介绍
已经提出了几种治疗伤口的策略，旨在协助组织修复，其中包括聚合物、植物提取物、物理敷料、激光、高压氧、真皮基
质、负压疗法、强力霉素、米诺环素和藻酸盐1-5。然而，尽管目前市面上有多种类型的敷料，但仍然没有一种产品被认为
是伤口治疗的黄金标准，特别是对于复杂的慢性伤口4，往往缺乏有效的治疗6-8。

一种产品要想被认为能有效治疗伤口，必须易于去除、为患者提供舒适感、不需要频繁更换、具有成本效益、改善表皮迁
移、诱导血管形成和结缔组织合成，提供或保持创面理想的湿度和病灶周边的干燥和保护，使用方便，适应身体的不同部
位4,6-8。此外，除了限制炎症反应、坏死、病变进展和疤痕大小之外，潮湿的伤口环境对于诱导生理愈合的理想环境也很
重要9,10。

然而，没有药物能够满足慢性损伤理想治疗的所有必要标准11,12。因此，流行的药用文化已被用作植物源药物的来源13。
在这种背景下，乳胶脱颖而出。据估计，有 12 至 35000 种泌乳物种，但只有少数物种的药理学重要性得到了评估14,15
。其中，最受探索和了解的是橡胶树，从中提取的乳胶具有血管生成和愈合特性。最近，一些报告表明，一些乳汁植物，
尤其是巴西本土植物Hancornia spiosa，具有促进伤口愈合的重要特性15-18。

H. spiosa的乳胶可用于治疗外伤、炎症、腹泻、肺结核、溃疡、疱疹，其叶茶可用于治疗月经痉挛18。此外，它还用于治
疗炎症性疾病、高血压、皮炎、肝病、糖尿病和胃病19。H. spiosa叶子含有有助于控制血压变化的化合物20和糖尿病21。
此外，在体外伤口愈合论文中，叶子的乙醇提取物促进了细胞迁移和成纤维细胞增殖的增加22，而在体内论文中它显示出
抗炎作用23并且不具有细胞毒性或基因毒性24,25。

从H. spiosa乳胶中获得的生物膜具有血管生成作用25和成骨潜力26,27，协助伤口愈合。这些生物膜可以将抗菌药物纳入
其基质中，以受控方式释放它们，从而实现血管生成、抗炎和抗菌特性的结合28。此外，在乳胶中掺入银纳米颗粒可以抑
制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，但不会损害炎症和组织修复过程16。

最近，从H. spiosa乳胶中开发出一种用于伤口愈合的大孔生物膜，并获得专利“基于乳胶的大孔生物膜，用作伤口愈合过
程中的敷料”，编号 BR 10 2019 003829 229。本研究旨在描述和比较接受大孔生物膜治疗的大鼠切除伤口的清创和愈合
效果。

方法
大孔生物膜的制备
该生物膜是由巴西戈亚斯州伊帕梅里市戈亚斯大学实验站收集的乳胶制成的。从切口处收集乳胶30在树皮中并储存在无菌
容器中。切口长约10厘米，深约0.5厘米。将收集的乳胶以 1:1 的比例（水：乳胶）稀释在纯净水中，以防止凝结。然后
，在4℃下以3,000g离心5分钟。将 10 mL 上清液放入培养皿（直径 10.00 ± 0.05 cm）中，并在 45°C 下孵育直至完全
聚合（72 小时）。随后，将获得的生物膜切割成2×2厘米的尺寸，使用金属插管穿孔形成直径2毫米的孔，如专利“用于
伤口愈合过程中用作敷料的乳胶基大孔生物膜”中所述。编号 BR 10 2019 003829 229。最后，将其包装在手术级纸中，
并在巴西圣保罗州能源与核研究所 (IPEN) 通过 Gammacell 220 钴 (Co60) 源进行伽马辐射灭菌，剂量为 25 kGy25。然
后，它可用于伤口愈合测定。

道德考虑
本研究是在获得戈亚斯天主教大学动物使用伦理委员会批准后根据伦理标准进行的（议定书 16-01），并遵循国家动物实
验控制委员会制定的指南中确定的规定31,32。每个笼子里关着三只动物，以维持它们的健康，并用封闭敷料来保护伤口。
笼子由聚丙烯制成，内衬木屑，每周清洁两次。这些动物之前已经适应了环境。光度、温度、噪声强度、空气相对湿度均
为一般环境。向动物随意提供该物种的水和商业口粮。

实验组
为了完成这项研究，使用了 43 只雄性褐家鼠，其年龄为 2-3 个月，实验开始时体重在 200 至 300 克之间。其中，40只
动物根据治疗被随机分配至各组：

G1：对照组，接受0.9% NaCl处理，20只；

G2：试验组，采用大孔生物膜处理，20只动物。

为了分析所提出的参数，每个实验组的 5 只动物在损伤诱导 (DAI) 后 3 天、7 天、14 天和 21 天被安乐死，以对受伤
区域进行形态测量和解剖病理学分析。还对三只动物进行了额外的测试，以分析大孔生物膜的清创效果。

切除病变诱导、清洁和治疗
最初，对动物进行称重，并用剂量为 1 mL/kg 的 10% 氯胺酮和 2% 赛拉嗪溶液（注射剂 Dopalen Sespo Indústria e
Comércio，巴西；和 Xilazin，Syntec do Brasil）腹膜内麻醉。还用盐水润滑眼睛以防止角膜溃疡。麻醉后，将动物置
于俯卧位。用浸有70％乙醇的纱布对受伤部位进行三分法和消毒。使用面积为 2 × 2 厘米的丙烯酸模具和一支笔来定义
受伤区域。通过用手术刀进行浅表切口诱导病变，然后将切口加深至皮肤极限，而不损伤肌肉组织。随后，借助手术刀和
剪刀轻轻去除组织碎片（±1.5毫米），保存肉膜。用浸有盐水（NaCl 0.9%）的无菌纱布清洁病变区域。

程序执行如下：

G1 用浸有盐水（0.9% NaCl）的纱布清洁受伤部位。每天重复该程序，直至损伤诱导后 21 天（图。1）。

G2在损伤诱导后立即用浸有盐水（0.9％氯化钠）的纱布清洁伤口，并将大孔生物膜放置在伤口顶部，以便用膜覆盖整个损
伤区域，而不跨越损伤边界。损伤诱导后最多 21 天每三天更换一次膜（图。1）。生物膜变化的周期性是根据观察到的敷
料饱和度来确定的，这被认为是敷料的良好特性，因为对损伤的操作较少，对动物造成的疼痛和压力较小。

在整个实验过程中，伤口受到封闭敷料的保护，以保持伤口湿润、闭合并防止笼中其他动物造成的额外伤害。这种敷料的
成分是摩尔人织物的毯子，因此它覆盖了动物的整个背部，侧面有绑带，根据群体的不同而变化。受伤后，在规定的日子
里，立即用浸有盐水（0.9％氯化钠）的无菌纱布清洁伤口，并按组进行治疗。

安乐死的程序
在实验第 3、7、14 和 21 天，以 120 mg/kg 的剂量腹腔注射 2.5% 硫喷妥钠（Thiopentax，Cristália Produtos
Químicos Farmacêuticos，巴西）对动物实施安乐死。33然后，使用索尼 Cyber??-shot DSC-H300 相机（Sony）将动物放
在板上进行照相记录。然后使用手术刀、剪刀和剪刀从病变区域去除皮肤和皮下组织碎片。使用镊子，保留肌肉平面，将
碎片固定在 10% 缓冲甲醛中。

宏观分析
在所提议的实验日评估伤口愈合阶段，如下所述：在第 3 天评估炎症阶段，在第 7 天评估增殖阶段，在第 14 天和第 21
天评估成熟阶段。受伤照片允许根据以下标准以半定量方式分析结痂的存在：不存在、谨慎（涉及高达 25% 的面积）、中
等（从 26% 到 50% 的面积）区域），并强调（超过 50% 的区域）。

这些照片是在安乐死后使用三脚架在距动物 20 厘米处拍摄的。此外，宏观图像还附带一个刻度，可以校准所有测量参数
。将照片传输至计算机并使用 Image J 1.3.1 软件进行分析。为了确定伤口区域的收缩程度，奥利维拉等人提出的公式。

显微分析
Luna 表示，每个伤口的碎片都固定在 10% 缓冲甲醛中，经过处理并用苏木精和伊红 (HE) 染色。35，用于组织学评估。
分析了真皮中的以下一般病理过程：坏死/结痂（通过细胞碎片的形态和观察来识别）、纤维蛋白、炎性多形核浸润和单核
浸润（通过细胞形态、血管定量、成纤维细胞和细胞形态）来识别。基质沉积。根据以下标准，以半定量方式对这些方面
进行分类： 不存在（得分 = 0）；谨慎（得分 = 1），损害面积高达 25%；中度（分数 = 2），面积损伤范围为 26% 至
50%；并在面积损伤的 50% 以上加重（分数 = 3）36。

统计分析
使用Sigma Stat 2.3软件进行统计分析。所有变量均经过正态分布和同质方差检验。当数据分布呈正态时，采用参数检验
，如T检验。当数据分布不正常时，使用非参数检验，例如曼-惠特尼检验。当 p < 0.05 时，观察到的差异被认为是显着
的。

结果
伤口收缩及宏观分析
在第 3、7 和 21 DAI 时，G2 的伤口收缩显着高于 G1 (p < 0.05)。在 21 DAI 时，可以观察到两个研究组中 80% 的伤
口完全闭合

清创试验
为了确认 G2 中观察到的清创效果，进行了一项额外的测试，以验证该材料在一致且粘附牢固的结皮上的使用。为此，对
动物 (n = 3) 进行标准损伤程序，并用盐水 (NaCl 0.9%) 清洁伤口，直至形成结痂。八点 DAI（图4a )，大孔生物膜应
用三天。可见整个痂皮已清创，病灶较小，无坏死，肉芽组织明显。如图。4b）。

显微分析
在炎症阶段，在三个 DAI 时，G2 的坏死和多形核细胞浸润强度低于 G1（p < 0.05）

在增殖期，在第 7 个 DAI 时，与 G1 相比，G2 中的坏死、多形核浸润和成纤维细胞强度较低 (p < 0.05)。此外，与 G1
相比，G2 生物膜组呈现出更高的血管量化强度 (p < 0.05)（表 3和图5）。

在成熟阶段，在 14 DAI 时，与 G1 相比，G2 中的血管量化强度较低。在 21 DAI 时，与 G1 相比，G2 中成纤维细胞的
强度较低 (p < 0.05)（表 3和图5）。

在整个实验期间，实验组之间的纤维蛋白和胶原蛋白分析没有显着差异（数据未显示）。

讨论
本研究对 Wistar 大鼠实验诱导的切除伤口的愈合进行了评估，使用H. spiosa大孔乳胶生物膜作为治疗，与仅用盐水（氯
化钠 0.9%）清洁的对照组进行比较。

关于本研究中使用的H. spiosa生物膜的物理化学特征，之前发表了不同的分析。就其成分而言，H. spiosa乳胶与其他乳
胶没有显着差异，是水性多分散体系，含有约 50% 的水、40-45% 的橡胶分子重量（主要成分是顺式 1,4-聚异戊二烯）和
4-5% 重量的非橡胶成分（蛋白质、脂肪酸、碳水化合物和糖）37。关于非橡胶成分， H. spiosa乳胶的低蛋白质含量可能
是其非过敏性潜力的原因27,37。

此外，植物化学表征还鉴定出H. spiosa乳胶成分中的绿原酸、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、儿茶素和原花青素17 号,26。绿原
酸具有抗氧化、抗突变和抗炎活性，可以调节与伤口愈合相关的代谢途径17 号,26。

在物理特性方面，H. spiosa生物膜具有弹性体行为，具有良好的弹性、低机械滞后性和高伸长能力27。灵活性是伤口愈合
敷料开发的一个理想特性，因为敷料可以根据损伤床进行调整。此外，H. spiosa生物膜表面含有微米孔2，允许营养渗透
、细胞粘附、骨骼粘附等27。观察到通过膜制备方法可以控制孔隙率和微孔尺寸38。由于渗透率随着孔径的增加而增加39
，毫米级的大孔可以促进液体从伤口渗漏。这使得伤口保持在潮湿的环境中，但没有过多的渗出物。

然后，除了生物膜表面天然存在的微孔之外，本研究中使用的生物膜被机械穿孔以获得直径2毫米的大孔。所有这些H.
spiosa生物膜特性表明，乳胶是一种有前途的伤口愈合生物材料，因为它能刺激血管形成并对有机组织具有生物相容性
16,17 号,25,27。本研究的结果是通过对一般宏观和微观病理过程的分析来论证的。

在这项研究中，通过外科手术在动物的背部诱导伤口，并在整个随访期间用无菌摩尔织物制成的敷料封闭，以吸收渗出物
，使组织通气，维持湿度，最重要的是，保护避免同笼动物造成额外伤害。敷料还可以防止污染并将生物膜固定在适当的
位置。根据文献，使用封闭敷料具有优点，例如：防止伤口干燥并形成结痂，从而阻碍新上皮的形成7，增加所应用物质的
吸收，舒缓疼痛，刺激清创和保护伤口所需的生长因子、酶9。此外，闭塞应允许伤口床和环境之间发生气体交换4。

目前，人们已经认识到通过保持理想的湿度来保持伤口环境水合的重要性，因此敷料必须在不引起伤口床浸渍的情况下保
持它。39。在这项研究中，使用了闭塞敷料，可以防止干燥，但使用大孔生物膜完全保证了潮湿的环境。开发了一种用于
伤口愈合的生物材料，以柔性生物膜的形式呈现，可以适应身体的不同部位，具有不同的尺寸和多孔性，可以释放渗出物
。

在炎症阶段，本研究可以观察到，大孔生物膜处理与盐水清洁相结合抑制了痂的形成。这可能是由于维持了理想的湿度，
而不会引起浸渍40。另一方面，用盐水清洗会使伤口干燥，导致伤口结痂，从而容易受到细菌污染和感染。41。

7天时，在增殖阶段，本研究中的宏观分析通过地壳强度的回归和发育中的肉芽组织显示了大孔生物膜的清创效果。这一结
果得到了组织病理学研究的证实，在该研究中，在同一实验日，坏死/结痂的强度降低，血管数量显着增加，这是新组织形
成的基本过程42。清创术不会造成额外的伤害，并且对人类具有很大的适用性，因为在慢性坏死性病变中，需要清创术以
使愈合过程正常进行43。

在我们的结果中观察到的仍处于增殖阶段，使用大孔生物膜的组中的血管量化强度更高，证实了对绒毛尿囊膜模型中的H.
spiosa乳胶的研究，其中它诱导了血管的显着增加定量类似于 Regederm（一种基于巴西橡胶树乳胶的产品），并且优于阴
性对照和抑制对照25。据文献报道，血管形成对于组织生长、细胞繁殖和伤口修复至关重要，允许血管细胞增殖、迁移、
调节和分化44，巨噬细胞和成纤维细胞迁移到伤口部位，从而产生细胞外基质，然后产生形成疤痕的胶原蛋白45。

已在绒毛尿囊膜模型中研究了H. spiosa的血管生成活性，结果表明观察到这种效应是由于血清分数17 号，呈现次级代谢
产物、酶和类黄化合物25。研究还表明，该血清成分可刺激促血管生成因子（如血管内皮生长因子和 MMP2）的表达，并刺
激细胞外基质的重塑17 号。

在本研究中，应用大孔生物膜后获得的结果与之前描述的结果相似46，在 Wistar 大鼠的手术皮肤伤口中使用H.
brasiliensis的乳胶生物膜。这些作者还观察到在愈合过程的所有阶段以及损伤的视觉方面预防结皮形成的情况，并形成
保护和维持伤口水分的粘性层。这种清创潜力也在其他研究中使用巴西人乳胶生物膜在褥疮焦痂中得到了验证47,48以及慢
性静脉溃疡患者49。

因此，生物膜形式的敷料显示了实现清创的重要因素，因为使用凝胶霜形式的巴西人乳胶对实验诱导的急性损伤的愈合没
有显着影响。老鼠50,51。

使用生物膜形式的H. spiosa乳胶以维持伤口床的潮湿环境并防止坏死/结痂和炎症，这一点得到了本研究中观察到的较低
炎症强度的支持，因为去除的碎片中多形核浸润较少来自用大孔生物膜处理的动物和在 G2 中观察到的清创潜力。因此，
为了使环境被认为是愈合过程发展的理想环境，伤口必须保持湿润，尤其是切除伤口2。

在本研究中观察到的愈合过程的初始阶段，多形核白细胞的迁移强度较低，这可能是由于大孔生物膜可能具有抗炎作用。
这些发现与 Marinho 等人的观点一致。23，这表明H. spiosa乳胶抑制一氧化氮、PGE2 和细胞因子白细胞介素 6 和肿瘤
坏死因子，通过影响炎症细胞的迁移和激活而产生抗炎作用。在本研究中，这种抗炎作用一直维持到实验分析的最后阶段
，在成熟阶段单核白细胞的迁移减少，显示出整个愈合过程的精细调节。

在我们的研究中，用大孔生物膜治疗的伤口在第 3 天、第 7 天和第 21 天时收缩百分比较高，这表明细胞外基质重塑过
程受到调节。该过程可归因于绿原酸和 MMP2 之间的相互作用，它们在H. spiosa乳胶的血清部分中浓度较高17 号。

H. spiosa乳胶生物膜还可以与其他产品结合使用，因为它已经证明银纳米粒子的加入可以带来高抗生物膜效率，而不改变
血管形成诱导能力16，展示了一种在复杂伤口愈合领域有前途的草药。

结论
总之，大孔生物膜被证明是伤口愈合的重要生物材料，可导致伤口收缩强度更大。在炎症和增殖阶段，它导致坏死/结痂的
形成减少，显示出清创作用和可能的抗炎作用，而在成熟阶段，它导致血管形成、炎症浸润和成纤维细胞迁移的诱导减少
。