介绍
次声是一种频率低于20 Hz、人耳几乎听不到的环境噪声[ 1 ]。次声可由许多天然来源产生，例如海浪、风和火山喷发[ 2 ]。次声是振动声学疾病（VAD）的主要原因[ 3 ]。目前，随着电子设备的广泛使用，我们的环境中产生的次声越来越多[ 4 ]。次声具有长距离传播衰减小、振动/穿透力强、防护困难等特点，使次声成为一种重要的环境污染物，对公众健康构成新的威胁[ 5 , 6 ]。

次声对人类和啮齿动物的多个器官产生不利影响，其中中枢神经系统（CNS）特别容易受到次声暴露（IE）的影响[ 7,8,9 ]。次声会导致一系列症状，其中学习和记忆障碍是最常见的[ 10 ]。

作为学习和记忆的中心，海马在IE后表现出星形胶质细胞的过度激活[ 11,12,13 ]。这一结果表明星形胶质细胞可能参与学习和记忆的损害。然而，潜在的分子机制仍不清楚。星形胶质细胞的一个特征是其高水平的半通道 (HC)，这是星形胶质细胞功能状态的标志 [ 14 , 15 ]，而 Connexin43 (Cx43) 是海马星形胶质细胞中 HC 的主要分子成分 [ 16 , 17 , 18]]。越来越多的证据已证实 Cx43 HC与病理条件下的认知障碍有关，例如帕金森病和神经退行性疾病[ 19,20,21,22 ] 。因此，本研究的目的是阐明海马星形胶质细胞和星形胶质细胞 Cx43 HC 在 IE 下学习和记忆障碍期间的作用。基于药理学方法，我们发现阻断Cx43 HCs或下调Cx43表达可有效改善IE大鼠的学习和记忆障碍。

作为质膜通道，Cx43 HC 允许胶质递质通过并提供内部和外部环境之间的快速通信 [ 23 , 24 ]。在体外，我们发现 IE 促进 Cx43 HC 过度释放谷氨酸和 ATP。这种反应取决于促炎细胞因子。因此，这些结果揭示了次声学习和记忆损伤发病机制的新机制。

材料和方法
动物和分组
Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，7~8周龄，体重：220~250 g）购自中日友好医院动物中心。实验符合中日友好医院批准的《实验动物护理与使用指南》。将大鼠（每笼 n = 4 只）饲养在聚碳酸酯笼中，并在温度控制室 (24 ± 1 °C) 中进行 12 小时的光/暗循环。

将42只大鼠随机分为以下组，每组6只：Sham组、IE组、FCA(氟柠檬酸盐)-IE组(FCA是星形胶质细胞活化抑制剂)、TAT-Gap19-IE组(TAT-Gap19是星形胶质细胞活化抑制剂)、TAT-Gap19-IE组(TAT-Gap19是Cx43 HC 的特异性阻断剂）、TAT-Gap19I130A-IE 组（TAT-Gap19I130A 是 I130A 修饰的 Gap19 类似物）、siRNA Cx43-IE 组（siRNA Cx43 是靶向Cx43的小干扰 RNA (siRNA) ）和非靶向siRNA-IE组（非靶向siRNA是对照siRNA，对Cx43表达没有影响）。图 1A显示了动物实验过程。

次声波照射
正如我们之前的研究[ 25,26 ]所述，次声系统包括次声发生器、功率放大器、次声舱、次声传感器和数据收集系统。次声发生器产生声压为 90-140 dB、频率范围为 2-20 Hz 的次声波。在次声暴露期间，我们使用次声传感器和数据收集系统监测和分析频率和声压级。

根据既往研究，16 Hz、130 dB 次声暴露明显影响大鼠的学习记忆能力 [ 12 , 25 ]。因此，本研究采用16 Hz频率和130 dB声压。大鼠每天暴露在 16 Hz 和 130 dB 次声下 2 小时，持续 14 天。Sham 组包括将大鼠每天放置在次声舱中 2 小时，持续 14 天，但不暴露于次声。

使用的药物及其管理
我们将两个无菌聚乙烯管插入大鼠双侧海马体。使用脑立体定位仪，我们确定注射点的坐标如下： 前后位（AP）：距离Bergma 2.8 mm；内侧 (ML)：距前囟 1.5 毫米；背腹侧 (DV)：距颅骨表面 2.7 毫米。墨水染色显示显微注射部位为海马（图 2）。

为了评估星形胶质细胞在 IE 引起的学习和记忆障碍中的功能，使用 FCA（Sigma-Aldrich，Cat#F9634）来抑制星形胶质细胞激活。FCA 溶液如前所述制备，并以 0.5 μL/只/大鼠、1 nmol 溶解于 1 μL 改良林格氏溶液中给药 [ 27 , 28 ]。

我们还使用短干扰RNA（siRNA，序列：rGrCrArGrUrGrCrArCrArUrGrUrArArCrUrArArUrUrUrATT）来敲低Cx43表达，以阐明Cx43 HC在IE诱导的学习和记忆障碍中的作用。根据前期研究制备了靶向Cx43的siRNA [ 29 ]。简而言之，将包含四种靶向Cx43（400 ng，siCx43，Dharmacon Research）或非靶向 siRNA（对照 siRNA，Dharmacon Research）的 siRNA 双链体的 SMART-pool® 与INTERFERin®混合(Polyplus-转染)，用含有 5% 葡萄糖的盐水溶液 (0.9%) 稀释，终体积为 5μL，注射前在冰上放置 20 分钟。在正常大鼠中，靶向Cx43的siRNA下调海马中约30%的Cx43 mRNA水平（参见补充材料图 1）。

根据实验设计，我们使用 TAT-Gap19（Sigma-Aldrich，目录号 SML2319，0.5 μL/侧/大鼠，1 nmol 溶于 1 μL 改良林格氏溶液）来封闭 Cx43 HC。同时，使用 I130A 修饰的 Gap19 类似物 TAT-Gap19I130A（0.5 μL/侧/大鼠，1 nmol 于 1 μL 修饰的林格氏溶液中）作为阴性对照肽。氨基酸 I130 形成对 Gap19 活性很重要的氢键 [ 30 ]。因此，TAT-Gap19I130A对HCs中的Cx43活性没有抑制作用。

IE 前两小时，通过聚乙烯管缓慢输注 TAT-Gap19、TAT-Gap19I130A 或 FCA，聚乙烯管通过 PE-20 管连接至微量输注泵（CMA 400 注射泵、CMA 微透析）驱动的微量注射器。如前所述，IE 期间输注流量为每天 0.5 mL/min [ 31 ]。Cx43的 siRNA或非靶向 siRNA（分别为 4 μL）在 IE 前 30 分钟注射，IE 期间每两天注射一次，注射速度为 0.5 μL/min。

学习和记忆测试
在次声暴露 14 天后的第 1 天，使用莫里斯水迷宫 (MWM) 评估空间学习和参考/工作记忆 [ 32 , 33]。迷宫由一个直径为 178 厘米的黑色圆形水箱组成，水箱内装满水至 37 厘米深，分为四个象限（A-D）。将有机玻璃平台（直径 = 10.2 厘米）放置在距池壁约 28 厘米的象限 C（东南象限），并浸没在水线以下 2 厘米处。每只动物都进行了 6 天的测试。在该测试中，进行了为期5天的测试块（习得试验，每天四次试验）来检测大鼠的空间学习能力。在每次试验中，老鼠被随机放入一个象限，面朝墙壁。在 120 秒的给定时间内，我们记录了到达平台的延迟。如果老鼠无法到达平台，我们会亲自引导它们到达平台。到达后，将大鼠留在平台上30 s，然后在下一次测试之前休息 5 分钟。为了确定非空间因素的作用，在第六天，将平台升高到水线以上 2 厘米，让大鼠能够看到它。第六天，还进行了一次单探针试验来评估记忆保留情况。移除平台并允许大鼠探索迷宫30秒。检测指标为：在目标象限停留时间比例（%）和跨越平台位置的频率。

星形胶质细胞培养和分组
海马星形胶质细胞的培养与我们之前的研究相同[ 34 ]。简而言之，将大鼠（新生 SD 大鼠（1 天））在未麻醉的情况下斩首并取出大脑。仔细分离海马，用 2.5% 胰蛋白酶消化，并在含有 10% 胎牛血清（FBS；Invitrogen，Cat#10099141C）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM；Invitrogen，Cat#11,965,092）中解离成单细胞悬浮液，链霉素 (0.2 mg/mL) 和青霉素 (80 单位/mL)。我们将解离的细胞铺在带有玻璃盖玻片的塑料培养皿上，并在 37 ℃、5% CO 2存在的潮湿环境中孵育。。五天后，用 DMEM 洗涤去除细胞碎片。最后，将样品在37℃下振荡过夜以去除小胶质细胞和少突胶质细胞。免疫荧光细胞化学染色（使用抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP；Sigma-Aldrich，Cat#C9205，RRID：AB_476889）显示培养物纯度超过95%（参见补充材料图 2）。培养12-15天后，这些星形胶质细胞为后续实验做好了准备。

体外培养的星形胶质细胞随机分为以下组：假手术组、IE组、TAT-Gap19-IE组、TAT-Gap19I130A-IE组、siRNA Cx43-IE组、非靶向siRNA-IE组、sTNF-αR1-IE组。组（sTNF-αR1是肿瘤坏死因子α受体（TNF-α受体）的可溶形式），IL-1ra-IE组（IL-1ra是白细胞介素（IL）-1β受体的重组拮抗剂）， MR16-1-IE组（MR16-1是抗IL-6受体（IL-6R）抗体）。对于每组，将纯化的星形胶质细胞以 5 × 10 4 个细胞/cm 2的密度铺板到 6 个玻璃盖玻片（用于免疫细胞化学）或 1 × 10 6 个细胞/cm 2上在 35 毫米培养皿中（用于 ATP/谷氨酸/炎症细胞因子测量、定量实时逆转录 PCR、染料摄取测定。每个实验 6 个培养皿）。因此，每个实验的样本量为 6。图 1B显示了体外实验过程。

用次声和化学试剂处理星形胶质细胞
为了在培养的星形胶质细胞中产生 IE 模型，将玻璃盖玻片或培养皿（培养的星形胶质细胞）放入次声室中，并暴露于 16 Hz 和 130 dB 次声 2 小时 [ 8,12,26 ]。

IE 前 1 小时，用以下药物分别处理星形胶质细胞：TAT-Gap19 (100 μM)、TAT-Gap19I130A (100 μM)、sTNF-αR1（R&D Systems，目录号 425-R1-050；200 ng/mL)、IL-1ra (Sigma-Aldrich, Cat#SRP6006; 200 ng/mL)、MR16-1 (中外制药有限公司, 200 ng/mL)。在 IE 处理前 24 小时转染 siRNA Cx43 或非靶向 siRNA。

染料吸收测定
如前所述，在培养的星形胶质细胞中进行染料摄取测定，以测量 HC 活性[ 35 ]。IE 后，将培养的星形胶质细胞与 HC 可渗透荧光示踪剂溴化乙锭（Etd；Sigma-Aldrich，Cat#46067）在 37℃、终浓度 4 μM 下孵育 10 分钟。与 Etd 孵育 10 分钟后，用 Hank 平衡盐溶液（HBSS，Invitrogen，目录号 24020117）洗涤星形胶质细胞五次，用 4% 多聚甲醛固定，并使用显微镜（Olympus）检测。荧光强度计算如下：各星形胶质细胞的荧光强度（F）减去背景的荧光强度（F0）。

细胞外液中谷氨酸的测定
IE后，通过250× g离心4分钟分离星形胶质细胞的培养基 ，然后使用高压液相色谱（HPLC，Waters）评估细胞外液中谷氨酸的水平[ 34 ]。

简而言之，使用邻苯二甲醛（OPA；Sigma-Aldrich，Cat#P0657）衍生化细胞外液。OPA 衍生物通过 C18 反相 Adsorbosphere OPA-HR 柱（Alltech），并使用流动相 A（乙酸钠、二恶烷和异丙醇的混合物，92.5/4.5/3.0 (v/v)）和流动相 B（甲醇、二恶烷和异丙醇的混合物，97/1.5/1.5 (v/v)）。使用荧光检测器检测谷氨酸水平，激发和发射波长分别为338和450 nm。

细胞外液中 ATP 的测定
使用荧光素/荧光素酶生物发光检测试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号119,107）来检测细胞外 ATP 水平。标准曲线用于计算样品中 ATP 的量，并根据使用 Bio-Rad 蛋白质测定 (Bio-Rad) 测定的蛋白质浓度进行标准化。

细胞外液中炎症细胞因子的测定
IE后收集培养基，并根据供应商的说明（南京建成生物工程研究所，IL-10）同时使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。 1β：目录号 H002-1-2，IL-6：目录号 H007-1-2，TNF-α：目录号 H052-1-2）。

免疫细胞化学
在盖玻片上培养星形胶质细胞，然后与识别 GFAP 的小鼠单克隆抗体（Sigma-Aldrich，Cat#C9205，RRID：AB_476889）和识别 Cx43 的兔多克隆抗体（Sigma-Aldrich，Cat#SAB4501173，RRID：AB_476889）一起孵育4°C 过夜。洗涤后，星形胶质细胞与二抗在室温下孵育2小时。使用激光共焦扫描显微镜（IX-70；奥林巴斯）检测免疫染色信号。

实时定量逆转录PCR分析
使用定量实时逆转录 PCR (qRT-PCR) 评估海马或培养的星形胶质细胞中的Cx43表达。Trizol 试剂（Invitrogen，目录号 15596026）用于从大鼠海马或培养的星形胶质细胞中提取总 RNA。使用逆转录将总RNA转化为cDNA。使用带有 Power SYBR green PCR Master Mix 试剂盒（Takara）的 ABI 7901HT 序列检测系统（Applied Biosystems）以 cDNA 作为模板进行 qPCR 步骤。测定使用以下引物：Cx43：正向引物：CGTGGAGAATGCACCTGAA，反向引物：CCACTGGATGAGCAGGAA，Gapdh（编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：正向引物：AGCCCAGAAACATCATCCCTG，反向引物：CACCACCTTCTTGATTGTCATC。加普德表达用于标准化所有数据，其进一步标准化为对照中的表达。

统计分析
定量结果以平均值±标准差（SD）表示。使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验来检验正态性。采用t检验来比较两组之间的数据。多组之间的比较使用单因素方差分析 (ANOVA)，然后进行 Tukey 事后分析。使用GraphPad Prism 9.0软件(GraphPad Inc)进行统计分析。p值<0.05被认为表明统计显着性。

结果
IE 损害大鼠海马学习和记忆
MWM 测试用于确定 IE 对空间学习和参考/工作记忆的影响。

在第4天和第5天，接受IE的大鼠比Sham组的大鼠需要更长的时间到达具有复杂运动轨迹的水下平台，这表明IE损害了空间学习（图3  A，B；第4天：t = 4.153， p = 0.0117，df = 10；第 5 天：t = 5.144，p = 0.0050，df = 10）。第 6 天，Sham 大鼠和接受 IE 的大鼠在到达可见平台的潜伏期方面没有显着差异（图 3 C；t = 0.2331，p = 0.8204，df = 10），这证实了不同的逃避潜伏期与视力差异无关。这些发现表明 IE 损害了大鼠的空间学习能力。

在 MWM 测试的最后一天，我们移除平台并记录在象限 C 中花费的时间以及穿过平台区域的频率，以分析参考和/或工作记忆保留情况。与 IE 处理的大鼠相比，Sham 组的大鼠表现出更好的记忆保留（在象限 C 上花费的分配时间百分比更高（图 3 D、E；t = 3.363，p = 0.0072，df = 10）。表明IE损害了大鼠的记忆，在穿越平台区频率的分析中也得到了类似的结果，即IE治疗组大鼠穿越平台区的频率低于Sham组大鼠（图3D，  F） ；t = 2.951，p = 0.0145，df = 10）。两组的游泳速度没有差异（图 3 ）G; t = 1.347，p = 0.2078，df = 10），表明运动缺陷并未导致观察到的差异。

抑制星形胶质细胞或 Cx43 半通道可改善 IE 引起的学习和记忆障碍
IE 增加 GFAP 表达，这是星形胶质细胞激活的标志物 [ 12 , 13 ]。因此，我们探讨了星形胶质细胞是否与 IE 引起的学习和记忆受损有关。将FCA（一种星形胶质细胞抑制剂）显微注射到IE处理的大鼠的海马中，减少了它们的逃避潜伏期，增加了在目标象限C上花费的时间，并将穿过平台区的频率增加到假手术组的水平（图 4A） 、B、C；平台延迟：第 3 天：F(4, 25) = 4.608，p = 0.0063，事后分析：IE与FCA-IE 组：p = 0.0449；第 4 天：F(4, 25 ) = 9.634，p < 0.0001，事后分析：IE vs.FCA-IE 组：p = 0.0185；第 5 天：F(4, 25) = 14.32，p < 0.0001，事后分析：IE与FCA-IE 组：p = 0.0265；目标象限 C 中的时间百分比：F(4, 25) = 6.289，p = 0.0012，事后分析：IE与FCA-IE 组：p = 0.0397；目标交叉时间：F(4, 25) = 7.579，p = 0.0004，事后分析：IE与FCA-IE 组：p = 0.0361）。这些发现表明 IE 主要通过星形胶质细胞诱导学习和记忆受损。

海马星形胶质细胞中 HC 的主要分子标记和组成部分是 Cx43 [ 36 ]。Cx43 HC 在病理条件下的认知障碍中发挥作用[ 15,37,38 ]。因此，我们研究了 Cx43 HC 在 IE 引起的学习和记忆障碍中的作用。我们使用 Gap19（一种 Cx43 细胞内环结构域的阻断肽）来阻断 Cx43 HC。为了增加 Gap19 的细胞膜通透性，我们将其与 TAT 膜易位基序 (TAT-Gap19) 偶联，其 C 末端位于细胞内 [ 39 ]。将TAT-Gap19显微注射到海马可有效减少IE引起的学习和记忆障碍（图 4 ）A、B、C；平台延迟：第 5 天：事后分析：IE与TAT-Gap19-IE 组：p = 0.0108；目标象限 C 中的时间百分比：事后分析：IE与TAT-Gap19-IE 组：p = 0.0442；目标跨越时间：事后分析：IE与TAT-Gap19-IE 组：p = 0.0068），表明 Cx43 HC 可能介导 IE 引起的学习和记忆障碍。此外，结构与TAT-Gap19相似但对HCs没有影响的TAT-Gap19I130A并没有改变IE对学习和记忆的影响（图 4A、B、C）。

在显微注射针对Cx43的 siRNA 后，我们观察到海马中Cx43 mRNA水平下降了约 50% 。(图 4G；F(3, 20)=8.584，p=0.0006，事后分析：IE与siRNA-Cx43-IE组：p=0.0007)。该结果还显示 IE 增加了海马中的 Cx43 表达（图 4 G；事后分析：假手术组与IE 组：p = 0.0484）。正如预期的那样，siRNA-Cx43 治疗显着减少了 IE 造成的学习和记忆障碍（图 4 D、E、F；平台延迟：第 5 天：F(3, 20) = 13.90，p < 0.0001，事后分析：IE vs.siRNA-Cx43-IE组：p=0.0013；目标象限 C 中的时间百分比：F(3, 20) = 12.79，p = 0.0002，事后分析：IE与siRNA-Cx43-IE 组：p = 0.0014；靶点交叉时间：F(3, 20) = 9.162，p = 0.0005，事后分析：IE与siRNA-Cx43-IE 组：p = 0.0176），而使用非靶向 siRNA 治疗对 IE 诱导没有影响学习和记忆障碍。

综上所述，我们的结果表明星形胶质细胞 Cx43 HC 介导 IE 诱导的学习和记忆障碍。

IE 导致 Cx43 半通道介导的星形胶质细胞释放谷氨酸和 ATP
我们的研究结果表明，星形胶质细胞Cx43 HCs参与了IE引起的学习和记忆障碍；因此，研究了原代海马星形胶质细胞的详细机制。过去的研究表明，Cx43 HC 通过释放神经活性物质（例如 ATP 和谷氨酸）（现在称为“胶质递质”）发挥作用[ 40 ]。我们使用 HPLC 检查了 IE 后细胞外液中的谷氨酸水平。与对照星形胶质细胞（假手术组：1.57 nmol/mL）相比，IE 导致细胞外谷氨酸水平显着增加（至 7.72 nmol/mL），大约增加了五倍（F(5, 30) = 54.73，p < 0.0001，事后分析：假手术组与 IE 组：p < 0.0001；图 5A）。同样，与对照组相比，细胞外 ATP 水平增加了四倍（从 19.17 pmol/mg 蛋白质增加到 75.5 pmol/mg 蛋白质；（F(5, 30) = 84.52，p < 0.0001，事后分析：假手术组与IE 组：p < 0.0001；图 5 B).这些发现表明 IE 诱导谷氨酸和 ATP 的过度释放。

此外，TAT-Gap19 部分消除了 IE 引起的谷氨酸释放，如 IE 组与 TAT-Gap19-IE、Sham 和 TAT-Gap19-IE 组之间的差异所示。谷氨酸水平下降至约 3.70 nmol/mL（事后分析：TAT-gap19-IE 与 IE 组：p < 0.0001；TAT-gap19-IE 与 Sham 组：p = 0.0019；图 5 A）。类似地，siRNA介导的Cx43敲低（而非非靶向siRNA）也部分抑制了IE诱导的谷氨酸释放。谷氨酸水平下降至约 5.65 nmol/mL（事后分析：siRNA Cx43-IE 与 IE 组：p = 0.0028；siRNA Cx43-IE 与 Sham 组：p < 0.0001；图 5A）。TAT-Gap19 还强烈减少 IE 诱导的 ATP 释放。TAT-gap19-IE 组的 ATP 水平约为 35.50 pmol/mg 蛋白质（事后分析：TAT-gap19-IE 与 IE 组：p < 0.0001；TAT-gap19-IE 与 Sham 组：p = 0.0065；图 5 B)。siRNA-Cx43（而非非靶向 siRNA）敲低 Cx43，也显着消除了 IE 诱导的 ATP 释放。siRNA Cx43-IE 组的 ATP 水平约为 34.83 pmol/mg 蛋白质（事后分析：siRNA Cx43-IE 与 IE 组：p < 0.0001；siRNA Cx43-IE 与 Sham 组：p = 0.0098；图.5  _B). 这些结果表明 Cx43 HC 导致谷氨酸和 ATP 的过度释放。作为兴奋性神经递质，谷氨酸和 ATP 的过度信号传导是海马神经元损伤的主要原因，导致学习和记忆能力受损[ 41 ]。

IE 诱导的谷氨酸和 ATP 释放取决于促炎细胞因子
在病理条件下，星形胶质细胞释放大量炎症细胞因子，通过自分泌/旁分泌信号传导调节星形胶质细胞的分子、形态和功能特性[ 42 ]。因此，使用 ELISA 检测星形胶质细胞暴露于 IE 后细胞外液中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的变化。在 IE 处理的星形胶质细胞的细胞外液中，与 Sham 组相比，IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的水平分别增加了两倍、四倍和六倍（IL-1β： t = 6.422，df = 10，p < 0.0001；IL-6：t = 12.31，df = 10，p < 0.0001；TNF-α：t = 9.982，df = 10，p < 0.0001；图 6A）。这些结果表明 IE 诱导星形胶质细胞释放促炎细胞因子。

我们还测试了促炎细胞因子释放的增加是否与 IE 诱导的星形胶质细胞的谷氨酸和 ATP 释放有关。使用结合 TNF-α (sTNF-αR1) 的可溶形式 TNF-α 受体 (sTNF-αR1) 对星形胶质细胞进行预处理，TNF-α 受体是 IL-1β 受体 (IL-1ra) 或抗 IL-6 受体 (IL-6) 的重组拮抗剂。 6R) 抗体 (MR16-1)。与对照组相比，所有三种预处理均大大减少了 IE 引起的谷氨酸和 ATP 的释放（ATP：F(4, 25) = 73.60，p < 0.0001，事后分析：所有 p < 0.0001；谷氨酸：F (4, 25) = 86.91，p < 0.0001，事后分析：所有 p < 0.0001 图 6B、C)。因此，促炎细胞因子的释放似乎对于 IE 诱导的谷氨酸和 ATP 的过度释放至关重要。

IE 激活培养物中的星形胶质细胞
我们的研究结果表明，IE 诱导培养的星形胶质细胞上的 Cx43 HC 释放 ATP 和谷氨酸。进一步的免疫细胞化学实验显示 Cx43 在培养的海马星形胶质细胞上广泛分布（图 7 A）。对照组Cx43信号的平均荧光强度（MFI）为22.83±10.28（AU），作为基线值。与 Sham 组相比，IE 组的 MFI 显着增加至 38.00 ± 9.19 (AU)（Sham与IE 组：t = 2.667，df = 10，p = 0.0296，图 7 A、B）。此外，IE 增加了星形胶质细胞标记物 GFAP 的表达（假手术组与IE 组：t = 2.521，df = 10，p = 0.0406，图 7 ）A、B）。这些发现表明 IE 激活了星形胶质细胞。使用 qRT-PCR 观察到类似的结果：与 Sham 组相比， IE 组的Cx43 mRNA 表达增加（Sham与IE 组：t = 6.083，df = 10，p = 0.0001，图 7 C）。

Etd 摄取率用于评估 Cx43 HC 的功能状态。Etd 只能通过特定的 HC 穿过星形胶质细胞质膜。IE后，我们检测到与Sham组星形胶质细胞相比，星形胶质细胞的Etd摄取率快速增加（两倍）（图 7D）。这一结果表明 IE 触发了 HC 的开放。TAT-Gap19 或 siRNA-Cx43，但不是 TAT-Gap19I130A 或非靶向 siRNA，有效消除了 IE 引起的 Etd 摄取增加 (F (7, 40) = 67.08，p < 0.0001，事后分析：TAT-Gap19- IE与. IE 组：p < 0.0001；TAT-Gap19I130A-IE与. IE 组：p = 0.9994；siRNA Cx43-IE 与 IE 组：p < 0.0001；非靶向 siRNA-IE与. IE 组：p = 0.9204；图.7  _d)，表明IE打开了Cx43 HC。有趣的是，当我们应用 sTNF-αR1、IL-1ra 或 MR16-1 时，Cx43 HC 的开放受到抑制（sTNF-αR1-IE与. IE 组：p = 0.0001；IL-1ra-IE与. IE 组：p = 0.0483；MR16-1-IE与IE 组：p = 0.0023）。这些发现表明促炎细胞因子介导 Cx43 HC 的开放，导致谷氨酸和 ATP 的过度释放。

讨论
本文报告的研究结果表明，正如 MWM 测试结果所表明的那样，次声会导致学习和记忆受损。这可能是通过星形胶质细胞 Cx43 HC 实现的，因为阻断 Cx43 HC 可以减轻这种损害。此外，在体外，IE 激活原代培养的海马星形胶质细胞中 Cx43 HC 的开放。这种增强的 HC 开放是由促炎细胞因子介导的，然后促炎细胞因子促进谷氨酸和 ATP 的过度释放，这可能是 IE 诱导的学习和记忆障碍的机制。

在此，MWM用于评估大鼠的学习和记忆能力。MWM 广泛用于评估依赖于海马体的空间学习和记忆，并且与长时程增强 (LTP) 密切相关[ 43 , 44 ]。受损的学习记忆使逃避潜伏期增加，在目标象限（C）的时间减少，IE后大鼠穿过目标象限的次数减少，这与之前的研究结果一致[ 10,12,45 ]]。值得注意的是，各组大鼠在池中的游泳速度大致相同，这表明它们在 MWM 中的表现不受运动因素的干扰。此外，陆地运动功能的损伤与游泳速度无关，这也可能解释了 MWM 中学习和记忆表现与运动效应的独立性。

海马显微注射星形胶质细胞抑制剂、Cx43 HCs 阻滞剂或靶向CX43的 siRNA表明 IE 诱导的学习和记忆损伤通过星形胶质细胞 Cx43 HCs 活性起作用。这一发现与之前的一些研究一致，表明 HCs 失调与不同神经退行性疾病的进展有关，这些神经退行性疾病的特征是学习和记忆的破坏 [ 46 , 47 ]]。然而，我们仅验证了siRNA对整个海马中Cx43 mRNA的抑制作用，并未在选定区域中验证。因此，尚不清楚哪个部分起作用（CA1、CA2 还是 CA3？）。今后我们将针对这一点进行研究。在本研究中，FCA用于抑制星形胶质细胞的活性。FCA 是一种代谢毒物，可抑制三羧酸 (TCA) 乌头酸酶，并被大脑中的星形胶质细胞选择性吸收 [ 48 , 49 ]。FCA 可以引起星形胶质细胞功能的可逆和选择性破坏[ 48 , 50 ]。因此，FCA 已被广泛用于研究星形胶质细胞在大脑中的作用[ 48]。我们之前的研究表明，星形胶质细胞表现出 GFAP 表达降低和形态改变，其特征是胞体较小，突起细长 [ 51 ]。此外，我们的初步实验表明显微注射程序对MWM的结果没有影响，这排除了显微注射本身对我们研究结果的干扰。

在这项研究中，我们通过 Etd 吸收实验证明次声增加了 HC 的开放。通过 siRNA 介导的星形胶质细胞中蛋白质 CX43 水平下调，Etd 摄取减少揭示了 IE 诱导的 HC 活性是由 Cx43 引起的。TAT-Gap19（一种阻断 Cx43 HC 的 Cx43 模拟肽）治疗也减少了 Etd 的摄取。合成九肽 Gap19 对应于 Cx43 CL 后半部分的 AA 128-136，构成 L2 区域的一部分 [ 52 ] Gap19 包含细胞膜易位基序 KKFK，有助于质膜通透性 [ 53 ]。与 Gap26 和 Gap27 相比，Gap19 在抑制 Cx43 半通道方面更具选择性，而不影响 Cx43 间隙连接 [ 39]。此外，Gap19 与膜易位基序 TAT 偶联，以进一步增强其细胞膜通透性，因为 C 末端尾部位于细胞内 [ 39 ]。我们的结果支持在病理暴露下星形胶质细胞的 HC 开口增加，包括约束应激 [ 54 ]、癫痫发作 [ 55 ]、高渗刺激 [ 34 ]、脊髓损伤 [ 56 , 57 ] 和急性感染 [ 17 , 58 ] 。

胶质递质是神经元-星形胶质细胞通讯过程中的重要递质，当 Cx43 HC 打开时会释放 [ 59 , 60 ]。过去的研究表明，不受控制的 HCs 开放可能导致兴奋性毒性神经胶质递质的过度释放 [ 61 ]。在此，我们注意到 IE 增强了星形胶质细胞 Cx43 HC 的过量谷氨酸和 ATP 释放。突触间隙的高浓度谷氨酸和 ATP 可以通过激活嘌呤能受体 P2X 7/N-甲基 D-天冬氨酸 (NMDA) 受体来降低神经元存活率 [ 54 ]。在各种病理条件下的神经元中也观察到了这一点[ 62,63,64 ]]，这可能构成IE后学习记忆障碍的主要机制。此外，HCs释放过量的ATP会激活嘌呤能受体P2Y1，这也与认知能力下降有关[ 65 , 66 ]。研究表明 P2Y1 受体的下调会产生神经保护作用 [ 67 ]。Pannexin1 (PANX1)被认为与Cx43 HC具有相似的功能，并且可以在病理条件下释放胶质递质[ 68 ]。因此，在本研究中，Panx1可能促进了IE促进的过量谷氨酸和ATP释放。

IE如何唤起Cx43 HC打开？研究表明，星形胶质细胞释放大量炎症细胞因子，通过其自分泌/旁分泌信号在分子、形态和功能水平上调节星形胶质细胞的特性[ 42 ]。在此，我们表明，暴露于次声会促使 Cx43 HC 打开，这取决于星形胶质细胞释放促炎细胞因子。然而，我们没有研究详细的信号通路。Cx43 HC 开放依赖于细胞因子的产生以及随后 p38 丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)/诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)/细胞色素 C 氧化酶亚基 2 (COX2)/无机钙 ([Ca 2+)的激活]i) 依赖性途径和嘌呤能/谷氨酸信号传导通过 α-突触核蛋白得到增强。在我们的下一项研究中，我们将研究这些信号通路是否参与 IE 条件下促炎细胞因子诱导的 Cx43 HC 打开。

除了释放谷氨酸外，星形胶质细胞还产生大量的功能性谷氨酸转运蛋白以完成谷氨酸的摄取[ 69 ]。病理条件，例如缺血性损伤，可能会降低星形胶质细胞中谷氨酸转运蛋白的表达[ 70 ]，从而导致星形胶质细胞对谷氨酸的摄取减少，从而导致细胞外液中谷氨酸水平降低。这些或许可以解释为什么 Cx43 HC 的阻断不能完全（但只能部分）抑制 IE 诱导的谷氨酸水平增加。

这项研究有一些局限性。1.我们没有调查次声暴露后学习记忆能力的变化。然而，我们过去的研究表明，16 Hz、90 dB 次声引起的线粒体和微管紊乱从次声照射后第 7 d 开始逐渐减轻[ 71 ]。因此，我们推测次声引起的学习和记忆障碍可能是暂时的。2. 在本研究中，我们仅评估次声对空间学习和记忆的影响。原因是海马体作为空间学习和记忆的中心，特别容易受到次声的影响[ 8,25,72 ]]。目前，还没有关于次声对其他类型的学习/记忆（例如识别记忆）影响的研究。我们将来会研究这一点。3.培养液中的星形胶质细胞与体内星形胶质细胞的外部环境不同。虽然次声具有穿透力强、衰减低的特点，但培养的星形胶质细胞在体内对次声暴露可能表现出不同的反应。星形胶质细胞和神经元或急性海马切片的共培养可能是优选的。

次声还会对听力和/或前庭功能产生负面影响。一项案例研究显示，在 46 名接受次声采访的员工中，14 名员工报告了听觉症状，9 名员工报告了前庭症状 [ 73 ]。动物实验还发现，次声损伤了豚鼠前庭终末器官的超微结构，增加了可听阈值[ 74 , 75 ]。

根据之前的研究，汽车在高速行驶时会产生 12-16 Hz、110-130 dB 的次声[ 76 ]。因此，本研究中次声参数设置为16 Hz、130 dB。在现实世界中，次声暴露可能是更持久的声音暴露。然而，大多数研究中的暴露时间约为7-30天。未来，我们将研究对动物的长期影响（2个月或更长时间）。

总之，我们确定了次声损害学习和记忆能力的机制，涉及细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的连续刺激，导致星形胶质细胞Cx43 HC开放进一步增加，从而导致谷氨酸和 ATP 的过量释放。基于此过程的替代药理学策略可用于在次声暴露后保持学习和记忆能力。