介绍
肾脏是重要的器官，具有产生尿液、调节血压、维持电解质平衡和分泌促红细胞生成素等多种功能。慢性肾脏病（CKD）是指肾功能长期受损，是人类和兽医学中常见但严重的疾病1,2。国际肾脏兴趣协会制定了对狗和猫的 CKD 进行分类的指南，根据实验室值和临床特征进行从 1 期到 4 期的分类3。猫的 CKD 发病率尤其随着年龄的增长而增加2,4。尽管导致猫患上肾脏疾病的具体因素尚不清楚，但由此导致的肾功能下降会阻碍废物的排泄，从而在体内积聚并导致尿毒症。尿毒症可引起神经系统异常，从而导致死亡5–7。因此，确定 CKD 的有效治疗方法至关重要。

在兽医实践和人类医学中，都强调使用热量控制饮食和特定饮食成分作为治疗 CKD 和预防其复发和/或进展的方法8。最近，慢性肾病的治疗方法主要集中在低蛋白饮食与有效补充剂的结合上。已证明具有单独有益作用的补充化合物包括活性炭，可通过吸收体内毒素来减少肾衰竭9,10,栎树（壳斗科常绿阔叶树）可预防大鼠尿石的形成11, 碳酸钙可降低 CKD 大鼠的血磷水平12、壳聚糖（甲壳类动物壳的成分）通过吸收肠道毒素来缓解狗的慢性肾病9,13,14, 海藻酸钠与壳聚糖联合使用可改善肾功能衰竭和糖尿病15和叶酸可改善肾性贫血并延缓 CKD 的进展16,17 号。然而，补充剂对 CKD 的作用仍不清楚，需要进一步的基础研究。

迄今为止，各种遗传模型18,19, 药物诱导模型20,21以及手术模型的开发是为了更全面地阐明 CKD 的病理生理学并帮助开发治疗方法。通过手术减少残余肾组织来实现肾功能下降的手术模型比其他模型更耗时。

CKD 的常规手术模型主要有两种类型。在 5/6 肾盂切除模型中，通过手术减少肾组织以降低肾功能22。该模型涉及通过手术切除一侧肾脏的三分之二，然后在恢复期后完全切除对侧肾脏，从而切除总肾组织的 5/6。5/6脑白质切除模型由于需要两期手术，属于侵入性手术，死亡率较高21,23。CKD的另一种手术模型是5/6梗塞肾切除术（INx）模型，通过完全切除一侧肾脏，然后在显微镜下结扎对侧肾动脉分支来诱导肾梗塞，从而减少肾组织24–26。该模型为一期手术，存活率高。据估计，这两种模型都代表了大约 17% 的残余肾组织；这对应于狗和猫的 IRIS 3-4 期 CKD，以及人类医学中只能通过透析或肾移植才能有效治疗的 CKD 水平。

由于缺乏显着的治疗效果，先前旨在使用 5/6 脊髓灰质切除术和 INx 模型进行药物开发的研究举措经常被放弃。然而，鉴于 CKD 随着时间的推移而进展，在疾病变得严重之前，1-2 期 CKD 可能存在治愈机会。因此，我们设想需要一种模拟中度 CKD 的动物模型，并寻求开发这样的模型。

在本研究中，我们开发了 4/6 INx 模型，它是传统 5/6 INx 模型的修改，并比较了这 2 个 INx 模型的特性。为了证明 4/6 INx 模型的应用，我们还将其与 5/6 INx 模型在补充化合物 (SC) 的效果方面进行了比较，该补充化合物被认为是 CKD 及其相关并发症的有效治疗方法。

方法
动物
该研究使用八周大的雄性路易斯大鼠（日本查尔斯河实验室）。动物饲养在室温23±1°C、湿度50±10%、14小时：10小时光照到黑暗循环的环境中。他们随意喂食标准食物（CE-2，CLEA Japan，Inc.）并允许自由饮水。在进行任何干预之前，让老鼠适应这种环境一周。将动物随机分为以下四组：

4/6 INx (n = 6)；

4/6 INx SC(+)（n = 6）；

5/6 INx (n = 6)；

5/6 INx SC(+) (n = 3)。

4/6 INx和5/6 INx组中的动物也分别用作4/6 INx SC(-)和5/6 INx SC(-)组。

该研究得到了机构动物护理和使用委员会（日本兽医和生命科学大学，日本东京；许可证号 2022K-25）的批准，该委员会遵循日本兽医和生命科学大学实验动物护理和使用指南。本报告的所有部分均遵守报告动物研究的 ARRIVE 指南27。

4/6 和 5/6 INx 的手术程序
为了诱导肾衰竭，如前所述进行 5/6 INx26。简而言之，对处于 2% 异氟烷吸入麻醉下的大鼠进行上正中剖腹手术。显微镜下用4-0丝线结扎右肾动脉、肾静脉、输尿管，取出右肾。随后，识别出左肾动脉的上下分支，并用7-0丝线选择性结扎，以严重梗塞约三分之二的肾皮质。用4-0丝线缝合腹壁和皮肤（图1a）。

图 1
INx 手术示意图。(a)对于 5/6 INx，在显微镜下切除右肾；随后选择性结扎左肾动脉的上下分支，使肾皮质约三分之二严重梗塞。(b)对于 4/6 INx，在显微镜下切除右肾后，选择性结扎左肾动脉的上支，以严重梗死约三分之一的肾皮质。
4/6 INx 的执行对之前描述的 5/6 INx 程序进行了较小的修改。具体来说，选择性结扎左肾动脉的上支，严重梗死约三分之一的肾皮质（图1b）。

为了减少肾梗塞以外的手术侵入性，在手术期间和术后完全清醒之前使用加热垫（KN-475-3-40，Natsume Seisakusho Co., Ltd.）维持动物的体温。根据标准兽医实践，所有动物均在颈背区域皮下注射1 mL/kg抗生素头孢美唑钠（0.1 g/mL，NIPRO Co., Ltd.），并进行监测直至术后完全意识清醒。手术后每天服用一次抗生素，持续两天。

含有补充化合物的定制饮食可治疗慢性肾病
本研究使用的SC含有碳酸钙、壳聚糖、棕榈壳活性炭、栎树提取物、海藻酸钠、维生素B6和叶酸是一种支持猫肾功能的膳食补充剂，由 Withpety Co., Ltd.（日本神奈川县）提供。SC的组成如图所示表格1。如前所述，将 SC 混合到提供给动物的啮齿动物标准固体饮食（CE-2，CLEA Japan，Inc.）中。根据推荐的每日猫剂量（120 mg/kg 体重）调整饮食中 SC 的比例，让大鼠摄入猫剂量（360 mg/kg 体重）的三倍，以防止损失在摄入量中。具体而言，将3.6克SC添加到1千克标准啮齿动物饲料中。定制饮食中 SC 各成分的含量如下所示表格1。从术后第 1 天到第 63 天，向 4/6 INx SC(+) 和 5/6 INx SC(+) 组提供含有 SC 的定制饮食。

 缩略图
表1
补充化合物的组成以及定制饮食中补充化合物的每种成分的量。
本研究中使用的 SC 含有碳酸钙、壳聚糖、活性炭、栎树提取物、海藻酸钠、维生素 B 6和叶酸。然后，将 3.6 g SC 添加到 1 kg 标准啮齿动物饲料中。

血液生化和血液学检查
在 2% 异氟烷吸入麻醉下（如之前所述的手术操作）从颈静脉采集 100 μL 血样，并在术前以及术后 1、7、21、35、49 和 63 天进行生化检测。 INx 程序。使用手持式血液分析仪（i-STAT CHEM8+ 试剂盒，Abbott Japan Co., Ltd.；i-STAT 血液分析仪，Abbott）评估血尿素氮 (BUN)、肌酐、血细胞比容 (Hct) 和血红蛋白 (Hb) 。为了量化这些生化和血液学参数的术后变化，变化率计算为相对于术前值的变化百分比。

组织病理学分析
INx后第63天，用2%异氟烷麻醉动物（如之前描述的外科手术），并通过收集全血实施安乐死，以促进肾脏的组织病理学分析。肾脏被移除；肾脏标本固定在 10% 磷酸盐缓冲福尔马林中。为了评估从头侧到尾侧的皮质和髓质，将固定的组织纵向切割并包埋在石蜡中，然后在最大切割表面切片，然后进行苏木精-伊红和马森三色染色。每个肾脏切片均使用 NanoZoomer-SQ 40× 模式（0.23 μm/像素）扫描仪（Hamamatsu Photonics KK）进行扫描。

使用 Fiji/Image J 软件版本 2.9.0/1.53t 对肾组织单切片整个区域中的肾小球数量和纤维化面积进行量化28。通过除以肾组织切片的总面积来校正残余肾小球和纤维化面积的量化数量，并在组之间比较所得值。

统计分析
所有数据均以平均值±平均值的标准误表示。所有统计分析均使用 GraphPad Prism 版本 9.5.1（GraphPad 软件）进行。酌情使用重复测量双向方差分析（混合效应模型）、用于事后分析的多重不配对t检验和不配对t检验进行比较。P值<0.05被认为具有统计显着性。

结果
4/6 INx 和 5/6 INx 型号的特性比较
在4/6 INx和5/6 INx组中，INx后体重立即下降，与5/6 INx组相比，4/6 INx组的绝对下降幅度较小。随后，体重在术后第 63 天有所增加，并且在整个期间，4/6 INx 组的体重显着高于 5/6 INx 组（P < 0.0001）（图2a）。实验期间两组的存活率均为 100%。

图 2
4/6 INx 和 5/6 INx 组的特性。(a)体重变化；(b)尿素氮；(c) BUN变化率；(d)肌酸酐；(e)肌酸酐变化率；(f)血细胞比容；(g)血细胞比容变化率；(h)血红蛋白；(i)血红蛋白变化率。数据表示为平均值±平均值的标准误差。4/6 INx 组，n = 6；5/6 INx 组，n = 6。
从术前测量到术后第 63 天，4/6 INx 组的 BUN 显着低于 5/6 INx 组（P < 0.05）（图2b）。术后第 1 天，4/6 INx 组 BUN 变化率显着低于 5/6 INx 组（P < 0.05）（图2c）。同样，从术前测量到术后第 63 天，4/6 INx 组的肌酐显着低于 5/6 INx 组（P < 0.05）（图2d）。术后第1天和第63天，4/6 INx组肌酐变化率显着低于5/6 INx组（P < 0.05）（图2e）。

在术前和术后第 1 天和第 7 天测量时，4/6 INx 组的 Hct 和 Hb 均显着低于 5/6 INx 组。相比之下，4/6 INx 组的 Hct 和 Hb 显着较高术后第 35 天和第 63 天组与 5/6 INx 组比较 ( P < 0.05) (图2f和2小时）。术后第 1、21、35、63 天，4/6 INx 组 Hct、Hb 变化率均显着高于 5/6 INx 组（P < 0.05）。图2g和2i）。

4/6 INx和5/6 INx模型组织病理学变化的比较
4/6 INx 和 5/6 INx 组的肾脏梗塞区域均观察到皮质萎缩。然而，与 4/6 INx 组相比，5/6 INx 组出现更明显的萎缩（无花果。3a-3d）。此外，5/6 INx 组的肾脏重量显着低于 4/6 INx 组（P < 0.05）（图3e）。4/6 INx 组和 5/6 INx 组之间残余肾小球的数量没有差异（图3f）。4/6 INx 组纤维化面积明显小于 5/6 INx 组（P < 0.01）（图3g）。

图3
4/6 INx 和5/6 INx 组的组织病理学变化。(a) 4/6 INx组肾脏HE染色；(b) 4/6 INx 组的 MT 染色肾脏；(c) 5/6 INx组的肾脏HE染色；(d) 5/6 INx 组的 MT 染色肾脏；(e)肾脏重量；(f)残余肾小球的数量；(g)肾脏纤维化区域。数据表示为平均值±平均值的标准误差。4/6 INx 组，n = 6；5/6 INx 组，n = 6。
补充化合物对各模型体重和肾功能的影响
在 4/6 INx 和 5/6 INx 组中，体重没有差异，具体取决于动物是否接受有或没有 SC 的饮食（无花果。4a和4b）。此外，实验期间所有组均表现出100%的存活率。

术后第49天和第63天，4/6 INx组的BUN有降低的趋势，且SC(+)饮食组的BUN变化率显着低于SC(-)组饮食（BUN变化率：P <0.05）（无花果。4c和4d）。在 4/6 INx 组中，肌酐的值和变化率并没有因饮食是否包含 SC 而有所不同（无花果。4e和4f）。从术后第 1 天到第 63 天，5/6 INx 组中，与 SC(-) 饮食的动物相比，SC(+) 饮食的动物的 BUN 往往更高（图4g）。术后第63天，5/6 INx组BUN变化率SC(+)饮食组显着高于SC(-)饮食组（P < 0.05）（图4h）。同样，从术后第 1 天到第 63 天，5/6 INx 组中，饲喂 SC(+) 饮食的动物的肌酐往往高于饲喂 SC(-) 饮食的动物（图4i）。术后第 63 天，5/6 INx 组肌酐变化率 SC(+) 饮食组显着高于 SC(-) 饮食组（P < 0.05）（图4j）。

在 4/6 INx 组中，Hct 和 Hb 的绝对值和变化率并没有因动物接受有或没有 SC 的饮食而有所不同（无花果。4k–4n )。术后第 35 天，5/6 INx 组中，与接受 SC(-) 饮食的动物相比，饲喂 SC(+) 饮食的动物的 Hct 显着降低（P < 0.05）（图4o）。5/6 INx 组术后第 1 天，SC(+) 饮食组 Hct 变化率显着低于 SC(-) 饮食组（P < 0.01）（图 4p )。在 5/6 INx 组中，饲喂有或没有 SC 饮食的动物之间的 Hb 没有差异（图4q）；术后第 1 天，SC(+) 饮食组动物的 Hb 变化率显着低于 SC(-) 组动物（P < 0.01）（图4r）。

补充化合物对每个模型中肾脏组织病理学结果的影响
在 4/6 INx 和 5/6 INx 组中，肾脏梗塞区域的皮质萎缩并没有因动物接受有或没有 SC 的饮食而有所不同。无花果。5a-5h）。此外，在 4/6 INx 或 5/6 INx 组中，饲喂 SC(+) 与 SC(-) 饮食的动物之间的肾脏重量、残余肾小球数量和纤维化面积没有差异（无花果。5i–5n )。

讨论
迄今为止，已经报道了许多涉及手术技术的 CKD 模型，以期进行研究以更全面地了解这种疾病状态并开发 CKD 的治疗方法22,24–26。然而，已经建立的5/6 INx模型可能不适合用于开发CKD疗法。例如，在长期实验中，一些 5/6 INx 模型受试者可能在研究期间发展为终末期肾病，从而没有资格继续参与研究直至研究结束29。在本研究中，我们开发了 4/6 INx 模型，该模型旨在模拟中度 CKD，与传统 5/6 INx 模型中结扎的血管数量相比，减少肾动脉分支中结扎的血管数量。之前没有关于使用我们的方法生产 CKD 模型的报道。

本研究中开发的 4/6 INx 模型显示，与传统 5/6 INx 模型相比，术后体重损失更少，体重恢复更快，总体状况更好。此外，与 5/6 INx 组相比，4/6 INx 组的肾功能下降更为温和。然而，需要进一步的病理学研究以及肾小球滤过率和肾脏重吸收能力的测定，以更详细地表征 4/6 INx 模型。此外，虽然两种模型到术后第63天的存活率均为100%，但还需要进一步研究来验证术后第63天后模型之间的存活率差异。

此外，5/6 脑白质切除模型中已有报道出现肾性贫血，这是 CKD 的并发症30–34。在肾实质结扎诱导的5/6肾切除模型中，有报道称术后5周出现肾性贫血35。本研究中，5/6 INx组也出现肾性贫血，而4/6 Inx组则未出现，进一步表明4/6 Inx模型是不发生肾性贫血的中度CKD模型。Hct和Hb水平不受脱水和肠出血等肾外因素的影响，因此认为残余正常肾组织的百分比可以直接反映肾功能。鉴于这些发现，4/6 Inx 模型可被视为中度 CKD 模型，对应于 IRIS 指南中的 1-2 期 CKD。

为了演示4/6 Inx模型大鼠的应用，给4/6 Inx组和5/6 Inx组的动物提供包含SC的定制饮食，并验证SC的效果。在5/6 Inx组中，术后第63天，5/6 Inx SC(+)组的BUN和肌酐水平高于5/6 INx SC(-)组。这些现象表明，患者中存在严重的CKD 5/6 INx 组取得了进展，因此无法评估 SC 的效果。相比之下，4/6 INx 组的 BUN 显着下降，证明了 SC 的效果。然而，SC 在这两种模型中均未表现出组织病理学效应。

鉴于之前有报道称活性炭、碳酸钙和壳聚糖（所有这些都是 SC 的成分）可以改善 BUN9,10,12–14，并且，在本研究中，SC与4/6 INx SC(+)组的BUN改善相关，因此连续摄入SC可能不仅影响肾组织修复，还可能影响蛋白质吸收或代谢过程在肾脏外进行，从而减少肾功能的下降。此外，虽然SC中各成分的含量比之前报告中使用的数量要少10–12,14,15,17 号,36，4/6 INx 模型对中度 CKD 的模仿可能使 SC 的效果变得明显。

这项研究有几个局限性。首先，尽管结扎肾动脉分支，在肉眼下诱导肾表面三分之一或三分之二的梗塞，但没有评估肾脏内部运行的血管，并且没有精确评估梗塞体积。因此，4/6 INx 和 5/6 INx 组中个体之间存在差异的可能性仍然存在。其次，虽然 SC 的功效在 4/6 INx 模型中得到了证明，但尚不清楚 SC 的哪些组件是有效的。有必要确定活性成分并研究与 SC 观察到的效果是否存在剂量依赖性相关性。最后，据报道，人类 CKD 存在性别差异，女性 CKD 发病率较高，男性更有可能进展为终末期肾病37–39。然而，这项研究仅包括雄性大鼠。需要进一步的研究来确定是否可以在雌性大鼠中重现类似的结果。

结论
通过选择性结扎肾动脉分支作为传统5/6 INx大鼠模型的改进，我们开发了比传统模型更温和、更稳定的4/6 INx CKD模型。鉴于由此能够选择不同的 CKD 模型以适应各种特定的研究目的，可以预期在阐明这种疾病状态以及开发 CKD 治疗方法方面取得进一步进展。特别是，中度 4/6 INx CKD 模型可能会揭示旨在预防 CKD 并抑制其进展的药物和补充剂的有效性。不同模型的使用还有助于减少实验动物的数量并改善动物福利。