介绍
卵巢癌是全球第三大常见妇科恶性肿瘤。然而，由于其无症状病程、晚期诊断和复发，它是癌症中死亡率最高的癌症1–3。确诊时通常伴有大网膜受累、弥漫性恶性腹水和腹膜内转移2–4。根据目前的数据，卵巢癌会对传统化疗药物产生耐药性，从而导致复发5。卵巢癌的具体病因仍不清楚，并且发展的早期分子事件也不清楚，因为这些癌症往往发生在晚期。

药用植物不仅作为治疗剂很重要，而且对于药理学研究和药物开发也很重要。迷迭香酸 (RA) 是一种存在于许多植物中的多酚。它尤其以高浓度存在于牛至、迷迭香、柠檬香脂、鼠尾草和万寿菊中。它是这些植物中赋予香气的成分之一6。RA具有很强的抗氧化活性。RA的抗氧化活性比维生素E更强，在降低RA癌变和血管闭塞风险的同时，防止自由基造成的细胞损伤7。采用微核（MN）法研究了不同剂量的RA对瑞士小鼠外周血细胞体内抗肿瘤剂阿霉素（DOX）的致突变或抗突变作用。与对照组相比，用三种不同剂量的 RA 治疗的小鼠没有观察到 MN 频率的增加。与同时给予 DOX 和 RA 的动物相比，观察到 MN 频率显着降低。尽管引起这种保护作用的机制尚不完全清楚，但已观察到 RA 对 DOX 毒性表现出强大的抗氧化活性8。

表皮生长因子受体 (EGFR) 是一种 170 kDa 的糖蛋白，包含影响细胞生长、分化和增殖的各种信号转导系统。EGFR 是受体酪氨酸激酶家族的第一个成员，该家族由四种结构相似但功能不同的受体组成。所有这些跨膜受体都含有由修饰的酪氨酸残基激活的内在激酶活性。生长因子与受体的结合刺激激酶活性9。临床前研究表明 EGFR 表达增加与肿瘤发生之间存在很强的相关性。在某些情况下，即使仅 EGFR 水平的变化也可能足以诱发癌症的发生。在乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、肾癌、卵巢癌、肺癌和各种鳞状细胞癌中也检测到 EGFR 表达增加10。导致 EGFR 表达增加的另一种机制是由于突变导致 EGFR 活性发生致瘤变化，从而在没有配体结合的情况下激活受体。体内研究表明，没有配体的自发 EGFR 激活会导致转基因动物中肿瘤的形成11。此外，卵巢癌的长期生存率下降，复发率上升12。

在我们的研究中，使用了来自最常见的卵巢癌上皮亚型的细胞系，即 OVCAR-3 人卵巢腺癌细胞系。许多临床前研究表明EGFR表达增加与肿瘤发生之间存在很强的相关性。据报道，在某些情况下，仅 EGFR 水平的变化就足以诱发癌症的发生。在乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、肾癌、卵巢癌、肺癌和各种鳞状细胞癌中也检测到 EGFR 表达异常增加。因此，我们认为确定新研究的药物在此途径上的活性非常重要。

通过细胞培养评估DOX剂和RA抗氧化化合物单独或联合应用的抗癌效果：细胞活力测试（MTT）、定量实时聚合酶链反应（PCR）、Western blot、基质胶侵袭实验。为了减少这些问题，重要的是寻找无毒且以替代/相似方式发挥作用的新药物，从而为卵巢癌提供额外的治疗选择。这些新药物之一是 RA，一种天然抗氧化剂。

方法
细胞培养
在该研究中，使用卵巢癌细胞系NIH:OVCAR-3 (HTB-161™)和人皮肤角质形成细胞系HaCat (RRID:CVCL_0038)作为健康细胞系。OVCAR-3细胞系在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1,640培养基中培养，HaCaT细胞系在含有相同添加剂的Eagle's miminal Essential Medium（DMEM）中培养，细胞在37℃无菌培养箱中生长和5%CO 2。所有研究均从细胞系第5代开始，最多至第15代或第20代终止。

MTT法
通过细胞活力测试测定DOX和RA的IC 50值。然后，确定最大增殖时间后，确定是否存在与EGFR信号通路相关的抑制。还通过蛋白质分析确定了细胞凋亡途径。然后确定 RA 和 DOX 组合的抗氧化或抗肿瘤作用是否在 OVCAR-3 细胞系中被激活。

确定 IC 50使用自动多吸管将 OVCAR-3 和 HaCaT 细胞系接种到 96 孔培养皿中。一晚结束时（约 16 小时），以连续稀释获得的九个不同浓度应用 DOX 0.5–50 μM 和 RA 10–1,000 μM，并将板孵育 24、48 和 72 小时。在MTT细胞活力分析中，每个化疗药物和载体对照组由六个孔组成。孵育后进行MTT测试以进行细胞存活（活力）分析。为此，将按 5 mg/mL 剂量制备的黄色四唑 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑）测试溶液以 20 μL/mL 的速率移入所有孔中。出色地。然后，将板孵育4小时。孵育后，完全除去孔中的培养基，每孔加入200μL超纯DMSO（Merk，美国），置于培养箱中避光培养2-4小时。在此期间结束时，使用 Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，美国）在 492、570 和 650 nm 波长下对板进行分光光度读取。从应用于车辆地雷的对照组获得的值被确定为基于100%生存率的比较生存率。我知道了 从应用于车辆地雷的对照组获得的值被确定为基于100%生存率的比较生存率。我知道了 从应用于车辆地雷的对照组获得的值被确定为基于100%生存率的比较生存率。我知道了使用社会科学 20 程序统计包和概率分析计算对照组和实验组中每种肿瘤细胞系和化疗药物的50 个值。

总RNA分离和cDNA合成
在该研究中，OVCAR-3细胞被接种在25厘米2培养瓶中培养直至达到对数生长期。当细胞达到对数生长期时，单独或组合施用载体对照、DOX IC 50 = 0.08 μM和RA IC 50 = 437.6 μM。施用后 72 小时从样品中分离出 RNA。分离阶段使用 Purelink RNA mini 试剂盒（Thermo，美国），并遵循试剂盒方案。收集的RNA的纯度通过Optizen NanoQ微量分光光度计（Mecasys，韩国）测定，并用超纯水将所有RNA平衡至750 ng/10 μL。

进行互补 DNA 合成，以确保同步过程后获得的 RNA 可以通过聚合酶链式反应 (PCR) 进行扩增。此阶段使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Life Technologies，美国）。

实时定量聚合酶链反应
本次研究通过增殖定量分析 OVCAR-3 卵巢癌细胞对照组和给药组中负责 EGFR/信号通路的 EGFR 基因的表达量以及负责凋亡通路的 BCL-2 基因的表达量实时PCR（qRT-PCR）方法。下面以 5'-3' 顺序给出了用于研究这些基因表达变化的引物。

EGFR：F：GCAAGGCACGAGTAACAAGC，R：AGGGCAATGAGGACATAACC

BCL-2：F：ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA，R：ACAGTTCCACAAAGGCATCC

β-Aktin: F: CCTCTGAACCCTAAGGCCAAC, R: TGCCACAGGATTCCATACCC

GAPDH：F：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，R：GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC

在基因表达研究中，使用了从按照“总RNA分离”部分所述分离的RNA获得的cDNA。这些 cDNA 根据 Power Sybeer Green qPCR MasterMix（thermo，美国）方案在 qRT-PCR 中进行。在该研究中，使用 Applied Biosystems QuantStudio 5 实时 PCR 设备扩增 cDNA。内源性对照3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和β-肌动蛋白mRNA表达作为多重对照方法的校准和校正因子。

蛋白质印迹
在研究中，OVCAR-3细胞被接种到75厘米2培养瓶中培养直至达到对数生长期。当细胞达到对数生长期时，媒介物对照，DOX IC 50 = 0.08 μM，RA IC 50= 437.6 μM 单独或组合施用。施用后 72 小时从样品中分离蛋白质。在该研究中，使用了Thermo Scientific公司提供的Western Breze品牌现成试剂盒，使用iBlot 2（Life Technologies）系统、现成的膜和试剂盒，按照试剂盒方案进行印迹和转移到膜上。印迹后，用抗 EGFR (Phospho-Tyr1197) 抗体（ABM，目录号：Y011228）、Beta 肌动蛋白抗体（Invitrogen，目录号：MA1-140）特异性一抗处理蛋白质，然后用​​适当的二抗标记抗体以及使用 ChemiDoc（DNR Bio-Imaging Systems Ltd，美国）凝胶成像系统进行显微观察。使用 GelQuant 软件计算条带强度。

统计分析
本研究通过单因素方差分析确定了 qRT-PCR 阵列研究中 MTT 试验测定的活细胞比例与 2-ΔΔCt 法获得的表达值平均值之间的差异，通过 Tukey HSD 测试确定输入平均值的组。在两组比较中，根据数据的同质性​​，采用依赖样本T检验或Mann-Whitney U检验。使用 Statistical Package for the Social Sciences 20（IBM，美国）和 Graphpad 程序进行分析，并使用 p ≤ 0.05。

结果
OVCAR3细胞的基础增殖率与HaCat细胞相比显示出统计学上显着的差异。RA和DOX对OVCAR3细胞增殖的抑制作用以时间和浓度依赖性方式增强（无花果。1a和1b）。24 h 时未发现 RA 对 OVCAR3 细胞的IC 50 ，但 48 h 时为 980.3 μM，72 h 时为 437.6 μM（表格1）。另一方面，在HaCat细胞系中，未发现RA的IC 50值，而DOX在48小时和72小时的IC 50值分别为5.32和1.23 μM（表格1）。

图 1
该图的完整解释。（a和b）不同时间和不同浓度的DOX和RA对人卵巢癌细胞OVCAR3和（c和d）人真皮角质形成细胞HaCat存活率的影响（c±S，n=6）。
 缩略图
表1不同时间RA/DOX对OVCAR3和HaCaT细胞的
IC 50 。
迷迭香酸在许多癌症中显示出巨大的治疗潜力，但其对 OCVAR3 细胞系的抗癌作用仍有待证明。首先，用不同浓度的RA和DOX处理人卵巢腺癌细胞OVCAR3 24、48和72小时，然后测量细胞活力。如图所示图1a，在DOX施用24小时时略微增加的细胞在48和72小时显示出快速的浓度依赖性减少。如图所示图1b，OVCAR3细胞的活性随着RA浓度的增加而降低。在 RA 应用第 24 小时，细胞浓度增加至 250 μM/L，根据浓度和时间，细胞会迅速失去活力。当 RA 浓度在所有三个不同时间段达到 1,000 μM/L 时，细胞活性降至 60% 以下。72 小时时，大多数浓度的细胞活性显着下降。因此，本研究选择IC 50 RA 和IC 50 DOX 孵育进行分析。

为了研究 RA 在 OVCAR3 细胞凋亡中的作用，我们的研究检测了 Bcl-2 基因表达。如图所示图2，正常OVCAR3细胞呈现低凋亡率，而随着RA处理，凋亡细胞率增加。此外，Bcl-2 的表达也降低了（图2b）。此外，细胞活力也被DOX显着抑制，而RA的存在进一步增强了这种抑制作用，表明RA可能增强卵巢癌细胞对DOX的敏感性。

图2
OVCAR-3卵巢癌细胞系中Bcl-2基因表达的相对倍数增加值。
接下来，我们旨在探讨RA抑制细胞凋亡和细胞增殖的可能机制。如中所述图3，72小时IC 50 = 437.6μM RA和IC 50 = 0.08μM DOX处理显着抑制p-EGFR和EGFR的蛋白表达。

图 3
在研究范围内，当 OVCAR-3 作为单一或组合应用于卵巢癌细胞时，72 小时后测定载体对照、DOX、RA、p_EGFR 和 EGFR 蛋白水平。
讨论
本研究利用人卵巢癌细胞系OVCAR3研究RA对卵巢腺癌的作用及潜在机制。我们的结果表明，RA 可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并在体外增加 OVCAR3 细胞的凋亡和 DOX 敏感性。RA还下调OVCAR3细胞中p-EGFR、EGFR和Blc-2的表达水平，表明其具有治疗卵巢癌的抗癌潜力，其潜在机制可能与抑制EGFR激活有关。

卵巢癌是发达国家妇科癌症死亡的主要原因，且往往发生于晚期13。目前晚期卵巢癌的标准治疗是细胞减灭术和铂类/紫杉烷类化疗13–15。治疗有效率约为 80-90%，但最常见的是复发并对化疗产生耐药性14。因此，需要寻找替代方法来诊断和治疗卵巢癌。在过去的三十年中，已经进行了许多临床前和临床研究，以确定潜在的候选药物（作为单一或联合疗法）或提高现有化疗方案针对卵巢癌的治疗效果16。

源自植物的新型化合物最近作为传统疗法的替代品而受到重视，因为它们对致癌细胞具有有效的活性，且副作用有限或可以忽略不计。特别是，他们专注于生产一些源自天然化合物的有前途的细胞毒性药物，如 RA、α 硫辛酸、抗坏血酸和姜黄素17 号–19。主要目的是减少甚至消除现有化疗的副作用。抗氧化疗法可以定义为预防或减少自由基副作用的治疗方法。外源性抗氧化剂在保护组织免受体内氧化应激方面的有效性是可变的，并且取决于抗氧化剂的类型、其生物制药特性、其在作用部位的浓度以及氧化应激的性质19。

RA 是咖啡酸和 3,4-二羟基苯基乳酸的衍生物，主要存在于迷迭香、紫苏和丹参等植物中。20。许多研究表明，RA因其抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗菌特性而具有广泛的药理作用21。RA对抑制皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、白血病等具有重要作用22。有报道RA可抑制人胃癌细胞的多药耐药性23。其他研究表明，RA可能增加肺癌和卵巢癌细胞的敏感性，并与顺铂有协同作用24,25。与这些研究报告的结果一致，证实了 RA 对人卵巢腺癌细胞的抗癌作用，这是通过 RA 诱导 OVCAR3 细胞凋亡以及抑制 DOX 敏感性的增殖和迁移来促进的。

众所周知，它是由包括 EGFR 在内的不同酪氨酸激酶受体过度表达引起的，并导致 PI3K/AKT、ERK 和 mTOR 等致癌信号通路的激活26。RA 发挥重要的抗增殖作用，这也与 EGFR 表达的降低有关。除了其抑制作用外，RA 还可通过抑制 Bcl-2 来增强 Bax 通路的激活，从而增加癌细胞凋亡18。

因此，我们想检查RA对OVCAR-3细胞的影响，特别是对该通路的影响。根据我们的qRT-PCR结果，在p-EGFR、EGFR途径的基因组中，仅用RA和RA+DOX治疗的组中检测到EGFR表达下降。在这些变化中，RA、DOX、RA + DOX 组中 EGFR 基因表达的下降具有统计学意义（p < 0.05）。有趣的是，双剂量组（RA + DOX）中 EGFR 信号通路的抑制揭示了文献中 RA 对卵巢癌的奇特作用。

与坏死不同，细胞凋亡是最常见的细胞死亡形式，可能发生在胚胎发育、组织再生和调节以及肿瘤消退的各个阶段27。Bcl-2抑制细胞凋亡，Bcl-2蛋白家族根据其功能分为两类28。第一类是Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1和A1，与Bcl-2类似，抑制细胞凋亡。另一种是触发细胞凋亡的类型，如 BAX、Bcl-Xs、Bik/Nbk 和 Bid29。我们的研究表明RA可以抑制凋亡因子Bcl-2的表达。由此看来，我们认为RA是通过降低Bcl-2基因表达的机制来进行细胞凋亡的。

当我们评估所有这些文献综述和我们的结果时，似乎 RA 作为 ROS 清除剂扮演着两个相反的角色。根据浓度和氧化还原调节，它可以充当抗氧化剂或促氧化剂。在低剂量时通过消除 ROS 来保护正常细胞，而在高剂量时会诱导癌细胞凋亡和细胞毒性30。研究还表明，当与化疗药物或DOX联合使用时，RA具有更强的抗癌作用。在我们的研究中，RA还影响增殖、迁移、凋亡、细胞周期、EGFR通路基因表达、Bcl-2蛋白水平和凋亡机制等多个步骤。正如我们预期的那样，它还提高了 OVCAR-3 细胞中 RA + DOX 二人组的效率。

结论
由于癌症发病率的增加和治疗中遇到的困难，提高现有化疗药物的敏感性非常重要。正在研究可以以较低剂量应用而不牺牲药物有效性的替代方法。能够用新的潜在药物解释细胞凋亡和细胞周期相关的复杂机制非常重要，这些药物副作用很少，并且可以与现有药物一起增强其效力。因此，研究的化合物 RA 通过影响大多数与增殖、侵袭、迁移、EMT 和细胞凋亡相关的信号通路中的多个步骤，已被证明在各种癌症模型中表现出抗肿瘤活性。