介绍
外科医生经常对患有多种疾病的患者进行临时结肠造口手术。然而，在许多此类患者中，由于情况不同，肠道运输从未恢
复，导致临时造口变成永久性造口1。永久性造口生活极大地影响了这些患者的生活质量1。除了造口存在带来的限制外，
大多数患者的结肠段出现一系列代谢、组织学和分子变化，被排除在粪便转运之外，称为改道性结肠炎 (DC)2。

Morson 和 Dawson 于 1974 年首次描述了排除粪便运输的结肠段粘膜炎症的发展3。这种新形式的结肠炎被遗忘了近十年
，直到 1981 年 Glotzer 等人。4详细描述了 10 名患者的疾病，这些患者既往没有炎症性疾病，但在排除的部位出现炎
症，其中 5 名患者由于粪便运输恢复而炎症可逆转。随后，一系列临床和实验研究表明，决定结肠粘膜炎症过程的分子机
制与主要能量来源短链脂肪酸（SCFA）的缺乏有关，更具体地说，丁酸，用于构成结肠腺的细胞5,6。

SCFA 定期供应的减少会导致上皮细胞改变其新陈代谢并开始使用替代能源7,8。这种代谢改变会引发活性氧和活性氮
（RONS）的过量产生。(RONS)，对构成结肠上皮的细胞有毒，导致结肠上皮屏障的破坏。

结肠上皮是人体最具功能性的屏障之一。它仅由一层并列细胞组成，并被专门的粘液层覆盖，形成了防止肠道微生物群中
存在的病原体渗透的第一道保护线。只要维持蛋白质合成的能量供应，覆盖结肠上皮的粘液层就会由杯状细胞不断产生。
然而，在能量供应不足的情况下，例如直流电，其最重要的组成糖蛋白的产量大大减少9,10。

覆盖肠上皮的粘液由称为粘蛋白的糖蛋白组成11。粘蛋白分子由碳水化合物和蛋白质部分组成12。根据其葡萄糖部分中是
否存在糖原或唾液酸，粘蛋白分别细分为中性或酸性粘蛋白。中性粘蛋白主要存在于消化道的颅骨部分，而酸性粘蛋白主
要存在于远端结肠。根据是否存在唾液酸或硫酸基团，酸性粘蛋白又分为唾液酸粘蛋白和磺基粘蛋白。唾液酸粘蛋白根据
唾液酸衍生的 N-乙酰基或 O-乙酰基分子的比例进行表征13,14。SCFA 供应的缺乏，除了杯状细胞合成粘蛋白的能力显着
降低之外，还会增加 RONS 的形成。这些自由基破坏覆盖上皮屏障的粘液层并诱导肠腺中的杯状细胞凋亡，引发并加剧 DC
特有的炎症过程15,16。

研究利用实验性 DC 模型评估了具有抗氧化作用的不同物质用于治疗 DC 的用途。其中，直肠内应用含有n-乙酰半胱氨酸
（NAC）或硫糖铝（SCF）的灌肠剂显示出希望17 号,18。这两种物质都能降低被排除结肠粘膜的氧化应激水平，抑制炎症
过程，促进上皮愈合17 号-20。尽管NAC具有显着的抗氧化作用，但由于其与结肠粘膜的粘附能力较低，NAC需要连续灌肠
，这使得其使用不切实际18,19。相比之下，SCF除了刺激杯状细胞产生粘蛋白外，还可以有效地粘附在发炎的结肠粘膜上
17 号,21,22。SCF 牢固地粘附在粘膜上，在发炎表面形成凝胶状屏障。结果表明，SCF 的应用可增加排除粪便运输的结肠
上皮中粘蛋白的产生，减少炎症过程，并促进粘膜愈合21,22。其高粘合能力具有减少每天多次涂抹的需求的额外优势
22,23。然而，与 NAC 相比，SCF 的抗氧化作用较低20,24,25。

鉴于证据表明这两种物质具有互补特性，本研究旨在评估含有这两种物质的灌肠剂的应用是否能够减少炎症过程并增加覆
盖被排除的结肠上皮的不同粘蛋白亚型的产生。

方法
道德声明
本研究遵循联邦法律第 11,794 号的建议和巴西动物实验学院的指导方针。该研究项目已提交给圣弗朗西斯科大学动物研
究伦理委员会，批准号为001.226.2014。

转流性结肠炎诱导组和实验组
2019年12月至2020年1月，将64只雄性Wistar大鼠，体重在300至350克之间，年龄在4至5个月之间，在控制温度、光照、湿
度和噪音条件的空调环境中单独饲养在笼中7天。几天的时间来适应圣弗朗西斯科大学的中央动物设施。实验期间，所有动
物均饲喂适合啮齿类动物的饮食（Navilab CR1，Nuvital Nutrientes S/A，科伦坡，波多黎各，巴西）并每周称重。肠道
绕道手术前一天，小鼠禁食 12 小时，但仍能喝水。

麻醉采用2%盐酸赛拉嗪（Anasedan Agribrands do Brasil Ltda.，巴西）+盐酸氯胺酮（DopalenAgribrands do Brasil
Ltda.，巴西），腹腔注射剂量0.1 mL/100 g。将整个腹部前部区域剃毛后，使用 4 厘米纵向正中脐下切口进入腹腔。打
开腹腔后，鉴定出派尔氏补片（Peyer's patch），这是一种位于大肠前壁的淋巴结构，用于修复结肠部分。结扎并切断结
肠旁边缘动脉后，在派尔氏淋巴集结颅端上方 8 厘米处将结肠切片。在此部位，切除一段 2 厘米的大肠，形成白色组（
保留粪便转运的绞痛段）。收集对照结肠段后，对腹壁左侧的近端结肠进行末端结肠造口术。用松散结扎线固定的 10F 聚
乙烯探针插入切开的大肠远端段，并在 37°C 下用 40 mL 0.9% 盐水溶液冲洗，直至动物肛门的流出液不再含有粪便残留
。在此阶段结束时，远端结肠被重定向到左髂窝作为远端粘液瘘。然后用两种缝合线闭合腹壁。麻醉苏醒后，让动物喝水
，6小时后，给它们喂食。

将 64 只动物分为两个实验组，每组 32 只动物，每天用建议的物质灌肠，持续两周或四个星期。根据所使用的干预物质
，这两组中的每组又分为四个亚组，每组包含八只动物。因此，对32只动物进行每日0.9％生理盐水(FS)灌肠；SCF 2克/公
斤/天；NAC 100 毫克/公斤/天；SCF 2 g/kg/天+NAC 100 mg/kg/天持续两周，其余32只小鼠用相同物质、相同剂量治疗4
周。

材料收集和安乐死
在预定安乐死的日期（两周或四个星期），用之前描述的相同技术再次麻醉动物。从结肠取出的未经粪便转运的样本进行
干预，通过肠后边界纵向打开。取出长度为 2 cm 的排除结肠碎片，并将粘膜表面朝上固定在软木碎片上。然后将它们分
别放入预先标有动物编号和所属实验组的单独塑料瓶中，并装有10%缓冲甲醛溶液进行固定。

对动物的安乐死遵循巴西动物实验学院和联邦兽医委员会的指导方针，并通过心内注射致死剂量的硫喷妥钠（120 mg/kg）
对动物进行麻醉。动物死亡的证据是没有生命体征，例如心跳和角膜眼睑反射丧失。

组织学技术
将结肠段放入含有 10% 缓冲甲醛溶液（Sigma, St. Louis, MO, United States of America）的瓶子中并保存 72 小时。
当固定过程完成后，将它们取出，用蒸馏水洗涤，并用乙醇和二甲苯溶液脱水。然后，将它们包埋在石蜡中。石蜡块准备
好后，用切片机纵向切成5μm的厚度用于染色。

苏木精-伊红（HE）染色技术用于识别结肠炎的存在并对炎症评分进行分级。使用马森三色染色评估组织中的胶原蛋白水平
。为了鉴定中性粘蛋白，使用高碘酸希夫（PAS）染色技术。使用阿尔新蓝技术对酸性粘蛋白进行染色，并使用高阿尔新蓝
铁二胺 (HIDAB) 技术来区分酸性粘蛋白、磺基粘蛋白和唾液酸粘蛋白的亚型，如前所述14,16。

组织学切片分析
为了对炎症程度进行组织学评估，载玻片由一位在结直肠疾病方面经验丰富的病理学家进行评估，该病理学家对材料的来
源和研究目的不知情。始终在最终放大倍数为 200 倍的普通光学显微镜下观察载玻片。

为了标准化感兴趣的区域，始终在肛管上方 5 厘米的同一位置对载玻片进行分析。用于评估组织炎症程度的变量是上皮表
面损失（上皮溃疡）、绞痛隐窝脓肿、炎症浸润强度和上皮纤维化的存在，其中前三个根据以下内容分层成十字。类别：

0：无变化；

+：光；

++：中等；

+++：强烈。

组织纤维化的强度通过马森三色染色确定的总组织胶原水平进行评估，并根据在研究的组织学领域中发现的百分比进行分
层，根据以下类别：

0：无纤维化；

1：纤维化≥1且≤5%；

2：纤维化>5且≤10%；

3：纤维化>10%。

每只动物的最终值是对所有分析变量的三个不同组织学区域进行量化后的平均值。

计算机辅助图像分析
通过计算机辅助图像分析（计算形态测定法）测量中性粘蛋白、酸性粘蛋白、磺基粘蛋白和唾液酸粘蛋白的组织水平。对
于每只动物，在三个不同的组织学区域中对组织蛋白水平进行定量，其中至少有三个完整且连续的结肠腺。选定的图像在
适当聚焦后，由与光学显微镜（Elipse-50i，尼康仪器公司，日本）耦合的摄像机（DS-Fi，尼康仪器公司，日本）捕获。
然后使用安装在具有适当图像处理能力的计算机上的 NIS-Elements 软件（日本 Nikon Instruments）对捕获的图像进行
处理和分析。

程序中，洋红色染色代表中性粘蛋白的组织表达，蓝色染色代表酸性粘蛋白和唾液酸粘蛋白（通过HIDAB染色鉴定）的组织
表达，棕色染色代表磺基粘蛋白（也通过HIDAB染色鉴定）的组织表达，被白色取代，而剩余的视野则以黑白捕捉，形成二
值图像。图像分析程序自动计算黑色总组织学视野中存在多少白色像素。所研究的糖蛋白的组织水平的值始终表示为每个
分析区域的像素（所研究的蛋白质）的百分比（%/区域）。属于对照组和实验组的动物的最终值始终由平均值表示，

统计方法
数据表示为平均值±平均值的标准误差。T检验用于评价体重的变化。Mann-Whitney 检验用于以配对方式比较炎症等级评
分以及中性粘蛋白、酸性粘蛋白、磺基粘蛋白和唾液酸粘蛋白的组织水平。对于所有检验，均使用 5% (p ￡ 0.05) 的显
着性水平。同一时期（两周或四周）不同物质干预结果比较的显着值，当显着性水平低于5%时用*标记，当显着性水平小于
1时用**标记%。Kruskal-Wallis 检验用于分析每个实验组中发现的结果相对于干预时间（两周或四个星期）的差异。Dunn
的后检验用于验证方差分析中各组之间的显着性。各实验组干预时间的统计评估也以配对方式进行。比较用不同物质处理
的动物的干预期（两周或四周）时的显着值，当显着性水平低于 5% 时，用 ? 标记；当显着性水平低于 1% 时，用 ?? 标
记。

结果
图表显示了在相同的干预时间内（两周或四个星期）干预组和对照组之间的配对比较。每张图后面的表格显示了使用含有
相同干预溶液（空白、对照、SCF、NAC、SCF+NAC）的灌肠剂所发现的结果随干预时间的变化。

图2显示了不同实验亚组在所考虑的两个干预时间（两周或四周）的炎症评分值的平均值以及各自的标准误差。无论干预时
间如何，与接受含有 0.9% 盐水的灌肠剂的动物相比，接受含有 SCF、NAC 和 SCF+NAC 的灌肠剂的动物表现出较低的炎症
评分。

讨论
覆盖结肠上皮的粘液层是抵御多种炎症性肠病发展的第一道防线。对结肠上皮粘液层和机械屏障的更深入了解近年来引起
了科学界的关注26。随着肠道菌群与肠上皮之间关系中涉及的新因素的发现，粘液层所发挥的作用变得越来越重要26。

覆盖肠粘膜的粘液具有双层结构27。第一层牢固地粘附在粘膜上皮上，而第二层叠加在第一层上，可以很容易地从上皮表
面去除28。这种双层主要由粘蛋白形成，粘蛋白是一类负责保护功能的糖蛋白29,30。根据其分子葡萄糖分数，胃肠道中发
现的粘蛋白主要分为两大类：中性粘蛋白，富含糖原，酸性粘蛋白，富含唾液酸11。酸性粘蛋白有两种主要亚型：富含硫
酸根的磺基粘蛋白和唾液酸水平较高的唾液酸粘蛋白。唾液粘蛋白??更常见于结肠和直肠，而磺基粘蛋白则常见于近端结
肠11,13。当考虑粘蛋白的蛋白质部分时，它们被分为两大类：分泌时形成覆盖粘膜的凝胶的那些（MUC-2、MUC-5AC、
MUC-5B和MUC-6）和那些存在的在膜中（MUC-1、MUC-3 和 MUC-4）31。

向粘膜细胞供应 SCFA，特别是丁酸对于粘蛋白蛋白片段转录相关基因的表达至关重要32,33。研究表明，在所有临床情况
下，结肠上皮中的粘蛋白合成都会减少，从而减少了对结肠粘膜上皮细胞的 SCFA 供应34,35。因此，在排除肠道转运的结
肠段中，粘蛋白的合成减少，很可能是由于组成必需糖蛋白的葡萄糖和蛋白质部分减少6,32,33,36,37。

20世纪90年代利用简单剥夺大肠粘膜细胞SCFA供应诱发的结肠炎模型进行的实验研究表明，粘蛋白的组织分布和表达水平
发生了重要变化11,29,31,36,38。当缺乏常规 SCFA 供应时，结肠腺杯状细胞中粘蛋白葡萄糖和蛋白质组分的合成显着减
少11,13,31。结果，上皮防御的第一道线发生变化，使其容易受到结肠腔中病原体的作用。

科利等人。36是第一批研究排除粪便运输的大肠段中酸性粘蛋白表达模式和水平变化的作者。在这项开创性的研究中，作
者评估了大鼠粘蛋白的表达模式和水平，比较了肠道转运中包含和排除的片段。他们发现，在被排除在粪便运输之外的部
分中，酸性粘蛋白的两种亚型水平均有所降低，此外，随着被排除的结肠中炎症过程的恶化，唾液酸粘蛋白也会消失。然
而，值得注意的是，在这项研究中，组织水平是主观评估的，当作者进行旁路时，没有对排除转运的结肠进行机械准备36
。

诺诺斯等人。11旨在评估粘蛋白合成中 SCFA 定期供应的缺乏，通过比较 6、12 和 18 周内包含和不包含在粪便中的结肠
段来评估粘蛋白缩水甘油部分的水平。作者仔细清洗了从粪便转运中排除的结肠段，以确保粪便残留物以及 SCFA 不会出
现在排除的结直肠段中。作者还使用复杂的计算机辅助图像分析系统来测量主要粘蛋白亚型的水平。他们发现，与保留粪
便转运的结肠段相比，没有 SCFA 供应的结肠中中性和酸性粘蛋白的组织水平显着降低11。该小组后来证实了这些发现，
表明酸性粘蛋白水平的降低主要是由于唾液酸粘蛋白合成的减少13。

实验研究表明，其他因素可能会导致缺乏 SCFA 定期供应的结肠中粘蛋白水平降低。SCFA 缺乏会引发排除结肠段的炎症
39,40。粘膜炎症过程已被证明与细胞代谢的变化有关，而细胞代谢的变化是由于粪便转运的转移而导致缺乏短链脂肪酸
(SCFA) 的定期供应所造成的。8,39,41-48。这种缺陷导致β-氧化机制发生重要变化，以产生供应细胞周期不同阶段所需
的能量7,39,46,49,50。因此，结肠粘膜细胞改变线粒体机制来获取能量，形成大量的RONS48。RONS 的过量产生以及结肠
粘膜中存在的抗氧化系统的缺陷决定了组织氧化应激39,51。

一系列临床和实验研究表明，由于SCFA供应不足而导致的RONS产量增加是导致构成结肠上皮功能屏障的不同成分分解的主
要机制之一16,39,48。这种功能障碍是引发炎症性肠病的最初分子机制的最新解释之一，即自由基诱发结肠炎的理论48。
鉴于这一证据，一系列实验研究表明自由基诱导结肠炎也可以解释 DC 的发病机制11,13,31,52-55。

一系列实验研究支持了氧化应激是 DC 形成机制的可能性，这些研究表明，施用具有抗氧化活性的物质除了降低组织氧化
应激水平外，还可以减轻粘膜炎症并重建完整性。形成上皮屏障粘液层的不同蛋白质17 号-22,25,52,56-59。

在测试的物质中，NAC被证明在减少组织氧化应激和减轻排除结肠段的炎症方面非常有效18。使用含有 NAC 的灌肠剂进行
的实验研究表明，该物质能够显着降低 RONS 的组织水平并逆转结肠粘膜的炎症变化。18,59。然而，由于NAC对发炎的上
皮表面的粘附能力较低，因此需要每天重复灌肠，导致其在临床实践中的使用困难，因为每天需要重复灌肠多次24。为了
解决这个问题，可以联合使用对发炎粘膜表面具有高粘附能力的 SCF。因此，可以减少频繁灌肠的需要24。

SCF 是一种用于治疗影响胃肠道的不同疾病的物质。其主要作用机制与其强大的牢固粘附于发炎粘膜表面的能力有关。
18,19,21,22。SCF被认为是一种细胞保护剂，最初用于预防或治疗消化性溃疡、胃粘膜急性病变和慢性皮肤伤口25。除了
具有抗菌、抗炎、特别是抗氧化活性外，它还具有显着的增加前列腺素 E2 产生、刺激粘蛋白产生、增加上皮生长因子合
成和诱导粘膜病变愈合的能力12,17 号,25。

一系列实验研究表明，在被排除在肠道运输之外、产生DC的结肠段中应用含有SCF的灌肠剂可以改善粘膜炎症过程，降低组
织氧化应激的严重程度，刺激不同粘蛋白亚型的产生，并恢复粘膜完整性。细胞间连接机制17 号,21,22,23,25。尽管它对
发炎的结肠粘膜表面具有很强的粘附能力，但其抗氧化作用并不具有与 NAC 相同的效力18。

考虑到 NAC 出色的抗氧化活性和 SCF 粘附发炎结肠粘膜的强大能力，也许两种物质联合使用比单独使用含有两种物质的
灌肠剂更有效12,18,21,22,25。然而，回顾文献，迄今为止，尚未发现研究评估同时含有NAC和SCF的灌肠剂对保留DC排除
粪便转运的结肠段粘蛋白水平的影响。如果该制剂可以增加或至少保持排除的发炎粘膜中不同粘蛋白亚型的水平，则这将
是两种物质的组合可能有益于治疗或预防 DC 的初步证据。

本研究的结果表明，无论干预时间如何，每日应用含有SCF、NAC或SCF+NAC的灌肠剂都能够降低结肠粘膜的炎症评分强度，
而无需经过肠道。与接受仅含盐水的灌肠剂的动物相比，两种物质的组合显着减少了炎症过程，尽管与单独使用每种物质
相比，这种差异并不更大。这些发现证实了之前的研究表明这两种物质在改善被排除结肠粘膜炎症过程方面的功效17
号,18,21,22。

在分析灌肠对接受 SCF+NAC 干预的动物中性粘蛋白组织水平的影响时，发现无论干预时间如何，中性粘蛋白水平均显着增
加。这些发现表明两种物质之间存在协同作用。这种效应可能与排除粪便运输的结肠段粘膜组织氧化应激的更大程度减少
有关，正如之前在类似于本研究中使用的 DC 模型中所证明的那样18,20,21,22。SCF 粘附结肠粘膜的能力更强，可能会延
长药物（尤其是 NAC）在结肠粘膜中的作用时间，并且这种较长的作用也有助于更大程度地去除 RONS，因此，导致最小化
破坏产生的粘蛋白。此外，当测量灌肠治疗后的总酸性粘蛋白水平时，发现接受SCF+NAC干预的动物中，无论干预时间如何
，排除粪便运输的结肠中的酸性粘蛋白水平显着增加。

在分析酸性粘蛋白亚型时，发现结肠组织中保留粪便转运的片段中的磺基粘蛋白水平较高。这些发现可能反映了定期供应
SCFA 对于合成这种粘蛋白亚型的重要性。当比较接受盐水、SCF、NAC或与NAC相关的SCF的动物中的磺粘蛋白水平时，发现
无论这些物质是单独使用还是组合使用，磺粘蛋白水平均显着增加，无论这些物质如何干预时间。有趣的是，无论灌肠中
使用什么物质，磺粘蛋白水平都会随着时间的推移而下降。干预前两周磺粘蛋白水平较高可能与这些物质引起的氧化应激
水平降低以及结肠粘膜细胞合成磺粘蛋白的剩余能力有关。先前在进行两周的 SCF 干预时也描述过类似的结果22。

当量化唾液酸粘蛋白的组织水平时，值得注意的是，与单独使用这些物质相比，使用含有 SCF+NAC 的灌肠剂在维持唾液酸
粘蛋白水平方面更有效。这些发现可能与两种物质联合使用时更强的抗氧化活性以及药物与排除结肠粘膜接触的持久性更
强有关。

应该指出的是，这项研究有其局限性。这是一项实验研究，其结果不能总是推断到人类身上。此外，出于伦理原因，实验
组由少量动物组成，这增加了DC实验模型中粘蛋白亚型组织水平出现I型错误的机会。据我们所知，尚无研究量化 DC 患者
或接受两种药物联合治疗的个体结肠中粘蛋白亚型的组织水平。尽管如此，SCF 和 NAC 都是容易获得、成本低廉的物质，
并且它们在人类中的使用已得到全球主要卫生机构的授权。这两种物质均可安全用于人类，且副作用较小。

结论
在本研究中使用的 DC 模型中，SCF 和 NAC 的组合减少了炎症过程，并增加了排除肠道转运的结肠段腺体中存在的不同粘
蛋白缩水甘油组分的水平。