介绍
肝脏除了具有非凡的再生能力外，还因其重要的代谢功能（例如蛋白质合成和异生物质的生物转化）而发挥着重要作用1。肝再生（HR）代表了一种针对功能组织损失的自然保护机制，其发生主要是因为通过剩余肝叶的增生或肥大补偿来恢复肝脏质量，从而导致大小增加，以及由功能或解剖学控制的生长因素2,3。

HR是一个由包括生长因子（如肝细胞生长因子、表皮生长和成纤维细胞生长因子）在内的生理因素与免疫系统细胞增殖高度协调的过程4,5。

为了解 HR 流程如何运作而获得的知识源自啮齿动物模型，其中进行了三分之二的部分肝切除术3。在成人肝脏中，70% 肝切除术后，存在肝细胞肥大的过程，并在剩余肝叶中复制，从而恢复代谢活动。然而，受损肺叶的形态和结构会永久丧失6。

部分肝切除术后，剩余的肝脏 (RL) 需要适应血流动力学，因为它开始接收所有动脉和门静脉血流，而在部分肝切除术之前冲洗整个肝脏4–6。这会导致 RL 代谢超负荷，并似乎触发再生过程7–9。

通过常温或低温灌注技术评估肝脏活力可以作为有益条件引入临床实践10。克罗齐等人。11观察到保存条件和冷缺氧会导致信号幅度增加，这归因于参与能量代谢的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黄素和辅酶的变化。目前，所有有效的移植器官保存方法均以降温为主要保护要素12–15。

肝脏再生过程涉及不同的因素，并且有多种方法能够评估这种现象，例如肝脏质量（肝脏重量）的测定、有丝分裂计数、DNA合成和用于检测作为增殖细胞核抗原的内源分子的免疫组织化学方法。 PCNA）、Ki67 抗原等。Ki67是在细胞周期的G1、S、G2和M期表达的核抗原。其评估用于量化增殖细胞活性，目前被认为是此目的的黄金标准14,15。

激光疗法已被探索为一种潜在的再生疗法16–18。研究人员报告了不同波长激光照射的再生能力，这是由于重要的生理效应，例如诱导细胞增殖。低功率激光的应用可以为部分肝切除术后大鼠肝脏中新肝细胞、间充质干细胞的出现和血管生成提供良好的HR19 号–22。

低强度激光疗法包括使用波长近红外区域的光子，并包括功率相对较低（低于 500 mW）的单色二极管激光器 - 这种做法已用于无热治疗，因为它能够不加热生物组织19 号,22。

由于存在不同的细胞成分，如黄素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)、芳香族氨基酸、脂褐素、晚期糖基化终产物和胶原蛋白，所有细胞都表现出内在的天然自发荧光20。自发荧光可从充当内源荧光团的各种生物分子中检测到，并且可以提供有关病理生理状况的某些相关信息21。此外，细胞自发荧光光谱覆盖了大部分光谱范围，因为不同的内源荧光团发出不同的波长，例如黄素、NAD 和脂褐素在适当波长激发时分别发出绿光、蓝光和橙光22。

肝组织的内在特性与荧光光谱密切相关，试图评估代谢活动15,23。在这些特性中，我们可以重点关注 NADPH、黄素、蛋白质、具有芳香侧链的氨基酸和卟啉等生物分子24,25。因此，一旦目标细胞成分受到充分刺激，光谱学就有可能通过测量目标细胞成分发出的荧光来提供有关组织的重要信息。

因此，我们的主要目的是评估荧光光谱分析对实验模型中肝脏活力的适用性及其与部分肝切除术后24小时肝组织再生的关系。

作为次要目标，我们在低温条件下的实验模型中分析了 70% 部分肝切除术后剩余肝脏的肝再生，以验证激光照射是否可以改善再生过程。

方法
本研究使用来自医学院中央动物实验室（巴西圣保罗圣保罗大学）的雄性 Wistar 大鼠，体重约 300 克。将动物放置在适合物种的透明聚丙烯笼中，并用特定物种的食物和随意饮水维持，光照和黑暗间隔为12小时。

样本量根据凯利和麦克斯韦方法计算24。研究中的大鼠被随机分为四组。所有组的样品均置于装有 30 mL 静态保存液（SPS）-1（Belzer UW）的塑料瓶中，4°C 保存 24 小时（G4 除外，其样品保存在活体大鼠体内）。所有组中的一半动物 (n = 7) 接受激光 (+L) 照射。

G1：完全非灌注肝脏对照（TNPL，n = 14）：在不灌注 SPS-1 的情况下进行全肝切除术；

G2：全肝灌注（TPL，n = 14）：用SPS-1进行肝灌注，然后进行全肝切除；

G3：“异位”部分灌注肝切除术（PPH，n = 14）：用 SPS-1 进行肝灌注。然后，进行部分肝切除术，并将左外叶（相当于肝脏的30%）按照本研究方案放入塑料瓶中24小时；

G4：“原位”部分非灌注肝切除术（PNPH，n = 14）：进行部分肝切除术，动物中仅保留左侧叶（肝脏的 30％）。使大鼠存活 24 小时。

所有组中的动物均在圣保罗大学医学院中央动物实验室饲养和安乐死，并在那里采集样本用于进一步研究。

所有涉及动物实验的程序均按照实验动物护理和使用指南（1996 年，由国家科学院出版社出版）进行。动物研究方案得到了圣保罗大学当地伦理审查委员会的批准（研究方案编号 107/14；CEUA-FMUSP）。

外科手术
为了进行手术技术，所有动物均通过腹膜内注射（氯胺酮，25-50 mg/kg，与甲苯噻嗪 2-5 mg/kg 联合）以每体重 15 单位/100 g 的剂量进行麻醉。

根据希金斯和安德森的说法，Ph 达到 70%25。手术从腹部中线切口开始。此时，收集肝组织碎片进行组织学分析并保存在10%福尔马林缓冲液中（图。1）。

在 TPL 和 PPH 组中，通过静水压通过膈肌途径进入胸腔，用 Belzer UW 溶液进行肝灌注，然后用针导管（Abocath，Becton Dickinson Indústria Cirúrgica，巴西）穿刺左心室，22 号，连接到装有 250 mL 灌注溶液的液柱，Belzer UW，高 1.30 米，对应于约 90 mmHg 的压力。穿刺后，打开肝下腔静脉，最后进行灌注

一旦肝血换成Belzer UW溶液，就中断灌注，并进行全部或部分70%肝切除术。术中用纱布彻底清除血块，并严格止血。必要时用电刀进行烧灼。具体而言，对于PNPH组，用4-0尼龙缝合正中切口。

存活24小时的动物接受曲马多作为术后镇痛剂，并在手术伤口上涂抹10%聚维酮碘消毒液。

从全肝切除术和部分肝切除术中收集的肝碎片放入装有 30 mL Belzer UW 溶液的塑料瓶中，在 4°C 下放置 24 小时，以供以后分析。

通过肌肉注射致死剂量的麻醉剂（氯胺酮，25-50 mg/kg 与甲苯噻嗪 2-5 mg/kg）对动物实施安乐死。立即对动物进行尸检。

荧光测量
荧光测量按照 Castro e Silva 等人的方案进行。26使用由发射波长为532nm的双频Nd:YAG激光装置和发射波长为405nm的二极管激光器作为激发源组装的光谱系统。该系统有一个 Y 型研究探针（Ocean Optics，美国），带有两根 600 μM 光纤，一根提供荧光激光激发，另一根收集从目标组织重新发射的光。使用 550 nm 高通滤波器（OGG550，Schott，美国）在进入光谱仪进行 532 nm 激发之前去除反向散射光，并在 450 nm 处进行 405 nm 激发。

在两种不同波长下进行分析，第一个波长为 405 nm（紫色），第二个波长为 532 nm（绿色）。对于每个波长，对左侧叶进行四次测量，总共八次分析。我们进行了初步读数，称为内部对照，即在组织损伤之前对肝脏进行分析。接下来，我们对时间 0 小时 (T0) 进行了分析，并且在灌注 SPS-1 的组中，该读数发生在灌注之后、激光治疗应用之前。

实验 24 小时 (T24) 后，以相同的格式进行新的光谱分析。每组 14 只动物中，有 7 只在 T0 时接受了激光治疗的肝脏照射。

激光治疗
每组一半的动物（n = 7）用激光连续波（型号 BDP 660）照射，红光波长 660 nm，IIIb 类，连续发射可见光，低功率，具有半导体活性介质和熔融光纤传感器长度为 80 毫米，直径为 7 毫米，由 MM Optics（巴西圣保罗圣卡洛斯）生产，用于肝脏照射，连续 5 次照射激光，每次 60 秒（总共 300 秒），每次应用在肝脏的不同点。每个点都是任意选择的，但是一旦选择，所有受照射的肝脏都会遵循这种模式，将换能器的远端与肝脏表面接触（校准功率为 40 mW，能量密度剂量为 300 J） /厘米2），在生物组织中表现出高渗透性27,28。

荧光光谱数据分析
为了获取和存储波长，使用了与分光光度计耦合的笔记本电脑，所使用的软件是 OOIBase32.exe (Ocean Optics)。将所得数据导出到分析软件 (OriginPro 8) 进行编译、结果标准化并获取图形。

免疫组织化学
将福尔马林固定、石蜡包埋的组织切成 5 微米连续切片，用于 Ki67 抗原的免疫组织化学检测。通过用柠檬酸盐缓冲液加热切片，然后用 6% 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，在高压锅中进行抗原修复。然后将切片与无血清蛋白块（CAS Block，Invitrogen-008120）一起孵育以抑制非特异性结合，然后与针对 Ki67 的一抗（1:100；兔克隆 SP6 – ab 16667；Abcam，剑桥，英国）1小时。MACH 4聚合物（通用HRP聚合物检测系统，BIOCARE Medical-BRI4012）用于检测一抗。使用二氨基联苯胺（DAB；Sigma Chemical Corporation，圣路易斯，密苏里州，美国）作为色原完成染色过程。最后，

对阳性细胞数/40×（平均20个视野）进行定量，以定义免疫染色细胞的平均数。结果以细胞/mm 2表示，并将该数字除以0.159的值，0.159是40倍放大倍率下的显微镜视野的直径。

统计分析
获得的定量变量表示为中位数和四分位数范围。使用 GraphPad Prism 6 进行统计分析。Mann-Whitney 检验用于具有不对称分布的未配对变量。我们认为 p < 0.05 有统计学意义。

结果
细胞增殖
与 PNPH 组相比，PNPH +L 组中 Ki67 占主导地位（p = 0.02）。在 PPH 组中，与 PPH + L 相比，Ki67 水平升高。在 TNPL、TNPL +L、TPL 和 TPL +L 组中不存在这些差异

光谱分析
我们将 T0 时所有组的动物视为对照组。该组对分光光度计获得的荧光采集起到内参的作用。

对照组的分析显示荧光发射强度存在差异。当以 405 nm 的长度激发时，在 450–650 nm 之间观察到两个强烈的峰

讨论
自发荧光光谱是一种越来越多地被用作组织表征的技术潜力，具有诊断和治疗目的29。

组织对激光的吸收可产生光化学、光热、光机械和光电等四种基本效应，具体取决于所使用的波长及其穿透能力。治疗性激光可以激活或抑制生理、生化和代谢过程30。

因此，有几种生物分子参与代谢过程以及细胞和组织的组织学组织，其特征在于它们的荧光特性，并且可以探索以获得有关所研究器官的形态功能条件的信息31。

在对对照组的分析中，我们观察到当组织在 405 nm 长度处激发时，在 500 nm 和 620 nm 光谱范围内有两个强烈的峰。

此范围内的荧光光谱推断与组织中的生物事件相关的变化，因为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 等分子以及卟啉分别发出长度为 465、535 和 630-690 nm 的荧光32。

NADH 和 FAD 分子可以提供有关细胞和组织氧化还原状态的信息。另一方面，卟啉对应于血红蛋白中存在的化合物，例如杂环33。卟啉衍生物来自铁血红素的生物合成，存在于红细胞中，激发波长为 405 nm，发射波长为 630–690 nm，赋予它们紫色色素的天然特征25。

当我们比较分光光度计获得的信息时，该方法中使用的两个波长（405 和 532 nm）的荧光强度曲线存在重叠。所有组的光谱范围都在 400 至 700 nm 之间，在 24 小时内，无论是受到照射的动物还是未接受激光刺激的动物，光发射的峰值强度都较高。

这证实了文献中的数据，因为 DNA 分子和蛋白质是生物组织中主要的紫外线 (UV) 吸收发色团（200 至 400 nm），推断活跃的细胞活动34,35。

组织和血液的生化构成在很大程度上决定了荧光的光谱特性，因为血液是绿光（532 nm）的重要吸收体。也就是说，虽然幅度与吸收和穿透性有很大关系，但光谱的形状（例如峰和宽度）与相关器官的化学成分有关36。400-600 nm之间的光谱吸收范围与氧合血红蛋白、血红蛋白和黑色素有关37。

这些数据在 TNPL 和 PNPH 组中更为明显，这两个组都经历了手术应激，但只有后者的动物在手术后 24 小时内仍存活。在 PNPH 组的分光光度分析中，PNPH +L 亚组似乎有大幅增加。这可能是因为肝组织受到了损伤（70%），而肝切除术与增加细胞活性所需的肝营养因子得以维持有关。我们观察到，即使不以激光形式提供能量，细胞活性也会显着增加，并且在向剩余肝脏提供激光的情况下细胞活性得到优化。Ki67 分析似乎证实了分光光度计数据，显示这些亚组之间存在显着差异 (p = 0.02)。

因此，我们可以推断，通过激光刺激部分肝切除术后的组织，会产生促进组织再生的生物刺激作用，因为Ki67是一种与细胞周期相关的核蛋白，由所有增殖细胞合成。一些研究报告称，除了胶原蛋白合成之外，低强度激光治疗的作用是与线粒体信号传导、细胞结合、细胞增殖和分化相关的众多基因相关的潜在因素。38,39。

巴博萨等人。40表明在暴露于低密度激光后 24 小时内，ATP 的产生显着增加。此外，一些作者证明，激光治疗的应用可以增加不同级别肝切除术后RL的有丝分裂指数和线粒体功能21,41。

在PPH组中，荧光分光光度分析显示各组之间的光谱存在差异。Ki67 分析似乎与光谱学结果相符，具有统计显着性差异 (p = 0.002)。显然，PPH +L 亚组中的细胞活性下降，尽管存在肝损伤，因为肝脏样本被 SPS-1 淹没，因此不含保肝因子。因为该组以激光的形式接收到过剩的能量，显然，只有当其细胞活动受到代谢作用的刺激、受到宿主的血液和门静脉压力的影响时，肝组织才会增加。

另一方面，TPL 组不受血液或宿主的影响。因此，它不会接受通常来自它们的促肝刺激。血液完全被SPS-1替代，没有组织损伤。分光光度数据显然表明，无论有或没有激光刺激，两组都非常相似，表明仅提供额外的能量（激光）不足以实现明显的肝脏再生。

一般来说，荧光光谱和 Ki67 分析的数据显示出相同的结果模式，增殖活性的增加与吸光度的强度成正比，表明分光光度鉴定的质量，因此我们可以说与分析的黄金标准 Ki67 相比，我们保持了一致的标准。

结论
迄今为止提供的数据是有希望的，因为荧光光谱分析显然可以用于实时分析细胞活性和活力的特征。第二个方面，我们还可以推断在存活的动物组和低温保存的样本中都存在代谢活动，从而推断即使在24小时后的血液剥夺和低温条件下，也存在一些细胞活动。当我们维持与应用组织损伤相关的肝营养因子时，以激光形式向肝组织提供能量似乎会增加代谢活动，从而增加再生过程。