背景
实验啮齿动物的文献数据表明，与年龄相关的运动活动减少，伴随着焦虑水平的增强[ 1,2,3 ]。这些行为变化是在旷场 (OF) 和高架十字迷宫 (EPM) 中测量的，在不同的大鼠品系中检测到，包括 Wistar、Lewis 和 Sprague Dawley 大鼠以及雄性和雌性 Wistar 大鼠。然而，很少有报告表明大鼠的焦虑水平随着年龄的增长而降低[ 4,5,6 ]。临床数据表明，衰老过程中情绪状态恶化可能与孤独感和情感密切相关[ 7 , 8]。考虑运动活动和焦虑反应之间的联系的结果是不明确的。Torras-Garcia [ 6 ] 报道称，大鼠焦虑的减少伴随着运动活动的减少，而 Turner 等人。[ 9 ]表明老年大鼠焦虑的升高并不伴随运动活动的变化。此外，Boguszewski 和 Zagrodzka [ 1 ] 报告称，在这些测试中，无论是年轻的成年大鼠还是老年大鼠，焦虑样行为都不依赖于运动活动，而 Sudakov 等人。[ 3 ]表明两个行为参数之间存在密切关系，并且变化方向相同。

褪黑激素对衰老的保护作用是众所周知的，与其假定的抗氧化和抗炎活性[ 10 ]及其对神经元能量代谢的调节作用密切相关[ 11 ]。衰老与褪黑激素合成下降和激素产生的昼夜节律受损有关，使机体容易罹患神经退行性疾病、癌症或代谢综合征 [ 12 , 13 ]。临床数据表明，随着年龄的增长，血浆褪黑激素水平下降两倍以上[ 14 ]。众所周知，松果体切除术会破坏褪黑激素作为激素的产生，从而加速衰老[ 15 , 16 ]。然而，Pierpaoli 等人的研究。[ 15]，表明寿命的加速或延迟取决于引起褪黑激素缺乏的年龄阶段。最近，我们证实了 Pierpaoli 等人的假设。[ 15 ]并证明，对三个月大的大鼠进行松果体切除术，通过损害重要的生化、代谢和生理标志物来加速衰老过程。相比之下，褪黑激素分泌不足对老年大鼠的影响可以忽略不计[ 17 ]。此外，Pierpaoli 等人。[ 15]提示，14月龄大鼠的松果体切除是松果体发挥功能的关键时期，可能会延缓衰老过程。然而，我们的研究结果表明，松果体对于平衡中年（14 个月大）大鼠的内源性抗氧化剂和促氧化剂成分仍然至关重要[ 18 ]。年轻成年大鼠的松果体切除术产生了类似冲动的行为，在新的环境中增加了运动活动并减少了焦虑[ 19 ]。褪黑素缺乏的 3 个月大大鼠的情绪障碍（焦虑和抑郁样反应减少）伴随着皮质酮释放反馈机制受损[ 19 ]。

本研究旨在阐明衰老过程中松果体对 Wistar 大鼠情绪状态的影响。通过切除年轻成年大鼠（3个月）、中年大鼠（14个月）和老年大鼠（18个月）的松果体，诱发褪黑激素缺乏症。焦虑水平通过三种不同的测试进行评估：EPM、明暗测试（LDT）和新奇抑制喂养测试（NSFT）。此外，在新环境中评估短期运动活动，而在活动计中记录长期运动。基于之前的文献数据[ 4,20,21,22,23 ]和我们的松果体切除术结果[ 21 ]关于下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和热休克蛋白（Hsp）70和Hsp 90在实验大鼠衰老过程中的关键作用，选择特定年龄代来测试和阐明与年龄相关的机制。情绪反应性的相关变化，以及血浆褪黑激素缺乏对情绪反应的特定年龄依赖性影响。

松果体切除术减少了年轻成年大鼠在黑暗阶段的运动活动，并损害了老年大鼠的昼夜活动变化
为了更好地适应新环境，在计算中消除了设备中的前 2 小时。三向方差分析表明，年轻成人、中年和老年假手术组通常在黑暗阶段比明亮阶段更活跃（p < 0.05）（图 2 A，B）。然而，松果体切除术消除了最老组的昼间活动（p > 0.05）。18 个月大的假手术组表现出运动活动（与 3 个月大的大鼠相比，p = 0.035；与 14 个月大的大鼠相比，p = 0.001）和距离（与 14 个月大的大鼠相比，p = 0.012）下降。在夜间活动的大鼠活跃的黑暗阶段（图 2B）。与匹配的假手术组相比，松果体切除术减少了年轻人在黑暗阶段的运动活动（p = 0.029）。

双向重复方差分析显示，3 月龄和 14 月龄大鼠的松果体切除术未改变年轻成年、中年和老年假大鼠的昼夜节律活动（图 3 A-  C）。然而，接受松果体切除术的 18 个月大的大鼠在活动计中消除了运动活动的节律振荡（p > 0.05）。

与松果体切除相关的褪黑素缺乏不会改变年轻、中年和老年大鼠的寿命
松果体切除术不会影响年轻成年大鼠（p = 0.39）、中年大鼠（p = 0.18）和老年大鼠（p = 0.2）的寿命和寿命（图4 A-  C）。

实验#2
松果体切除术的年轻成年和老年大鼠表现出类似冲动的行为和较低的焦虑水平
每个不同的行为测试都采用了不同的动物队列，这些队列是在两年内收集的。这种组装不同动物群体的细致方法可以全面了解它们在特定条件下的行为。通过利用不同的队列，我们​​可以解释年龄、遗传和环境影响等因素的潜在变化，确保对实验结果进行更稳健和可靠的解释。

高架十字迷宫测试
在高架十字迷宫装置的新环境中检测到运动活动的年龄依赖性下降（p < 0.001，p = 0.008，3 个月大的假大鼠分别与 14 个月和 18 个月大的大鼠相比； p = 0.014，14 个月大的大鼠与 18 个月大的大鼠相比）（图 5 A）。与年轻人（p = 0.045）和中年假手术组（p = 0.028）相比，最年长假手术组的手臂条目总数也显着减少（图5B  ）。与匹配的假手术大鼠相比，松果体切除术的年轻成年大鼠在 EPM 中表现出更高的运动活动（总距离：p = 0.005；总手臂条目：p < 0.001）（图 5 ）A、B）。伴随着年龄依赖性运动活动的减少，老年假治疗大鼠表现出进入 EPM 厌恶张开臂的距离（与 3 个月大假大鼠相比，p = 0.01）和进入 EPM 厌恶张开臂的时间缩短（与 3 个月大假大鼠相比，p = 0.009）。 14 个月大的假大鼠）（图 5 C、D）。与匹配的假手术组相比，松果体的去除降低了年轻成年大鼠的焦虑水平，这些大鼠在 EPM 的张开臂中移动并花费更多时间（分别为 p = 0.013 和 p = 0.001）。令人惊讶的是，与对照组相比，松果体切除术还减少了老年人组的焦虑，显示出在厌恶区的距离和时间增加（p = 0.0126；p = 0.045）。

明暗试验
LDT 也证实了与年龄相关的焦虑反应升高，其中与年轻成年假大鼠 (p = 0.017) 和中年假大鼠相比，老年假治疗大鼠表现出更长的潜伏期以移动到厌恶性盖室。 p = 0.015）（图 6 A）。去除 3 个月大和 18 个月大的大鼠的松果体后，焦虑反应也会减弱，这些大鼠在厌恶室中穿过的潜伏期较短（与 3 个月大的假大鼠相比，p = 0.032；与 18 个月大的假大鼠相比，p = 0.014）并且在光室中花费更多时间（与假大鼠相比，分别为 p = 0.003 和 p = 0.004）和（图 6  A，B）。

新奇抑制喂养试验
NSFT 中的三个参数评估了焦虑水平：开始嗅新环境圈中食物颗粒的潜伏期和吃掉食物颗粒的潜伏期（图 7 A、B）。据估计，在家里的笼子里开始吃颗粒的潜伏期也会分散老鼠在新奇事物中的行为，远离老鼠适应良好的地方，并且预计不会表现出焦虑反应[ 24 ]。与 EPM 和 LDT 一样，与年轻成年大鼠 (p < 0.001) 和中年大鼠 (p < 0.001) 相比，18 个月大的大鼠表现出焦虑反应增强，开始嗅觉的潜伏期增加（图 2）。  7A）。描述开始进食潜伏期的 18 个月大大鼠的数据未纳入分析，因为缺乏开始进食的动物。因此，Kaplan-Meier累积生存曲线被用来证明在测试期间不进食的动物的年龄和与松果体切除术相关的比例（图 7C）。与松果体切除相关的褪黑素缺乏导致年轻成年大鼠的焦虑水平降低（分别与其匹配的假手术组相比，p < 0.001，p = 0.0048）（图 7  B、C）和老年人大鼠（与匹配的假手术组相比，p = 0.002）（图 7 A）。

松果体切除术加剧老年大鼠血浆皮质酮的基础水平
在基础条件下（应激程序之前）从每组采集血样。
强迫游泳 5 分钟后 10 分钟 (10') 和应激后 120 分钟 (120')，以评估 HPA 轴的活动以及负责维持血浆皮质酮正常的反馈机制的效力价值观。与年轻成年大鼠相比，老年假大鼠血浆中皮质酮水平升高（p < 0.05）（表 2）。应激后 10 分钟和 120 分钟血浆皮质酮水平没有差异，证实了 HPA 轴的活性不存在年龄依赖性变化。松果体切除引起 18 个月大大鼠血浆皮质酮的额外升高（与匹配的假手术组相比，p < 0.05）。除 18 个月针组外，所有测试组均表现出压力引起的皮质酮显着增加 (p < 0.05)。两小时后，荷尔蒙水平降至基础水平，表明 HPA 轴的抑制反馈机制完整，不受年龄和褪黑激素缺乏的影响。

松果体切除术的中年大鼠额叶皮质中 Hsp 70 的表达减少
分析衰老过程和衰老不同阶段褪黑激素缺乏对FC和海马Hsp 70和Hsp 90表达的影响，以评估它们在大鼠情绪行为改变中的作用。这些蛋白质在帮助受损蛋白质在应激条件下重新折叠方面的保护作用是众所周知的[ 20 ]。Hsp 70 表达的年龄依赖性下降（p = 0.033，18 个月大的假大鼠与 3 个月大的假大鼠相比；p = 0.01，18 个月大的假大鼠与 14 个月大的假大鼠相比大鼠）和 Hsp 90（p = 0.05，18 个月大的假大鼠与 3 个月大的假大鼠相比；p = 0.01，18 个月大的假大鼠与 14 个月大的假大鼠相比） FC（图 8A、B）。令人惊讶的是，与匹配的假手术组相比，松果体切除术降低了 14 个月大大鼠的 Hsp 70 表达（p = 0.019）（图 8 A）。Hsp 90 也观察到类似的趋势，但未达到显着性 (p > 0.05)（图 7 B）。研究的三代大鼠海马中Hsp 70和90的表达没有显着差异(p>0.05)(图 8C、D)。血浆中褪黑激素的缺乏会影响海马体中的这些蛋白质（p > 0.05）。

讨论
本研究的结果表明，老年大鼠表现出自发运动活动减弱、焦虑样行为增加、基线血浆皮质酮水平升高以及 FC 中 Hsp 70 和 90 的表达减少。松果体切除术减少了年轻成年大鼠在黑暗阶段的运动活动，并削弱了老年大鼠的昼间活动。此外，与松果体切除术相关的褪黑素缺乏减轻了对新鲜事物的焦虑反应，而不影响年轻成年和老年大鼠 FC 和海马中 Hsp 70 和 90 的表达。在 18 个月大的大鼠中，HPA 轴活动受损与检测到的冲动样行为同时发生。松果体切除的中年大鼠的焦虑反应、运动活动的昼夜节律和HPA轴活动未受到影响。

我们对 EPM 中情绪反应的年龄相关变化的研究结果与之前在不同大鼠品系中的报告一致并扩展了[ 1,2,6 ] 。然而，其他研究却得出了相互矛盾的结果 [ 3 , 6 ]。因此，苏达科夫等人。[ 3 ]表明，与大鼠情绪状况相关的行为改变早在青春期后期（5个月大的大鼠）就很明显。这种差异可能不是由于品系差异造成的，因为如上所述，作者也使用了 Wistar 大鼠。在本研究中，我们使用两个参数来测量 EPM 中的活动（进入次数和总行驶距离），这两个参数被认为是运动活动的充分测量[1 ]。此外，为了消除与该参数的新颖性测量相关的焦虑因素的影响，我们还在活动计中测试了24小时的运动活动，这表明在这些条件下，大鼠已经习惯了。我们的数据与 Torras-Garcia 等人报告的数据之间存在差异。[ 6 ]可以通过我们的对照是假手术大鼠来解释。在本研究中，另外两项焦虑测试也证实了与年龄相关的焦虑反应增强的趋势。

众所周知，褪黑激素的血浆分布与松果体的活动之间存在密切关系，因为松果体不储存吲哚胺[ 14 , 25 ]。最近，我们报道称，去除松果体会消除血浆中褪黑激素水平的昼夜节律波动[ 26]，表明该程序可以被认为是血浆褪黑激素缺乏症的适当模型。尽管许多其他松果外组织是褪黑激素的来源，但其激素活性主要涉及微调内分泌和其他内部“时钟”信号，与光暗周期的外部“时钟”同步。代谢活动最高的组织，如大脑、皮肤和肠道，是体内合成吲哚胺的最关键部位[ 27 ]。此外，动物和人类的结果表明，松果外褪黑激素水平可能超过该激素的血液水平[ 28、29、30 ]]。脑组织中检测到的褪黑激素的腺体（松果体）和细胞来源导致脑脊液中的褪黑激素水平高于其他地方[ 31 ]。衰老伴随着激素产生的逐渐减少，同时其针对氧化应激的保护作用减弱，并且更容易患神经退行性疾病[ 25 ]。

在本研究中，我们报告了三个不同代人诱发的褪黑激素缺乏对焦虑样行为和运动活动昼夜节律的影响。内源性褪黑激素作为一种激素在焦虑行为中的作用已在实验动物和临床条件中得到证实[ 32]。我们发现，由于褪黑激素缺乏，年轻的成年大鼠和老年大鼠最容易受到焦虑变化的影响，表现出比匹配的假手术组更少的焦虑。相比之下，褪黑素缺乏对中年大鼠没有影响。值得注意的是，接受松果体切除术的老年大鼠情绪反应的变化与新环境中运动活动的改变无关。因此，松果体切除术老年大鼠的焦虑行为受损可能与冲动作为运动活动的情绪成分无关。Pierpaoli 和 Bulian [ 15 ] 报道称，松果体切除术对 3 个月大的小鼠的血液、代谢和激素参数产生有害影响，但对 14 个月大的啮齿类动物却没有影响。最近，我们证实了 Pierpaoli 和 Bulian 的发现[ 15] 褪黑素缺乏会加速年轻成年大鼠的衰老，并可能损害多种代谢指标，并伴有动脉血压、血糖、甘油三酯和胆固醇升高 [ 17 , 18 ]。在本研究中，老年大鼠松果体切除过程并未证实 Pierpaoli 等人的假设。[ 15 ] 14个月以上的小鼠的松果体切除术不再影响“衰老程序”。尽管在本研究中，FC 中 Hsp 70 和 90 的表达证实了这一建议，但令人惊讶的是，褪黑激素缺乏的老年大鼠表现出较低的焦虑水平，对危险或厌恶条件的反应能力减弱。

此外，与 Pierpaoli 和 Bulian [ 15 ] 报道的松果体切除术通过缩短寿命而加速松果体切除术的 3 个月大 BALB/c 小鼠的衰老不同，我们的结果表明，血液褪黑素缺乏对小鼠寿命没有影响。最年轻的老鼠。此外，Pierpaoli和Bulian[ 15 ]报道，中年是小鼠的关键时期，松果体切除导致寿命延迟，而18月龄小鼠褪黑素缺乏并不影响这一参数。Pierpaoli 和 Bulian 结果之间的差异[ 15] 在小鼠中以及我们在大鼠中关于褪黑激素作为激素对寿命的作用的研究结果需要进一步澄清，并且是一个悬而未决的问题。然而，我们的结果表明，无论诱导的年龄阶段如何，血液褪黑激素缺乏可能对寿命并不重要，这表明松果体外的褪黑激素来源足以补偿激素功能的缺乏。

为了支持之前的报道[ 33 , 34 ]，我们证明血浆皮质酮随着大鼠的衰老而增加。Sapolsky 的评论中讨论了这些发现与其他报告 [ 20 , 33 , 34 , 35 , 36 ]之间的差异[ 33]]，表明相互矛盾的结果可能不是归因于性别、压力或检测差异的时间点，而是归因于采血的方法和程序。HPA 轴的活动与压力反应密切相关，并可能因衰老和病理条件而改变。在本研究中，我们报告说，应激过程产生的与 HPA 轴相关的负反馈控制在三代（即年轻、中年和老年假手术大鼠）中保持完整。这一发现与 Scaccianoce 等人的报告一致。[ 34 ]，他证明皮质酮可以抑制年轻和年老大鼠垂体中 ACTH 的释放。Sapolsky 等人也报道了老年大鼠应激后充分的肾上腺皮质反应。(19,902) [34 ]。本研究中老年大鼠基础皮质酮水平升高可能是由于下丘脑反馈控制受损所致[ 20,35,37 ] 。与匹配的 3 个月大的大鼠相比，与年龄相关的褪黑激素缺乏导致假手术的 18 个月大大鼠的基础皮质酮水平较高 [ 38 ]。我们证实了 Oxenkrug 等人的结果。[ 39] 并证明，在基础条件下，与匹配的假手术大鼠相比，接受松果体切除术的老年 Wistar 大鼠的皮质酮水平进一步升高，而青年组和中年组则不受影响。老年大鼠血液褪黑激素缺乏导致血浆皮质酮增加，表明松果体对肾上腺活动的控制受到破坏。

此外，该组中褪黑激素缺乏导致 HPA 轴活性低下以及对压力刺激的反应不足。通过去除松果体（松果体是这种激素的主要来源）来破坏褪黑激素的产生，也改变了负责炎症反应并参与免疫松果体轴的免疫活性细胞的合成机制[40 ]。有趣的是，肾上腺皮质对完整松果体应激条件下激活的褪黑激素产生的糖皮质激素抑制控制机制在松果体切除术中应该受到损害，并且可能与老年大鼠中观察到的 HPA 轴活动紊乱有关。最近，我们报道了松果体切除术的年轻成年大鼠血浆皮质酮水平的昼夜节律受损。26 ]。我们可以推测，褪黑素缺乏的年轻成年和中年大鼠的免疫活性细胞的适应性反应足够强，足以克服松果体-肾上腺关系的变化和维持 HPA 轴活性。因此，需要进一步评估褪黑素缺乏对 HPA 轴不同组成部分的年龄相关影响的比较分析。

通过探索 FC 和海马匀浆中 Hsp 70 和 Hsp 90 的表达，进一步评估了松果体切除术引起年轻成年和老年大鼠焦虑反应变化的潜在分子机制。应激诱导的 Hsp70 表达受损机制被认为是衰老过程的有效生物标志物 [ 21 ]。据报道，在不同的大鼠组织中，包括淋巴细胞、肝细胞、海马和 FC，Hsp 70 的表达与年龄相关下降 [ 22,23,41 ]]。最近，我们证明，虽然褪黑激素的亚慢性治疗不会影响 Wistar 大鼠和自发性高血压大鼠 FC 和海马基础条件下 Hsp 70 的表达，但该激素往往会降低癫痫持续状态。诱导海马休克蛋白的升高[ 42 ]。其他作者还报道了褪黑激素治疗对各种病理状况下 Hsp 70 诱导的有益改善作用，包括松果体切除术引起的褪黑激素缺乏 [ 41 , 43 ]。本研究报告的 FC 中而非海马中两种 Hsp（70 和 90）表达的与年龄相关的下降与文献数据一致 [ 22，23 ] 可能是通过血浆中激素功能下降来解释的。

相反，松果体切除术诱导的中年大鼠 Hsp 70 的抑制可能代表了针对血浆中褪黑激素缺乏的适应性机制。这一建议与 Pierpaoli 和 Bulian (2005) 的假设 [ 15 ] 一致，即 14 个月大的小鼠松果体切除术可能会在某些方面延缓衰老过程。然而，我们最近对大鼠的研究表明，去除松果体可能会产生有害影响，导致中年大鼠加速衰老，这表明该激素在整个生命周期中发挥着更复杂的作用。松果体切除术对老年大鼠 Hsp 70 表达缺乏影响也可以用这些蛋白质在衰老过程中表达受损来解释。

结论
总之，去除松果体会影响年轻和老年大鼠的情绪反应，但不会影响中年大鼠。褪黑素缺乏的最老大鼠的焦虑行为受损可能与 HPA 轴活性低下有关，导致皮质醇血症。我们之前的研究中报道了皮质酮的昼夜节律迟缓[ 26] 或许可以解释接受松果体切除术的年轻成年大鼠的情绪反应紊乱。接受松果体切除术的中年大鼠是一个转折点，松果体外的吲哚胺可以补偿受损的激素功能，解释了完整的情绪反应和 HPA 轴活动。需要进一步的研究来估计在吲哚胺激素功能减弱的情况下来自脑脊液和肾上腺的松果体外褪黑激素的精确影响。

方法
实验设计是根据欧洲共同体理事会动物实验指令 2010/63/EU 制定的，并得到保加利亚食品安全局批准（研究项目：# 300/N°5888–0183）。

动物和实验时间表
雄性 Wistar 大鼠由神经生物学研究所 (BAS) 的饲养场购买，在三个不同的年龄使用：3、14 和 18 个月大。动物饲养在标准环境条件下：恒定12/12小时的光/暗循环，平均温度21°C，湿度45%。每笼3-4只大鼠为一组（透明塑料笼，根据年龄大小不同。除测试期间外，食物和水均可随意获取。实验设计如图1所示 ）。简而言之，手术后，将大鼠用于两个单独的方案：实验#1和实验#2。实验#1中的大鼠在活动计中进行24小时实验后不受干扰，以进行假手术/松果体切除手术后的生存时间分析。实验#2 中的老鼠接受了三项行为测试，从最不厌恶的测试到最厌恶的测试。最后一次测试后，他们的大脑被用于生化分析。来自实验＃2的一组动物被用于新奇抑制喂养测试（NSFT），然后被斩首。采用 ELISA 方法分析血浆皮质酮水平，同时评估额叶皮质 (FC) 和海马的热休克蛋白 (Hsp) 70 和 Hsp 90。实验#2 中的第二组和第三组动物被指定用于高架十字迷宫 (EPM) 测试和明暗测试 (LDT)。24小时后，在三个时间点从尾静脉采集血液：第一天的基础（0'）、第二天的应激后10分钟（10'）和应激后120分钟（120'）。制定将动物排除在测试和后续分析之外的标准是为了解决手术期间或手术后出现的可能损害行为测试完整性的并发症。运动功能障碍或体重显着减轻等情况被确定为需要排除的关键因素。实施这些标准是为了保持实验数据的有效性和可靠性，确保任何观察到的影响不会被与所调查的预期变量无关的外部因素所混淆。对并发症的仔细考虑强调了对科学严谨性和对研究结果的准确解释的承诺。

外科手术
根据手术程序将每个年龄的大鼠分为两个亚组：假手术组和松果体切除组。用异氟烷（2.5%）麻醉，将大鼠固定在立体定位仪（Stoelting，美国）上。根据 Hoffman 和 Reiter [ 44 ] 以及我们之前的研究 [ 19 , 38 ]描述的程序，对他们进行了松果体切除术。

自发运动活动和昼夜变化的测量
Actimeter（红外Actimeter，Bioseb，法国，https://www.bioseb.com/en/activity-motor-control-coordination/51-infrared-actimeter.html）用于探索24小时的运动和昼夜节律变化。每只大鼠在设备（20 厘米高、45 厘米宽和 45 厘米长）中单独进行测试，并收集长达 26 小时的行为数据。前两个小时不包括在数据分析中，以收集习惯良好的动物的结果。

焦虑行为的测量
高架十字迷宫测试
该测试是按照我们之前的研究[ 19 ]所示进行的。简而言之，将每只大鼠放置在迷宫的中心区域，面向黑木装置的张开臂。在 5 分钟测试期间计算了以下参数：闭臂总距离（厘米）、闭臂进入次数、开臂距离、时间和进入次数、开臂距离与总臂距离、开臂时间与开臂时间. 总时间、开臂条目数与臂条目总数。每次测试后，用酒精仔细清洁设备。

明暗试验
该装置由一个开放的（25厘米×50厘米×40厘米）和一个有盖（黑暗）（25厘米×25厘米×40厘米）的隔间组成，并与一个7厘米的门相连。装置的开放部分由安装在该区域上方的灯泡（80 lx）照明。测试开始时，将大鼠放入光室中。测量的参数是在光室中花费的总时间（秒）和第一次离开开放室的潜伏期。测试进行了5分钟。

新奇抑制喂养试验
评估大鼠暴露于开放区域（80 × 80 × 30 cm）时的食道减退反应。该测试按照我们早期研究中的描述进行，几乎没有修改[ 42]。每只测试大鼠在禁食 48 小时后被放置在空旷场地的角落里。测量了以下参数：进入插入中心区域的白纸圆圈的潜伏期、开始嗅纸上颗粒的潜伏期、以及开始进食 15 分钟的潜伏期。如果老鼠开始吃托盘或者 900 秒过去了，测试就会中断。OF 的测试一结束，每只老鼠就被放入自己的笼子里，并计算在那里开始进食的潜伏期。与家庭笼子潜伏期相比，新环境中的食道功能减退预计会显着增加在那里开始进食的潜伏期。

皮质酮测量
实验#2中的大鼠在最后一次行为测试后24小时被斩首，并且在斩首之前立即进行压力测试和采血程序。正如我们之前的研究所述，在三种不同的条件下评估了皮质酮的血浆水平[ 45 ]。简而言之，在强迫游泳5分钟(0')的应激程序之前、应激后10分钟(10')和120分钟后(120')从尾静脉收集血液。将血液收集到 Vacutainer ®中与 EDTA。4°C、4000 rpm 离心 10 分钟后分离血浆。分析前将其保存在 − 70 °C 的冰箱中。按照制造商的说明，通过 Elisa 测试试剂盒（Elabscience，批号 FU0704H66448）测量皮质酮，以 ng/ml 为单位。

额叶皮层热休克蛋白 70 和 90 的测量
FC和两个海马在冰上分离，速冻到液氮中，并保存在-20°C的冰箱中直至生化测定。在通过 ELISA 试剂盒（Fot Ltd. Bulgaria，批号：MBS760279；MBS7224294；Elabscience HSP70 目录号 E-EL-R0479 批号：KL05RP8D5302；Elabscience Hsp 90）分析 Hsp70 和 Hsp90 的表达之前，如前文所述制备组织匀浆 [ 46 ] ：目录号：E-EL-R0480 批号：KL03FR287799）根据制造商的指导。对每个样品应用布拉德福德测定法来估计蛋白质浓度。

统计分析
不同年龄的假手术和针手术大鼠的生存数据以 Kaplan-Meier 曲线表示，并通过对数秩检验进行分析。通过零振幅测试分析运动的昼夜波动。进行双向重复方差分析，以手术（假手术/松果体切除术）和时间（24个时间点）作为独立因素，并采用 Bonferroni 事后检验来分析运动活动的昼夜节律变化。昼夜水平活动也通过三向方差分析进行评估，其中时间被相位（亮/暗）取代作为第三个因素。使用双向方差分析（因素：年龄和手术）进行焦虑测试。Hsp 70 和 90 中的数据不呈正态分布。因此，应用 Kruskal-Wallis 排名，然后进行 Mann-Whitney U 检验。Fisher 精确检验用于分析 NSFT 中 18 个月大大鼠的数据。重复方差分析评估血浆中的皮质酮水平（因素：年龄、手术和时间（应激后 0'、10' 和 120'）。数据显示为平均值 ± SEM SigmaStat® 11.0和GraphPad Prism 6软件用于统计和制图。显着差异的标准被接受为 p ≤ 0.05。