介绍
在全球范围内，啤酒仅次于水和咖啡，成为第三大消费饮料。随着工业化的蔓延，酿造逐渐从家庭活动转变为工业活动（Pokrivčák et al.  2019）。啤酒花被用作苦味剂和调味剂以及防腐剂，而谷物则用作糖源。多年来，大麦麦芽被认为是唯一适合生产啤酒的谷物，而啤酒花则被认为是主要的苦味/调味剂。然而，随着时间的推移，各种植物和水果已与啤酒花一起使用来给啤酒调味（Adamenko 等人，  2020）。由于寻找啤酒生产的替代糖源，酿造业对小麦麦芽的接受度越来越高（Malomo  2015）。此外，为了最大限度地发挥与啤酒相关的健康益处，“特殊啤酒”——包括无酒精啤酒、低酒精啤酒和精酿啤酒，其单位体积酒精含量 (ABV) 水平各不相同，具体取决于每个国家的法律这种啤酒的生产地——已酿造（Salanşă 等人，  2020a，2020b）。对专门的“非酒精啤酒”的需求是由饮酒的负面影响带来的，包括成瘾和健康问题，包括肝硬化和神经退行性变（Mellor et al.  2020）。在尼日利亚，尼日利亚国家统计局 ( 2019 年) 和 Uloko 等人 ( 2018 年) 的报告）显示了尼日利亚不同地区糖尿病患病率与饮酒量之间的相关性。酒精消费最高的南南地区糖尿病患病率也最高，而酒精消费最低的西北地区糖尿病发病率最低。尽管关于酒精在糖尿病患病率中的作用存在一些相互矛盾的报告，但是饮酒与糖尿病之间存在联系。由于其所谓的健康益处、监管问题、一些国家的酒精消费限制以及安全性，特种啤酒在全球范围内不断增长（Ignat 等人，  2020）。此外，为了增强啤酒的健康优势，之前的研究已经研究了用其他植物代替啤酒花的苦味和风味效果（Adenuga 等人，  2010 年；Zapata 等人，  2019 年）。有报道称，在酿造啤酒时，可以使用苦叶、苦可乐和乌塔齐叶等草药代替啤酒花（Adenuga 等，  2010）。此外，非洲部分地区获取啤酒花的相关困难（可用性和经济原因）引发了人们在酿造中寻找啤酒花的替代品。

最近的研究表明，啤酒对健康有益，包括抗氧化和抗炎特性（Salanşă 等人，  2020a）及其在控制糖尿病方面的潜力（Hernández-Quiroz 等人，  2020）。在撒哈拉以南非洲地区，已报告了超过 2500 万例包括糖尿病在内的代谢性疾病病例，预计该疾病将影响全球 5 亿人。到 2045 年，糖尿病发病率预计将上升 162.5%（Saeedi 等人，  2019）。使用药用植物及其副产品仍然是治疗人类疾病的重要治疗方法（Adamenko 等人，  2020 年；Adenuga 等人，  2010 年））。草药长期以来一直被用来治疗糖尿病。自古以来，植物和植物提取物就被用来治疗糖尿病。在亚洲、南美洲、印度、加勒比地区和东非的原住民中，苦瓜 (M. charantia )，也称为苦瓜、卡雷拉、苦瓜或苦瓜，是一种广受欢迎的治疗草药。糖尿病相关病症（Cousens  2008；Joseph & Jini  2013）。由于这种水果具有独特的苦味，并且随着成熟而变得更加强烈，因此它也被称为苦瓜或苦瓜。许多事实和理论解释了苦瓜的抗糖尿病特性通过生化和动物模型研究（Singh 等人，  2012 年；Joseph 和 Jini，  2013 年），苦瓜中的酚类成分（如没食子酸和表儿茶素）据报道参与了许多导致血糖升高的途径。因此，据报道苦瓜在控制糖尿病血糖方面的功效，因此有必要进行这项研究，看看如何用苦瓜叶代替啤酒花来给啤酒苦味和调味，为糖尿病患者提供健康的饮料选择。

材料和方法
样品采集
啤酒花购自尼日利亚西南部奥孙州伊莱沙的一家知名啤酒厂，小麦则购自翁多州阿库雷的奥哈-奥巴。使用前，啤酒花保存在 4°C。苦瓜叶源自 Akure Metropolis，并经过植物标本馆、CERAD、FUTA 认证。将叶子风干至固定重量后粉碎。为了以后使用，将粉碎的叶子保存在密封容器中于室温下。

化学品和试剂
所有实验均使用分析级化学品和试剂。对硝基苯基-D 吡喃葡萄糖苷、二硝基水杨酸显色剂和链脲佐菌素 (STZ)（货号 S）-130 购自 Sigma-Aldrich, Inc.（美国密苏里州圣路易斯）。我们从英国多塞特郡普尔市的 BDH Chemicals Ltd. 获得了以下化学品：乙醇、乙酸、硫酸、碳酸钠、甲醇、乙酸钾、高氯酸、苯酚和氢氧化钠。从 Matador Pharmaceutical Ltd. 购买了用于 Fine-test 血糖仪和阿卡波糖的血糖试纸（尼日利亚翁多州阿库雷）。

啤酒生产和表征
啤酒生产
阿德努加等人。（2010年）的方法进行了细微的调整。将小麦粒在 20°C 的水中浸泡 48 小时，间隔 8 小时换水。麦芽制作过程包括使小麦粒在覆盖有聚乙烯尼龙的干净托盘上发芽五天，然后进行70℃热风烘干。取出细根，将谷物粉碎成粗粒，在密封容器中保存在室温下直至需要。然后，称取 115 g 粉碎的麦芽麦粒过筛，并在 5 L 60 ℃ 温水中浸泡 30 分钟。麦芽汁沸腾后，除去用过的粗砂。在煮沸两小时的 10 分钟处将剩余的啤酒花颗粒和苦瓜粉添加到麦芽汁中。将啤酒花颗粒和苦瓜粉按以下比例添加到麦芽汁中：100%、75:25、50:50 和 25:75。用温水将麦芽汁填充至原体积，然后在12℃下冷却。加入啤酒酵母5g，发酵14天。发酵过程结束后，使用 80 °C 的蒸馏器操作提取发酵啤酒中的酒精。使用酒精计监测酒精含量。最后，啤酒被装瓶并陈酿三个月。

总酚测定
为了评估啤酒样品的总苯酚含量，将 50 µL 样品与 500 µL 10%v/v Folin-Cioalteau 试剂和 400 µL 7.5% 碳酸钠 (Na 2 CO 3 ) 混合。然后将反应混合物在45℃温育40分钟，并在765nm处测量吸光度。使用没食子酸作为标准，将总酚含量确定为没食子酸当量（GAE）（Singleton等人，  1999）。

总黄酮的测定
使用 Meda 等人提出的方法确定了啤酒样品的总黄酮含量。（2005）。将啤酒样品 (500 µL) 用 50 µL 10% 氯化铝 (AlCl 3 )、50 µL 1 M 乙酸钾 (CH 3 COOK) 和 1.4 µL 蒸馏水稀释。将反应混合物在室温下孵育30分钟，并在415 nm处读取吸光度。总黄酮含量以槲皮素当量（QE）表示，以槲皮素为标准。

实验设计
对 Oboh 和 Ogunruku ( 2010 ) 的饲料成分方法进行了一些修改。从阿库雷联邦理工大学生物化学系动物屋获得 40 只 5 周大的成熟雄性 Wistar 大鼠（150-175 克），并给予两周的适应期。在典型的实验室环境下，将大鼠饲养在无菌塑料笼中，光照/黑暗周期为 12 小时，然后在适应期间喂食市售颗粒饲料并饮水。

动物护理和处理
阿库雷联邦理工大学研究与开发中心 (CERAD) 伦理委员会授权使用和处理协议（道德编号：FUTA/ETH/20/25）以及动物的处理，遵循已发布的指南由美国国立卫生研究院 (NIH) 设计，用于实验动物的护理。该研究是在尼日利亚阿库雷联邦理工大学的功能食品、保健品和植物医学实验室进行的。

血糖生成指数
五 (5) 组，每组五 (5) 只大鼠，由二十五 (25) 只雄性白化成年 Wistar 大鼠建立，这些大鼠购自阿库雷联邦理工大学 (FUTA) 生物化学系动物屋。大鼠可以不受限制地饮水，并喂食市售颗粒饲料。经过两周的适应后，他们被禁止进食，并在接受啤酒样品之前禁食过夜。使用 Accu-Chek Fine 测试血糖仪以 0、30、60、90、120、150 和 180 分钟的间隔检查大鼠的血糖水平，同时通过口腔插管给予样品。然后使用梯形公式计算血糖反应（Dona 等人，  2010 年；Wolever 等人，  1991 年）。

在 HFD 喂养的 Wistar 大鼠中用 STZ 诱导糖尿病（2 型糖尿病大鼠模型）
使用 Srinivasan 和 Ramarao 的改良程序诱发糖尿病（2007）。成年Wistar大鼠在给药前给予市售大鼠饲料（粗蛋白含量15%，粗脂肪含量4%，粗纤维含量1.1%，钙、磷、赖氨酸含量0.38%）。接受高脂肪饮食。这些颗粒是从阿库雷的农场支持处获得的。适应后，将大鼠分为两个饮食组：正常对照（NC）和高脂饮食（HFD）。为了诱导 HFD 喂养的大鼠患糖尿病，在 HFD 饮食控制两周后，以 35 mg/kg 体重的单剂量腹腔注射 STZ。诱导后72小时通过尾静脉穿刺采集血样测量大鼠血糖水平，并使用自动自动分析仪（Fine-test Auto-coding TM）测定空腹血糖水平。该研究使用了空腹血糖水平> 200 mg/dL 的大鼠。对照组腹腔注射1 mL 0.1molL柠檬酸盐缓冲液。从糖尿病大鼠中随机创建七组，每组五只糖尿病大鼠。然后使用啤酒样品对不同的组进行不同的治疗计划。将大鼠分组如下：

I 组：正常对照（柠檬酸盐缓冲液 pH 4.5；腹腔注射 1 mL/kg）。—NC。

第二组：2型糖尿病对照组——DC。

第三组：2型糖尿病大鼠给予25mgkg -1体重口服剂量的阿卡波糖-阿卡波糖。

第四组：2型糖尿病大鼠口服15ml kg -1体重的仅用啤酒花调味的啤酒样品-HP。

V组：2型糖尿病大鼠口服15ml kg -1体重仅用苦瓜调味的啤酒样品。-BG。

第VI组：2型糖尿病大鼠口服15ml kg -1体重的用75％啤酒花和25％苦瓜调味的啤酒样品-75:25BG。

第七组：2型糖尿病大鼠口服15ml kg -1体重的用50%啤酒花和50%苦瓜调味的啤酒样品——50:50BG。

第VIII组：2型糖尿病大鼠口服15ml kg -1体重的啤酒样品，用25%啤酒花和75%苦瓜调味——25:75 BG。

让动物禁食过夜，第15天处死动物，立即分离胰腺组织。将一小部分切入 Trizol® 中进行 RNA 提取，剩余组织用冷盐水溶液冲洗，然后用磷酸盐缓冲液（0.1 M pH 7.4）匀浆，5,000 g 离心 10 分钟，收集上清液用于测定的生化测定。将心脏血收集至普通瓶中并制备成血清，用于使用Calbiotech® ELISA试剂盒进行胰岛素测定。

血糖水平的测定
Fine-test Auto-coding TM 血糖仪采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测量血糖水平。在 14 天的治疗期间，每三天检查一次空腹血糖水平。治疗两周后，使用 Randox 测试套件评估血清葡萄糖水平。

α-葡萄糖苷酶活性测定
简而言之，将 430 µL 磷酸盐缓冲液、15 µL GSH 和 15 µL 上清液（肠匀浆）移入试管中。将混合物在 37°C 下孵育 10 分钟后，添加 40 µL 对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷溶液。在 37°C 下再孵育 20 分钟后，将2 mL Na 2 CO 3添加到溶液中。在 400 nm 处读取吸光度（Apostolidis 等人，  2007）。

脂肪酶活性的测定
使用露西亚等人。( 2006 ) 方法，在含有 1 mL 底物、0.5 mL 磷酸盐缓冲液和 100 µL 组织（已用蒸馏水稀释至 3 mL）的反应混合物中评估胰脂肪酶的活性。40℃孵育5分钟后加入200μL异丙醇，在410nm处测量吸光度。底物含有 19 mL 溶液 B 和 1 mL 溶液 A（40 mg 棕榈酸对硝基苯酯，溶于 12 mL 异丙醇）（0.1 g 阿拉伯树胶和 0.4 mL Triton X）。

RNA 提取和逆转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR)
使用 Trizol® 从每组大鼠的胰腺中提取总 RNA。使用 Nanodrop2000TM 测量样品中的 RNA，用 1.5% 琼脂糖凝胶可视化，并用 DNase I（Invitrogen）处理。使用 iScriptTM cDNA 合成试剂盒创建 1 g cDNA。对于所有表达水平，使用两个参考基因——胰岛素和 GLUT-2——作为基准。需要进行 40 个热循环（94°C 15 秒、60°C 10 秒和 72°C 30 秒）才能完成反应，反应的最终体积为 20:l，加入量为 2.5 ng/L。 cDNA、1 × PCR 缓冲液、每种引物 0.2 M、0.2 mM dNTP、2 mM MgCl 2、0.1 × SYBR® Green 和 0.25 U 铂 Taq DNA（Olagoke 等人，  2021 年））。使用 94°C 10 秒、55°C 1 分钟和 94°C 15 秒的单个循环，获得解离曲线以验证每个反应的单个独特产物的扩增。利用 SYBR 荧光，使用设计和分析工具 StepOne™。该反应在三到六个不同的实验中一式三份进行。使用2CT方法确定基因表达值(Livak & Schmittgen  2001 )。

数据分析
一式三份研究的汇总数据表示为平均值和标准差。使用 IBM SPSS Statistics for Windows 版本 20（IBM Corp.，Armonk，NY，USA），使用单向方差分析对平均值进行比较，然后进行 Duncan 多重范围检验和最小显着性差异。结果以p  < 0.05 被接受（Yalta  2008）。

结果与讨论
在糖尿病患者中，摄入碳水化合物后，身体使用或保留葡萄糖的能力会下降，并且肝脏在两餐之间会产生更多的葡萄糖，从而导致高血糖（Szablewski  2011）。高血糖是由胰岛素合成减少、胰岛素作用降低或两种疾病的组合引起的（Czech  2017）。控制高血糖的一种主要方法是通过饮食干预。这项研究的重点是如何利用生产的啤酒作为控制高血糖的饮食干预措施。

链脲佐菌素 (STZ) 通过引发坏死和破坏胰腺 β 细胞来损害胰岛素分泌，从而导致 1 型糖尿病中出现的类似情况。然而，低剂量的 STZ 通过触发受影响的 β 细胞凋亡而不是坏死，从而轻微损害胰岛素分泌，从而使受损的胰腺 β 细胞再生；类似于 2 型糖尿病 (T2DM) 的病症。然而，胰岛素分泌的轻度受损并不能解决与 T2DM 相关的胰岛素抵抗问题。然而，各种研究表明，喂食 HFD 的大鼠会出现胰岛素抵抗，因此创建了一个 HFD/STZ 模型，该模型会导致胰岛素分泌轻度受损，并且胰岛素抵抗与 T2DM 状况非常相似（Nath 等人，2017 年 ； Sahin 等人）等 2007年; 斯里尼瓦桑等人。 2005）。图 1显示除未诱导的正常对照组外，各组实验动物的空腹血糖> 200 mg/dl。在 14 天的治疗期间，除糖尿病控制外，接受治疗的动物的空腹血糖水平均有所下降。14天治疗后，使用Randox葡萄糖试剂盒分析血糖水平，结果如图 2所示。所有治疗组均与糖尿病对照组显着不同。与其他处理组相比，用不同苦瓜含量的啤酒样品处理的组的血糖较低。更重要的是，25:75BG 的血糖水平最低，但与其他组没有显着差异。

在管理 T2DM 方面，建议的方法之一是促进低血糖指数 (GI) 食品/食品的消费（Oboh 等人，  2021）。表1显示了啤酒样品的 GI。GI 是衡量餐后血糖反应的指标。各种研究的结果表明，胃肠道和糖尿病管理之间存在密切关系（Akerele 等人，  2021 年；Bell 等人，  2015 年；Eleazu  2016 年））。标有高 GI 的食品往往会比标有低 GI 的食品更快、更高地升高餐后血糖。GI 55及以下的食品/食品被归类为低GI食品，与食用高GI食品相比，这些产品往往使消费者有更长时间的饱腹感。GI 为 56-70 的食物被归类为中等 GI 食物，而 70 及以上的食物被归类为高 GI 食物（Foster-Powell et al.  2002 ））。啤酒样品的 GI 范围为 37-62。含有最高苦瓜:啤酒花(25:75BG)的啤酒样本的GI最低为37，而仅含有苦瓜(BG)的啤酒样本的GI最高(62)。这一观察结果可能是由于啤酒样品中的酚类（苯酚和类黄酮）含量所致，这表明啤酒样品中苦瓜的含量与啤酒花的比例较高，酚类和类黄酮含量也较高。总酚和黄酮含量见表2结果表明，添加25%啤酒花和75%苦瓜的啤酒样品中酚类物质含量最高。啤酒花和苦瓜中的酚类物质之间可能存在反应，随着苦瓜含量的增加，黄酮类和酚类物质的含量也会增加。这与 Akerele 等人的早期发现形成鲜明对比。( 2022 )表明，啤酒样品中苦叶与啤酒花的含量比例越高，GI 就越高。然而，本研究中啤酒样品中苦瓜与啤酒花的含量比例越高，GI 就越低。

在治疗 T2DM 方面，不同的研究人员提出了多种机制。其中之一是抑制碳水化合物代谢酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）活性。α-淀粉酶通过作用于淀粉分子中的α-1,4糖苷键将淀粉聚合物水解成小链糊精，而α-葡萄糖苷酶则将二糖分解成葡萄糖。因此，抑制这些酶可以降低餐后血糖的升高（Kazeem et al.  2013；Teng & Chen  2017）。不同的报道将这些酶的抑制与植物中存在的（多）酚联系起来（AL-Ishaq 等人，  2019）。结果如图 3所示结果表明，与糖尿病对照相比，经过处理的样品具有较低的酶活性。然而，与其他处理组相比，具有不同啤酒花：苦瓜比例的样品对 α-淀粉酶活性具有更高的抑制作用。另外，图 4中啤酒样品对糖尿病大鼠α-葡萄糖苷酶活性的影响也表明，不同比例啤酒花：苦瓜夹杂物的啤酒样品对α-葡萄糖苷酶活性也有较高的抑制作用。啤酒样品对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用可能是由于啤酒花和苦瓜叶中的酚类成分造成的。这与过去的几项研究一致（AL-Ishaq 等人，  2019 年；Kazeem 等人，  2013 年））将这些淀粉水解酶的抑制与植物的酚类成分联系起来。这表明碳水化合物代谢酶与GI之间存在相关性。

脂肪酶活性的抑制也被提议作为管理或控制 T2DM 的另一种机制。脂肪酶催化三酰甘油 (TAG) 分解为甘油和脂肪酸。然而，血浆脂肪酸增加与胰岛素抵抗有关，因此抑制脂肪酶活性有助于抑制胰岛素抵抗（Dostálek 等人，  2017 年；Park 等人，  2020 年）。图 5显示各种啤酒样品对脂肪酶活性的影响。处理后的样品均抑制脂肪酶活性，其中BG、50:50BG、25:75BG对脂肪酶活性抑制效果最高。然而，最高百分比的 BG 与啤酒花一起似乎对脂肪酶活性具有更高的抑制作用。这也对应于 GI、α-葡萄糖苷酶和血浆葡萄糖水平的结果。脂肪酶的抑制与 Rahim 等人的报告一致。( 2015 )表明多酚，特别是黄酮类化合物具有很强的脂肪酶抑制能力。脂肪酶活性的抑制与啤酒样品中酚类和类黄酮的含量相对应（表2）。

HOMA-IR 被设计为胰岛素抵抗的间接测量，标志着 T2DM 的早期阶段。它源自空腹血糖和空腹胰岛素水平。它告诉我们需要多少胰岛素来控制血糖水平。尽管不同的研究报告了不同的 HOMA-IR 范围，但一致认为 HOMA-IR 水平越高，胰岛素抵抗越严重（Matthews et al.  1985；Gutch et al.  2015；Sinaiko & Caprio  2012）。表3显示具有最高 HOMA-IR 水平的 DC 组。随着苦瓜与啤酒花的比例增加，HOMA-IR 水平降低，但差异并不显着。HOMA-IR 水平也可能是胰岛素基因上调的原因，因为 HOMA-IR 水平对应于用啤酒样品处理的大鼠中胰岛素的表达。

表3 苦瓜味无醇小麦啤酒治疗STZ诱导的糖尿病大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR水平
全尺寸桌子
在分子水平上进一步探讨了啤酒样品对糖尿病大鼠的影响。葡萄糖转运蛋白 GLUT-2 在葡萄糖刺激的胰腺 β 细胞产生胰岛素和肝细胞中的葡萄糖代谢中发挥着关键作用。在胰腺 β 细胞中，GLUT-2 充当葡萄糖传感器，检测血糖水平的微小波动并增加胰岛素的释放 (Ogilvy-Stuart & Beardsall  2020 )。这项研究证明了胰岛素和 GLUT-2 mRNA 表达之间的关系。如图6所示，BG 治疗组的 GLUT-2 表达最高， 如图7所示，胰岛素治疗组的 GLUT-2 表达最高。 ，与DC和NC显着不同。胰岛素表达对应于 GLUT-2 表达。虽然没有显着差异，但胰岛素表达随着 BG 包含百分比的增加而上调，这也对应于 GLUT-2 表达中可获得的结果。这与表明 GLUT-2 表达和胰岛素表达之间存在联系的各种研究一致（Al-Shaqha 等人，  2015 年；Sharawy 等人，  2016 年）。此外，GLUT-2 和胰岛素的上调可能是由于啤酒样品中的酚类含量所致。槲皮素是苦瓜中已知的酚类成分（Saliu et al.  2019据报道，它可以减少 GLUT-2 的葡萄糖吸收，并抑制磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K) 的胰岛素依赖性激活，从而为胰岛素表达的上调创造空间。槲皮素还对活化 β 细胞的核因子 kappa 轻链增强子 (NF-κB) 具有调节作用，有助于改善葡萄糖刺激的胰岛素分泌 (AL-Ishaq et al.  2019 )。

结论
这项研究的结果表明，与仅用啤酒花调味的啤酒相比，无酒精 BG 风味啤酒对 T2DM 管理的所有拟议机制都有更好的效果。因此，苦瓜/啤酒花风味啤酒对治疗 T2DM 的所有拟议机制都有影响，使其成为一种很有前景的饮料，不仅有助于满足糖尿病患者对啤酒的渴求，还有助于降低血糖。然而，可以对糖尿病患者进行进一步的试验，以确定这种饮料在临床试验中的效果。