介绍
严重的体重减轻、多动和闭经是精神性饮食障碍神经性厌食症（AN）的特征[ 1 ]。AN 患者灰质和白质体积严重减少与学习障碍等神经心理缺陷有关 [ 2 , 3 ]。此外，AN 患者的胼胝体 (CC) 中白质的体积和微结构均发生变化 [ 4 , 5]。医疗干预的新目标可能会在通过下丘脑回路控制饮食行为的复杂神经元过程中找到。在这些回路中，弓状核 (ARC) 中表达神经肽 Y (NPY) 和刺鼠相关肽 (AgRP) 的神经元促进食物摄入，而表达阿片黑皮素原 (POMC) 的神经元则促进饱腹感。POMC 是一种前激素原，可裂解成生物活性肽，例如 α-黑素细胞刺激激素 (α-MSH)，它通过与黑皮质素受体结合来抑制摄食 [ 6 , 7]。这些促食欲和厌食信号被传递到下丘脑的其他神经解剖区域，例如室旁核、下丘脑外侧区（LHA）和下丘脑外脑区，以调节食物摄入。最近的研究表明，神经胶质细胞，特别是星形胶质细胞和小胶质细胞，在改变这种食物摄入机制中发挥着作用（如[ 8,9 ]中所述）。

为了研究饥饿引起的大脑变化的细胞基础，我们使用了半饥饿引起的多动（SIH）小鼠模型，该模型涉及有限数量的食物和使用跑轮[ 10 , 11 ]。在该模型中，小鼠减少食物摄入量，直至体重减轻 20%（一周阶段定义为急性饥饿）并维持两周（慢性饥饿）。我们之前曾报道过该模型中 CC 和大脑皮层的GFAP +星形胶质细胞密度降低 [ 12 , 13 ]。这些神经胶质细胞的变化伴随着相同区域的体积减少，这与 AN 人类的研究结果一致。其他研究也报告了 GFAP 的降低+脱水诱导的厌食 (DIA) 大鼠模型中 CC、前额皮质和海马的星形胶质细胞密度 [ 14 , 15 ]。对于小胶质细胞，在厌食症模型中发现海马和前额皮质密度增加，表明小胶质细胞增生[ 16 , 17 ]。食物摄入相关途径可能与饥饿有关，这一点可以从基于活动的厌食症 (ABA) 模型（包括有限的进食时间）中Npy和Agrp mRNA表达上调来证明[ 18,19,20 ]。然而， Pomc的结果mRNA 表达一直存在矛盾，因为两项研究表明 ABA动物的弓状核 (ARC) 中Pomc表达增加，而一项研究报告Pomc表达减少[ 18,21,22 ]。此外，ABA 动物 ARC 中的 POMC +细胞密度增加[ 23 ]。尽管有这些报道，由于饥饿导致神经胶质密度变化的原因尚不清楚（[ 24 ]中综述）。

在这里，我们研究了小鼠 SIH 模型中 CC 的体积和神经胶质变化。此外，我们还研究了饥饿是否会导致 ARC 和 LHA 中的胶质细胞变化，这可能与 NPY 和 POMC 强度的变化有关。

材料与方法
动物
雌性 C57BL/6J 小鼠（n = 60 只动物，4 周龄称为青少年早期，8 周龄称为青少年）作为大型群体的一部分购自 Janvier Labs（Le Genest-Saint-Isle，法国）研究 [ 11 , 25 ] 并置于 12/12 小时光/暗循环和 22 ± 2 °C 温度下。早上 6 点，光照阶段开始。使用雌性小鼠是因为在人类中观察到雌性小鼠 AN 的患病率较高 [ 24]。所有小鼠都单独饲养在笼子里，在整个实验过程中可以无限制地使用跑轮。每周一次，将小鼠转移到配有新鲜垫料和淡水瓶的新笼子中，并根据欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）的建议进行微生物分析。该实验得到了梅​​克伦堡-前波美拉尼亚地区政府动物受试者护理审查委员会的批准（参考编号 7221.3-1-005/21）。

学习规划
如前所述，急性和慢性饥饿是通过 SIH 模型（以前也称为改良的基于活动的厌食症（ABA）模型）诱导的[ 10 ]。采用为期十天的随意获取食物和水的阶段来使小鼠适应环境。每天下午 1 点，我们监测小鼠，包括测量体重、食物消耗、月经周期和喂养情况。

在十天的适应阶段，小鼠随意进食。通过平均适应阶段消耗的食物来计算每只小鼠的平均每日食物摄入量。急性饥饿被定义为为期一周的阶段，其中小鼠接受平均每日食物摄入量的 40%，直到体重减轻 20%（Control_acute：n = 10；SIH_acute：n = 20）。慢性饥饿是由急性饥饿阶段后两周的饥饿引起的（Control_chronic：n = 10；SIH_chronic：n = 20）。每天调整食物摄入量以维持体重减轻，范围为平均每日食物摄入量的45%至70%。在每个饥饿阶段，小鼠在接下来的 24 小时内可以自由获取计算出的食物量。在饥饿的各个阶段，对照组动物始终可以不受限制地获取食物。调查跑步活动（之前描述过[11 ]），我们利用附在笼子顶部的跑轮（直径11.5厘米）。使用活动程序（VitalView Activity 1.4，STARR Life Science Corp.）每小时评估跑步距离。

体积测量
给小鼠腹膜内（ip）注射氯胺酮（100mg/kg）和赛拉嗪（10mg/kg）。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和3.7%多聚甲醛溶液（pH 7.4）经心灌注后，快速解剖大脑。将大脑用多聚甲醛溶液后固定 1 天，用自来水冲洗，并在 4°C 的 PBS 中的 10%、20% 和 30% 蔗糖溶液中浸泡过夜进行冷冻保护。将大脑包埋在最佳切割温度介质（Sakura，美国）中并储存在−20°C。将每只小鼠的整个大脑在低温恒温器（Leica CM 3050S，Nussloch，德国）上从正面切成一系列 40 µm 切片，并将每三个切片解冻安装在载玻片上以进行体积测量。按照标准方案用尼氏染色对这些切片进行染色。

尼氏染色切片被数字化，并且通过使用 ImageJ 软件（1.48v，Wayne Rasband，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）手动确定每两个切片的感兴趣区域 (ROI)、CC。观察者对实验治疗组不知情。使用卡瓦列里方法，将面积乘以组织切片之间的距离，然后求和得到总体积。使用 Allen 小鼠大脑图谱从前囟 1.85-1.46 分析 CC 体积，完全包围隔室。由于载玻片质量不足，4 只动物被排除在分析之外。

组织学、免疫组织化学和图像分析
如前所述，免疫组织化学是按照标准程序进行的[ 12,26,27 ] 。首先，将切片暴露于 5% 山羊、兔或马血清（Sigma，慕尼黑，德国）90 分钟，并在 4°C 下针对表 1 中列出的一抗孵育过夜。

表1 一抗列表
全尺寸桌子
随后，用0.35%过氧化氢（H 2 O 2）在PBS中30分钟。然后，将切片暴露于相应的二抗：兔抗山羊抗体（1:250，多克隆兔抗体，购买号：BA-5000，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）或山羊抗兔抗体（1 ：250，山羊多克隆抗体，购买号：BA-1000，Vector Laboratories）。此步骤之后是 ABC 复合体（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）。最后，通过与 3,3'-二氨基联苯胺（Dako，汉堡，德国）的反应进行抗原位点的检测。使用阴性对照（省略一抗）。使用配备 DMC6200 相机的 Leica DM6 B 显微镜（Leica Microsystems CMS GmbH Wetzlar，德国；20 倍物镜，数值孔径 (NA)：0.55；40 倍物镜，NA：0.95）对载玻片进行数字化。

对于 GFAP 染色，使用 Bregma – 1.12 mm 处的切片，而对于 IBA1 和 OLIG2 染色，使用 Bregma – 1.54 mm 处的切片。在每次研究中，将两个免疫组织化学染色切片数字化，并对结果进行平均。为了量化 GFAP +、IBA1 +和 OLIG2 +细胞的数量，使用软件 ViewPoint（版本 1.0.0.9628，PreciPoint，Freising，德国）。由对治疗组不知情的两名评估员对细胞进行计数。结果以每mm 2的细胞数表示。观察者计数所有 GFAP +、IBA1 +和 OLIG2 +含有可见细胞核的细胞。在三个区域（中线旁边、扣带下下和侧面）测量 CC，并对结果取平均值。我们排除了 ROI 受损时的部分。

在ARC定位方面，对于GFAP染色，使用Bregma-1.34mm处的切片，而对于IBA1和OLIG2染色，使用Bregma-1.46mm处的切片。使用 Allen 小鼠脑图谱和每三个脑切片的连续尼氏染色重建位于第三脑室附近的 ARC（附加文件1：图 S1A）。按照这个方向，对每个部分手动执行 ARC 重建。第二个 ROI LHA 定义为穹窿 (f) 和视神经之间的区域。因此，在穹窿最顶部分和视神经最顶部分之间画一条垂直线。另一条垂直线落在穹窿基底部分和视神经最低可见基底部分之间。

为了测量 POMC 和 NPY 切片的染色强度，使用软件 ImageJ（版本 1.53t NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国）。对于此分析，图像被转换为​​灰度图像，并使用阈值将像素分为黑色或白色。结果以染色面积百分比表示。

统计数据
数据显示为平均值和平均值的标准误差 (SEM)。为了确定在细胞密度变化方面显着区分对照组和 SIH 小鼠所需的最小组大小，使用 G*Power 软件使用 80% 功效和 5% alpha 误差计算先验单向方差分析功效分析[ 28 ]。使用 GraphPad Prism 软件（版本 8.0.0，GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）对组间差异进行统计测试，置信区间为 0.05。p值≤ 0.05 被认为具有统计显着性。格拉布斯检验后，通过夏皮罗-威尔克斯正态分布检验对数据集进行分析。CC体积参数、GFAP +、IBA1细胞密度+和 OLIG2 +以及 NPY 和 POMC 染色强度通过学生 t 检验进行分析。当数据不呈正态分布时，使用曼-惠特尼检验。以下符号用于指示显着性水平：* p  ≤ 0.05，** p  ≤ 0.01，*** p  ≤ 0.001。

结果
慢性饥饿会导致CC 中GFAP +、IBA1 +和 OLIG2 +细胞数量减少
与相应的对照相比，急性和慢性饥饿不会导致 SIH 小鼠 CC 体积发生变化（图 1 B）。

图。1
图1
慢性饥饿导致胼胝体中星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞密度降低。( A , B ) 与对照组相比，SIH 组胼胝体体积没有变化。急性和慢性饥饿后 SIH 和对照小鼠胼胝体中( C ) GFAP +星形胶质细胞、( D ) IBA1 +小胶质细胞和 ( E ) OLIG2 +少突胶质细胞的细胞数量。箭头标记 ( C ) GFAP +、( D ) IBA1 +和 ( E ) OLIG2 +细胞。慢性饥饿后，SIH小鼠胼胝体中星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞数量显着减少。急性饥饿的双面学生 t 检验，慢性饥饿的 Mann–Whitney 检验，** p  ≤ 0.01，*** p  ≤ 0.001

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接下来，我们分析了饥饿对 CC 中胶质细胞的影响（图 1 C-E）。急性饥饿不会导致CC 中GFAP +细胞的变化。相反，慢性饥饿导致该区域的GFAP +细胞减少（Control_chronic：111.73 cells/mm 2  ± 8.48 vs. SIH_chronic：85.04 ± 6.8，p  = 0.01，图 1 C）。此外，急性饥饿不会导致 CC 中 IBA1 +小胶质细胞密度的变化，而慢性饥饿会导致该细胞密度下降（Control_chronic：77.82 个细胞/mm 2  ± 3.61 对比 SIH_chronic：65.01 ± 2.6，p  = 0.01，图 1D）。同时，急性饥饿不会导致 OLIG2 +细胞数量的变化。相比之下，慢性饥饿诱导 OLIG2 +细胞减少（Control_chronic：1471.16 cells/mm 2  ± 138.7 vs. SIH_chronic：850.36 ± 82.84，p  = 0.0003，图 1 E）。总之，慢性饥饿减少了CC 中GFAP +、IBA1 +和 OLIG2 +细胞的数量。

饥饿不会导致 ARC 神经胶质变化
接下来，我们分析了饥饿是否改变了下丘脑 ARC 中的胶质细胞数量（图 2）。

图2
图2
饥饿不会引起弓状核中的神经胶质变化。急性和慢性饥饿后 SIH 和对照小鼠弓状核中( A ) GFAP +、( B ) IBA1 +和 ( C ) OLIG2 +的细胞密度。比例尺 = 100 µm。双面学生 t 检验

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在 ARC 中，饥饿不会改变 GFAP +星形胶质细胞和 IBA1 +小胶质细胞的细胞密度。此外，与对照小鼠相比，急性和慢性饥饿后，SIH 小鼠 ARC 中的 OLIG2 +细胞密度没有改变。总之，饥饿后 ARC 中的胶质细胞数量没有变化。

饥饿不会导致 LHA 中的神经胶质变化
ARC 向 LHA 发出信号，LHA 被选为第二个感兴趣区域，因为它参与食物摄入的调节（图 3）。

图3
图3
饥饿不会引起下丘脑外侧区域的神经胶质变化。急性和慢性饥饿后 SIH 和对照小鼠下丘脑外侧区( A ) GFAP +、( B ) IBA1 +和 ( C ) OLIG2 +细胞的细胞密度。双面学生 t 检验

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在 LHA 中，GFAP +星形胶质细胞和 IBA1 +小胶质细胞的细胞密度在急性饥饿或慢性饥饿后都没有改变。同样，急性饥饿后对照小鼠和 SIH 小鼠之间的 OLIG2 +细胞没有差异，而慢性饥饿后观察到 SIH 小鼠中OLIG2 +细胞数量较低的趋势（Control_chronic：81.03 个细胞/mm 2  ± 4.25 vs SIH_chronic：67.97 个细胞/mm 2  ± 4.69，p  = 0.07，图 3 C)。综上所述，饥饿后 LHA 中的胶质细胞数量没有变化。

饥饿会增加 ARC 中 NPY 的表达
肽 NPY 和 POMC 参与食物摄入调节。急性和慢性饥饿后，SIH小鼠中POMC的表达与对照组相比没有变化（图 4A）。

图4
图4
急性和慢性饥饿会导致弓状核中 NPY 染色强度的增加。急性和慢性饥饿期间 SIH 和对照小鼠弓状核 (ARC) 中( A ) POMC 和 ( B ) NPY的染色强度。急性和慢性饥饿导致 NPY 染色强度增加。比例尺 = 100 µm。双面学生 t 检验，* p  ≤ 0.05，** p  ≤ 0.01

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相比之下，SIH小鼠中NPY的染色强度在急性饥饿后增加（Control_acute：35.32％染色面积±4.97 vs. SIH_acute：47.72％染色面积±2.80，p  = 0.04，图 4B）。慢性饥饿后 NPY 的染色强度也增加（Control_chronic：45.89% 染色面积 ± 4.34 对比 SIH_chronic：58.86% 染色面积 ± 2.41，p  = 0.01，图 4 B）。

讨论
为了阐明 AN 的神经病理学，使用了小鼠厌食症模型，该模型导致 AN 相关的多动和闭经等核心症状 [ 11 ]。我们之前的研究表明，体重减轻 25% 的大鼠的 CC 体积会减少 [ 12 ]，而体重减轻 20% 的 SIH 小鼠则没有观察到变化，这表明白质脑萎缩的影响取决于饥饿的程度。

为了检查 AN 动物模型中的星形细胞病，我们对白质进行了详细分析，特别关注 CC。星形胶质细胞履行各种功能，即参与构建血脑屏障、运输营养物质和神经胶质细胞传递，这是从神经胶质细胞到神经元的主动信息传递[ 8 ]。此外，星形胶质细胞积极调节行为，并在行为障碍中发挥重要作用，即大鼠前额皮质中的神经胶质消融引起的抑郁样症状[ 29]。在我们的研究中，急性饥饿后CC中星形胶质细胞的密度保持不变，而慢性饥饿后星形胶质细胞的密度下降。因此，星形胶质细胞密度的变化取决于饥饿时间的长短，表明长时间的饥饿可能导致神经胶质细胞的潜在功能障碍。这些发现与先前在大鼠 SIH 模型中的研究一致，其中观察到由于长期饥饿导致星形胶质细胞减少 [ 12 ]，并且与 DIA 大鼠模型的研究结果一致 [ 14 , 15 ]。在后一种模型中，发现前额皮质中谷氨酸-谷氨酰胺稳态的破坏和星形胶质细胞的脱枝形态[ 30]。因此，星形胶质细胞的减少及其潜在的功能障碍可能导致人类 AN 的神经心理缺陷。

接下来，我们分析了小胶质细胞（大脑的常驻免疫细胞）是否受到饥饿的影响。星形胶质细胞的变化与慢性饥饿后 CC 中IBA1 +细胞密度下降的发现相一致。相反，在 DIA 模型中，前额皮质和海马中的这些细胞密度增加，表明存在促炎环境 [ 16 , 17 ]。因此，我们应该进一步分析胶质细胞的形态来估计小胶质细胞活化的程度。小胶质细胞可能会根据饥饿的类型、饥饿的持续时间和受影响的特定大脑区域做出不同的反应。

由于 CC 中的主要细胞类型是少突胶质细胞，它负责轴突的髓鞘形成和神经元的代谢支持，因此我们在模型中研究了这些细胞 [ 31 ]。SIH小鼠CC中OLIG2 +细胞的密度在慢性饥饿后下降，表明髓磷脂状态因饥饿而改变。转录因子 Olig2 在少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞 (OPC) 中表达。在之前的一项研究中，我们发现SIH 大鼠中成熟 APC +少突胶质细胞的密度没有变化[ 12 ]，这表明 OPC 和髓鞘形成前少突胶质细胞尤其受到饥饿的影响。此外，已知低血糖会诱导 OPC 凋亡细胞死亡。32 ]。因此，细胞凋亡的增加可以解释 OLIG2 +细胞密度的降低。值得注意的是，AN 患者的 CC 结构连接性降低，而接受体重康复的患者的这种连接性没有变化 [ 5 , 33 ]。总之，饥饿导致 CC 中神经胶质细胞的变化，而这与该区域的体积变化无关。

下一个感兴趣的区域是下丘脑，其功能是调节饥饿、饱腹感、能量代谢和体重。我们发现饥饿不会导致 ARC 中的细胞密度发生变化，ARC 包含调节食物摄入的一级神经元。同样，在相应的二级神经元所在的 LHA 中，这些细胞密度也没有观察到变化。因此，我们的研究表明，饥饿后 ARC 和 LH 中的胶质细胞密度没有变化可能意味着这些区域缺乏胶质细胞的参与。因此，神经元改变以及神经胶质细胞和神经元之间的相互作用可能是理解饥饿引起的变化的主要焦点。小胶质细胞密度没有任何改变表明 ARC 和 LH 中不存在小胶质细胞增生或炎症。

在目前的研究中，急性和慢性饥饿增加了 ARC 中的 NPY 染色强度，而 POMC 强度没有观察到变化。此外，Rijke 等人。证明 ARC 一级神经元中神经肽的表达在负能量状态下发生改变 [ 18 ]。因此，饥饿似乎会增加食欲信号传导，这与之前报道的Npy表达增加的文献一致[ 18 , 19 ]。先前的研究揭示了关于Pomc表达的相互矛盾的结果[ 18,21,22 ]。在 ABA 大鼠中，POMC +的密度增加ARC 中的细胞[ 23 ]。因此，NPY 似乎更容易受到饥饿的影响，而 POMC 可能更容易受到影响。有趣的是，抑制 ABA 大鼠的 POMC 神经元会导致食物预期发育受到抑制，其特点是进食期前运动活动增加 [ 34 ]。

总之，SIH 模型表明 CC 中的胶质细胞在饮食失调的病理生理学中发挥作用。因此，研究神经胶质细胞对于寻找治疗 AN 患者的新靶点非常重要。就此而言，我们必须意识到 SIH 模型的局限性，因为它的结果完全基于动物。尽管如此，SIH 模型代表了 AN 的许多躯体方面，例如体重减轻、闭经和多动，假设它具有高度翻译意义。考虑到饥饿的影响类似于AN的继发影响，有必要强调将自愿食物限制作为潜在的治疗目标进行研究也可能具有相关性。在未来的研究中，我们将研究 CC 中神经胶质细胞和神经元之间的相互作用（和功能障碍）。为了区分饥饿和多动的影响，我们将增加两组：一组没有跑轮的对照组，另一组没有跑轮的饥饿组。此外，在未来的研究中，我们将包括对 SIH 小鼠的重新喂养，以研究观察到的变化是否可以通过重新喂养来逆转。