介绍
患有自闭症谱系障碍 (ASD) 的人经常表现出感觉处理改变和语言发展缺陷。这表现为个体之间的一系列听觉处理挑战，从对声音的敏感度升高到对声音的敏感度降低。这些知觉变化伴随着听觉通路中对声音的神经反应的改变[ 1 , 2 ]。例如，与正常发育的儿童相比，患有语言障碍的自闭症儿童的听觉皮层对元音的反应显着延迟，患有语言障碍的自闭症儿童的听觉皮层反应甚至进一步延迟，而患有极少语言和非语言的自闭症儿童的听觉皮层反应严重延迟[ 3]。患有自闭症谱系障碍的儿童可以从传统的康复治疗中受益，但许多儿童在接受这些耗时且昂贵的治疗后仍然会出现缺陷。开发新技术来增强神经发育障碍患者的听觉处理是必要的。

产前接触抗惊厥药物丙戊酸 (VPA) 的儿童患自闭症谱系障碍 (ASD)、学习障碍和发育迟缓的风险增加 [ 4 ]。产前接触VPA 可导致自闭症谱系障碍 (ASD) 症状，包括感觉处理改变和语言发育缺陷[ 5,6,7,8 ]。产前暴露于 VPA 的儿童的语言接受和表达能力受损，且呈剂量依赖性：产前暴露于较大 VPA 剂量的儿童的语言能力比暴露于较小剂量的儿童差 [ 9 ]。

与人类一样，出生前暴露于 VPA 的啮齿类动物表现出听觉处理能力下降和对声音的皮质神经活动异常。与暴露于盐水的对照大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠在区分首辅音（“dad”与“bad”）不同的声音方面受到损害 [ 10 ]。在暴露于 VPA 的啮齿类动物中，听觉皮层的反应较弱、延迟且音调紊乱 [ 1 , 11 , 12 ]。在皮层下结构中，暴露于 VPA 的动物的上橄榄复合体、外侧丘系和下丘中的神经元较少且神经元形态受到破坏 [ 13、14、15、16 ]]。此外，产前 VPA 暴露会导致耳蜗核、上橄榄复合体和下丘中央核 (CNIC) 对纯音的反应有更多的 cFos 标记，并减少从上橄榄复合体、耳蜗核、下丘中央核到 CNIC 的投射。和丘脑内侧膝状核[ 13,17,18 ] 。这些神经变化可能会导致皮层下声音处理中断，但皮层下生理学变化的存在和性质尚未得到表征。因此，在这项研究中，我们测试了这样的假设：产前暴露于 VPA 会降低听觉处理皮层下区域（下丘中央核 (CNIC)）对声音的神经反应。

方法
记录两组大鼠的下丘 (IC) 反应：(1) 暴露于盐水的大鼠 ( n  = 19) 和 (2) 暴露于 VPA 的大鼠 ( n  = 18)。德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会批准了所有手术方案和记录程序。

科目
雄性和雌性斯普拉格道利大鼠获自查尔斯河实验室（马萨诸塞州威尔明顿）并交配。怀孕是通过阴道塞的存在来确定的。在妊娠第 12.5 天，雌性大鼠接受单次腹腔注射溶解在 0.9% 盐水中的 600 mg/kg 丙戊酸 (VPA)，或单独注射 0.9% 盐水，如之前的研究一样 [ 10 , 11 , 19 , 20]，21 ]。本研究使用了来自 10 窝的 37 只雄性和雌性动物。37只大鼠中，盐水组9只雌性和10只雄性，VPA组8只雌性和10只雄性。

电生理记录
生理盐水暴露对照组的 490 个部位和 VPA 暴露组的 415 个部位记录了多单位下丘反应。所有记录均在 90 天以上的成年大鼠中获得。用戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，并根据需要给予加强戊巴比妥（8 mg/kg）。为了缓解动物的呼吸，进行气管切开术以直接输送湿润空气。气管切开后，在右下丘上方前囟后 9 毫米、外侧 1.5 毫米的头骨上钻一个孔。两个涂有聚对二甲苯的钨微电极，间隔 250 µm（1–2 MΩ，FHC）垂直于皮质表面降低至软脑膜表面以下 1000 微米，并沿背腹轴以 200 微米的间隔进行记录，直到深度约为 4000-5000 微米。为了确保记录是从 IC (CNIC) 的中央核获得的，对音调组织和反应潜伏期进行了量化，这与之前研究中使用的方法一致。22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27]。从这个垂直角度来看，CNIC 具有非常清晰的音位组织，其中特征频率从 1 kHz 有序地进展到 32 kHz。在 CNIC 之外的区域，例如 IC 的背侧皮层和外皮层，获得的特征频率并没有以有序的方式跨越我们录音刺激的整个五个八度频率范围。我们在每只大鼠中记录了一次跨越 CNIC 整个音调轴的完整传递。在盐水暴露对照组中总共获得了453个CNIC位点，在VPA暴露组中总共获得了374个CNIC位点。本研究中每只动物的音调轴如图1所示 ，并附有记录位置和八度特征频率之间的皮尔逊相关系数（特征频率的 log2，图 1）。

在每个 200 微米的记录间隔，听觉刺激通过放置在距左耳 10 厘米处的 Tucker Davis Technologies (TDT) MF-1 扬声器呈现。每个录音点的刺激集由 1296 个不同频率和强度组合的音调组成，从 1 到 32 kHz，以 0.0625 倍频程为步长，0 到 75 dB SPL，以 5 dB 为步长，随机交错。此外，还呈现了 15 个随机交错的语音（辅音-元音-辅音）中每一个的 20 次重复，这些语音因初始辅音或元音而不同（“chad”、“dad”、“deed”、“dood”、“fad”） 、“gad”、“had”、“jad”、“悲伤”、“shad”、“tad”）。所有语音均以声音元音部分的最大 100 毫秒为 60 dB 的方式呈现。此外，“爸爸”和“鲥鱼”的声音也以 45 分贝和 75 分贝的音量呈现。最后，

统计分析
所有数据均使用 MATLAB 软件、SPSS 27 版和 GraphPad Prism 10.1.0 版进行分析。语音引起的响应强度是通过在整个 400 ms 的声音持续时间内、在对声音的辅音部分的第一个 40 ms 起始响应期间以及在对声音的辅音部分的 300 ms 响应期间取驱动尖峰的平均数量来计算的。声音的元音部分。辅音根据发音方式的差异（塞辅音、塞擦音和擦音）进行细分[ 28 ]。起始潜伏期被确定为每个声音呈现后的第一个尖峰潜伏期，峰值潜伏期被定义为最大放电率潜伏期[ 11 , 29 ]。

最近邻分类器用于通过利用对所呈现的每个语音刺激的单次试验响应的尖峰计时来确定声音对之间的神经辨别准确性 [ 11 , 29]。该分类器确定单次试验响应与刺激周围时间直方图 (PSTH) 模板的相似性，该模板是由每个声音引起的 IC 响应的剩余 19 次重复生成的。最近邻分类器使用欧几里得距离来识别最有可能生成所考虑的单个试验响应的声音。所有语音的起始响应是对声音辅音部分的初始 40 毫秒响应，使用 1 毫秒精度进行分组。辅音对包括初始辅音不同的所有语音，特别关注发音类别方式不同的辅音对。对于元音响应，使用单个 300 bin [ 22]向分类器提供响应的元音部分，从 140 到 440 毫秒。]。元音对是“Dad-Deed”、“Dad-Dood”和“Deed-Dood”。分类器的准确性被量化为准确分配给生成响应的声音的神经响应的百分比。

每个 IC 录音位置对音调的反应也被量化。计算了下丘的感受野特性（特征频率、响应阈值、带宽、响应延迟和自发放电）[ 24 , 30 ]。量化了对突发噪声序列的响应的发射速率和矢量强度。通过获取驱动尖峰的平均数来量化所有 6 次爆发的发射率。矢量强度用于量化噪声突发的同步性 [ 31 , 32]。对于所有分析，均使用 Lilliefors 正态性检验确定正态分布。当群体呈正态分布时，当多个记录位点嵌套在个体大鼠中时，使用带有 Bonferroni 校正的广义线性混合模型（GLMM）；当为每只大鼠获得单个值来比较组反应时，使用双向方差分析，并使用韦尔奇t检验来比较两组之间 CNIC 的音位轴长度。对于 GLMM，实验组（VPA 与生理盐水）作为固定因素进行评估，大鼠作为随机因素进行评估。另外，非参数 Mann–Whitney U统计数据用于比较组下丘对音调、语音和噪声突发的反应 [ 33]。中位数 95% 的自举置信区间是使用 50,000 个样本计算得出的。

结果
产前暴露于 VPA 会降低 CNIC 音位轴长度
在产前暴露于 VPA 的动物中记录了先天性缺陷，包括较小的脑容量 [ 34 , 35 ]。在我们的研究中，与暴露于盐水的对照大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠的 CNIC 音位轴长度显着缩短（盐水（平均值 ± SEM）= 2453 ± 98.93 微米；VPA（平均值 ± SEM）= 2067 ± 101 微米；Welch t -测试，t (34.92)=2.730，p  =0.0098，图 1 )。这一发现与之前的研究一致，这些研究记录了产前暴露于 VPA 会改变听觉中脑的大小 [ 34 , 35 ]。

VPA 暴露大鼠的 IC 对语音的反应发生改变
在自闭症儿童和动物模型中，通常观察到对声音的延迟和较弱反应[ 1,36,37,38 ]。暴露于 VPA的大鼠还表现出神经活动异常和听觉皮层处理能力退化[ 10,11,12 ]。在我们当前的研究中，我们的目的是确定产前接触 VPA 是否会改变 IC 的听觉反应。为此，我们首先比较了暴露于 VPA 的大鼠和暴露于盐水的大鼠之间的 IC 对语音的反应。与之前的研究一致 [ 37 , 39]，我们发现暴露于 VPA 的大鼠对语音的 IC 驱动反应明显弱于暴露于盐水的大鼠（Mann-Whitney U，p  < 0.0001，图 2 a、b，附加文件 1和2）。

语音呈现为辅音-元音-辅音单词，并且在单词的初始辅音或元音部分中有所不同（即“Dad”与“Gad”或“Dad”与“Deed”）。为了确定暴露于 VPA 的大鼠是否在声音的特定部分存在缺陷，我们比较了各组之间对声音的辅音部分和声音的元音部分的反应。对于辅音，我们首先检查了 IC 对停止辅音（“d”、“g”、“t”）的响应，已知这些辅音具有快速的频谱时间转换。各组之间对塞音辅音部分的反应强度存在显着差异（Mann–Whitney U，p  = 0.044，图 3a，附加文件 3）A）。接下来，我们检查了 IC 对塞擦音（“ch”和“j”）的响应，这些塞音从类似塞音的声音过渡到类似摩擦音的声音，与纯摩擦音相比，声音的摩擦音部分更快[ 28 ] 。观察到塞擦音辅音部分的反应强度在各组之间没有显着差异（Mann–Whitney U，p  = 0.062，图 3 b，附加文件 3）b). 最后，我们检查了 IC 对摩擦音（“f”、“h”、“s”和“sh”）的反应，这涉及声道的部分阻塞。与塞擦音相似，组间对摩擦音辅音部分的反应强度没有显着变化（Mann-Whitney U，p  = 0.399，图 3 c，附加文件 3 c）。这些结果表明辅音的频谱时间声学是 IC 对辅音响应强度的重要因素。

同样，对声音元音部分的响应强度也显着改变，与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对声音元音部分的响应明显较弱（Mann–Whitney U，p  < 0.0001，图 4 ） ，附加文件 4）。与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对声音的辅音开始和持续元音部分的反应明显较弱。

除了呈现辅音或元音不同的声音外，“Dad”和“Shad”的声音还以三种不同的强度（75、60、45 dB）呈现。与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠在多种声音强度下由“爸爸”引起的反应强度明显较弱（Mann–Whitney U，p  = 0.017，图 5a，附加文件 5a）。75 dB 的声音“爸爸”显示各组之间响应强度的最大差异（Mann–Whitney U，p  = 0.008）。与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对多种声音强度下的“鲥鱼”引起的反应强度也明显较弱（Mann-WhitneyU , p  < 0.0001，图 5 b，附加文件 5 b)。60 和 75 dB 处的声音“鲥鱼”显示各组之间响应强度的最大差异（Mann–Whitney U，60 dB：p  = 0.01；75 dB：p  = 0.008）。这些结果表明，与较小的声音相比，暴露于 VPA 的大鼠对较大声音的反应强度缺陷更大。

除了反应强度的变化之外，自闭症患者和 ASD 动物模型中对言语反应的时间也有差异[ 11,29,38,39 ]。在这项研究中，实验组之间的起始潜伏期存在显着差异，但峰值潜伏期没有显着差异。与之前的研究结果相反，暴露于盐水的大鼠对语音的起始反应潜伏期明显慢于暴露于 VPA 的大鼠，而峰值反应潜伏期在各组之间没有变化（Mann–Whitney U，起始：p  = 0.046；GLMM ，峰值：F (1,825) = 0.20，p  = 0.65；图 6，附加图S 6）。总的来说，我们的结果表明暴露于 VPA 的大鼠改变了对语音的反应。

VPA 暴露大鼠的 IC 对音调的反应没有改变
除了语音之外，还提供了由 1 至 32 kHz 频率和 0 至 75 dB 强度组成的音调，以研究下丘中音位组织和感受野特性的变化。为了研究 VPA 大鼠对 IC 中的音调的反应是否表现出变化，比较了两组之间调节到多个频率范围的尖峰数量。VPA 暴露大鼠和盐水暴露大鼠之间没有显着差异（双向方差分析，F (1,175) = 0.00000204，p  = 0.999，图 7A）。接下来，检查音调的速率-强度函数，以量化对多个声强级别的音调的响应。正如预期的那样，对于两组来说，增加音调强度会引起更强的 IC 反应（双向方差分析，F (15,560) = 2.35，p  = 0.0029）。比较盐水暴露和 VPA 暴露的大鼠，不同强度的实验组之间没有显着差异（双向方差分析，F (1,560) = 0.532，p  = 0.466，图 7 b）。

此外，还检查了各组之间的感受野特性，包括响应阈值、高于阈值 10 和 40 dB 的带宽、起始和峰值潜伏期、峰值潜伏期结束以及自发放电率。各组之间的任何感受野属性均无显着差异（GLMM，阈值：F (1,35) = 0.15，p  = 0.70；10 dB 带宽：F (1,35) = 0.729，p  = 0.40；带宽40 dB 时：F (1,35) = 0.42，p  = 0.52；起始潜伏期：F (1,35) = 0.05，p  = 0.83；峰值潜伏期：F (1,35) = 0.25，p  = 0.62；结束峰值延迟：F(1,35) = 0.47，p  = 0.50；和自发放电率：F (1,35) = 0.001，p  = 0.97，表 1 )。总体而言，与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对音调的 IC 反应没有表现出显着差异。

VPA 暴露大鼠的 IC 时间处理完好无损
在自闭症的人类和动物模型中，皮层对快速呈现的声音的锁相经常受到损害，神经振幅降低，声音引起的同步反应减少[ 1,11,39,40 ]。为了研究在下丘中是否也观察到这种情况，我们提出了 10 Hz 的噪声突发序列。从对音调的反应中可以看出，暴露于盐水的大鼠和暴露于 VPA 的大鼠之间由噪声爆发序列引起的峰值放电率没有显着差异（Mann-Whitney U，p  = 0.18；图 8 a、b） ，附加图S 7a、b）。此外，各组之间响应第一个峰值的时间没有显着差异（Mann-Whitney U，p  = 0.55；图 8 c，附加图 S 7 c）。为了量化同步性，检查了矢量强度。两组之间的矢量强度也没有改变（Mann-Whitney U，p  = 0.70；图 8 d，附加图 S 7 d）。这些结果表明，在 IC 中，暴露于 VPA 不会影响时间处理，速度相对较慢，为 10 Hz。

VPA 暴露大鼠的 IC 神经辨别准确性下降
最近邻分类器用于量化语音对的神经辨别能力。先前的一项研究发现，在前听觉场，与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对辅音对的辨别准确度明显较差，但元音对的辨别准确度却没有显着降低[ 11 ]。在我们当前的研究中，比较了 IC 对语音对的响应的辨别能力。总体而言，与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠的 IC 神经元在区分停止辅音对（DG、DT、GT）方面的准确度明显较低（Mann–Whitney U，p  = 0.013；表 2）。实验组之间在低频或高频箱内对塞音的神经辨别方面没有发现显着差异（Mann-Whitney U，低：p  = 0.09；高：p  = 0.08）。接下来我们检查塞擦音和摩擦音。对于这两种情况，暴露于 VPA 的大鼠在辨别塞擦音和摩擦音对方面总体较差（Mann–Whitney U，塞擦音：p  = 0.0009；擦音：p  = 0.0001），尤其是在低频录音部位（Mann–Whitney U，塞擦音：p  = 0.0038；擦音：p < 0.001)。高频录音部位的塞擦音和摩擦音对辨别在各组之间没有显着差异（Mann–Whitney U，塞擦音：p  = 0.080，擦音：p  = 0.114）。将神经辨别力与元音对进行比较，总体上暴露于 VPA 的大鼠明显差于暴露于盐水的大鼠（Mann-Whitney U，p  = 0.026）。然而，无论是低频位点还是高频位点，各组之间均未发现显着差异。这些结果表明，对独特语音的神经反应在暴露于 VPA 的大鼠中引起更相似的神经活动模式，而在暴露于盐水的大鼠中引起更独特的神经活动模式。

讨论
自闭症谱系障碍患者存在听觉脑干反应（ABR）异常，与神经正常个体相比，其表现为脑干对声音的反应延迟且较弱[ 39 , 40 ]。先前的研究观察到产前暴露于 VPA 的啮齿类动物听觉通路的解剖学差异[ 11,13,15,40,41 ]。本研究的目的是研究产前暴露 VPA 的大鼠皮层下听觉处理生理学。这项研究是对先前研究的扩展，这些研究已证明产前暴露于 VPA 会影响皮质和皮质下区域的听觉处理 [ 1 , 13，42 ]。在这项研究中，与暴露于盐水的对照大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠下丘对语音的反应明显较弱且延迟。同时，与暴露于盐水的对照大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对音调和噪声爆发的反应没有变化。这些结果表明，暴露于 VPA 的大鼠具有完整的 IC 处理简单声音的能力，但处理复杂刺激的能力受到损害。

ASD 中复杂与简单的刺激处理
患有自闭症谱系障碍的儿童在处理频谱时间复杂的声音（如语音）方面比处理简单的声音（如音调）有更大的困难[ 1,38,43,44,45 ]。与正常发育的儿童相比，这些儿童对复杂声音的反应明显较弱且延迟 [ 1 , 37 , 40 , 44 , 46 , 47 , 48 , 49 ]]。例如，一项研究发现，当自闭症儿童听到语音 /da/ 时，与正常发育的儿童相比，这些儿童的 ABR 反应明显较弱 [ 50 ]。我们目前的研究支持了之前的发现；与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠对语音的 IC 反应显着降低，但它们对音调的反应完好无损。此前，与暴露于盐水的大鼠相比，VPA 大鼠的前听觉场 (AAF) 处理语音的能力也明显较弱且较慢 [ 42]。除了在这些大鼠中观察到的异常皮质和皮质下听觉处理之外，VPA 大鼠还执行辅音辨别任务，但不执行元音辨别任务，其准确性明显低于暴露于盐水的对照大鼠[ 10 ]。这些发现共同提供了进一步的证据，证明 VPA 暴露会影响复杂声音刺激的处理。这种听觉处理中断可能会导致自闭症儿童中常见的接受性语言和社交沟通障碍 [ 9 , 43 ]。

暴露于 VPA 的啮齿动物的听觉通路
先前的研究发现，暴露于 VPA 的大鼠初级听觉皮层和前听觉场 (AAF) 的声音处理能力下降 [ 11 , 12 ]。虽然没有研究记录暴露于 VPA 的啮齿类动物皮层下的神经元尖峰活动，但多篇论文证明暴露于 VPA 的啮齿类动物皮层下存在异常神经结构。暴露于 VPA 的啮齿动物在腹侧耳蜗核、上橄榄复合体、下丘和丘脑内侧膝状核中的神经元较少[ 16 , 17 ]。有趣的是，最近的一篇论文展示了暴露于 VPA 的动物在 22 天龄（但在 60 天龄）的 ABR 阈值升高和点击延迟增加 [ 15]。这一令人着迷的发现表明，听觉脑干对简单声音（如点击声）的反应可能会延迟成熟，并为观察到的对更复杂声音（如言语）的严重影响的反应可能会随着年龄的增长而改善提供了希望。

ASD 儿童的听觉通路
此前的研究发现，自闭症谱系障碍患者听觉通路中对声音的神经反应发生了变化。在皮质下，自闭症谱系障碍患者已被证明具有正常的点击诱发脑干反应，但对语音的神经同步和锁相脑干反应存在缺陷[ 39 , 40 ]。与患有自闭症谱系障碍但不患有过敏症的儿童和正常发育的儿童相比，患有自闭症谱系障碍和过敏症的儿童初级听觉皮层的反应明显延迟[ 51 ]。有趣的是，另一项研究记录了自闭症谱系障碍患者初级听觉皮层的言语诱发反应未改变，但颞上回 (STG) 的言语诱发反应减少[ 52]。STG 中自闭症谱系障碍患者的反应延迟也大大降低。与正常发育的儿童相比，患有自闭症谱系障碍的语言儿童对元音声音的 STG 潜伏期明显更长，患有自闭症谱系障碍的语言障碍儿童的潜伏期进一步延迟，而患有自闭症谱系障碍的语言/非语言能力最低的儿童对元音声音的潜伏期大大延迟。 STG [ 3 ]。总体而言，患有自闭症谱系障碍的儿童通常会对整个听觉通路的语音表现出神经反应退化。

结论
目前的研究表明，暴露于 VPA 的大鼠下丘对语音的反应降低，特别是停止辅音和元音的反应。神经分类器还显示，与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠在区分辅音和元音方面较差。这一发现与工程师等人之前的研究一致。(2014) 发现，与暴露于盐水的大鼠相比，暴露于 VPA 的大鼠在辅音辨别任务中表现较差。与未经训练的 VPA 暴露大鼠相比，广泛的听觉辨别训练改善了受过训练的 VPA 暴露大鼠的前听觉场反应。因此，在广泛的听觉辨别训练后记录下丘反应也可能是有益的。