有利于分离和增殖小鼠和人类中 RPFP 的球形细胞，没有显示中期分化的证据。这可能是由于这种类型的培养基往往缺乏有利于分化的因素，并可能减弱增殖能力[ 29 ][ 42 ]。

在这些突出的特性中，我们发现突出区域的细胞可以悬浮生长并形成类似于 Yu 等人指出的集落。[ 29 ]。对此，国际细胞治疗学会于2006年提出了三个标准来定义CMM[ 49 ]；然而，尚未建立对 CMRPFP 进行充分定义和分类的标准。

此外，对毛囊CM的研究表明，大多数毛囊样本是通过手术手段取自动物背部皮肤或人类头皮[ 43 ]。因此，我们获得了分别来自 32 岁和 37 岁男性和女性志愿者捐献者的人类 RPFP 细胞培养物，这些细胞通过下巴、腿部和手臂脱毛获得，证实了这种方法消除了与脱毛相关的许多问题。隔离和操作缩短了程序。这些结果与整形外科手术中剩余组织样本获得的结果相似，实现了所需细胞表型的分离和扩增，保留了其增殖潜力，并被证明是一种易于获得的替代方案。

在这种情况下，就方法论而言，程序中强调了五个关键点：真皮-表皮分离；毛囊的操作和选择；充分隔离突出区域；毛囊与平板充分粘附并使用促进细胞生长的培养基。

在真皮-表皮分离过程中，毛囊和触须被有效分离。我们建议，尽可能消除脂肪和真皮组织，因为真皮的厚度会影响酶消化，如果活检较小，则分解会更有效，因为在水平作用时，分散酶的作用能够更好地渗透基底膜分离表皮和周围结缔组织之间的结合；与其他允许分离卵泡的酶相比，其细胞毒性也较低[ 50 ]。

小鼠毛囊呈现出一个突出的球状体，其尺寸小于触须，并且在这两个区域中，位置不太明显。正如在小鼠中所描述的那样，它可以被视为一个离散的突起，而在人类中，它可以被视为一个明确定义的结构[ 8 ][ 9 ][ 19 ]。正如Zhang等人、Ohyama, M.和Molina等人所描述的，人类的卵泡无疑比小鼠的卵泡大，清楚地显示出突出的区域。[ 8 ][ 9 ][ 19 ]。选择处于生长期的毛囊是因为毛囊处于刺激生长的时期，并且突出区域得到了更好的证明，正如其他方法所证明的那样[ 8 ][25 ][ 51 ][ 52 ]。

需要一种能够促进细胞与支持物表面牢固粘附的基质，并且具有足够的惰性，不会影响低比例分化的诱导。我们建议使用涂有 1% 明胶和 1% I 型胶原蛋白的板作为外植体，分别促进小鼠和人类完整毛囊的粘附，与未涂敷的表面相比，提供良好的抓力和支撑。有涂层和无涂层表面之间细胞生长的差异可归因于细胞与未涂层表面的弱结合[ 42 ]。明胶和胶原蛋白可以促进外植体外部区域细胞的迁移，并允许细胞群充分生长，而没有明显的诱导分化信号[ 8 ][41 ]。然而，根据 Oh 等人获得的结果。[ 42 ]（获得了高水平的细胞群生长），可以考虑的另一种选择是使用涂有基质胶的表面。

5. 结论

总之，这些结果支持我们的假设，证明选择、分离和条件培养基允许凸出细胞的数量增加，并表明培养的细胞可能属于干细胞，因为它们保持了其表型特征，并表达了特定的标记SC，证明了长期的高增殖能力。详细的表征使我们能够在其他类型的细胞中识别它们，并根据大小评估其分化程度，在小鼠和人类细胞中具有更大的增殖潜力。通过脱毛获得的隆起区域细胞培养物中的人类毛囊干细胞保留了其增殖潜力，并被证明是一种易于获得的替代品，具有更多优势，因为是一种非侵入性或痛苦的过程。