介绍
识别在以前的遭遇中安全的熟悉味道的能力对于饮食选择和生存至关重要。一种新奇的口味会引起一种新奇反应，这种反应会在第二次接触该口味时减弱，而不会产生负面后果，从而导致消费增加。恐新症（AN）的减弱需要鼻周皮层（Prh）的完整性，这是一个涉及味觉和物体识别记忆的大脑区域。因此，Prh 兴奋性毒性 [ 1 ] 和利多卡因可逆性病变 [ 2]] 分别干扰第二次醋和糖精溶液消耗量的增加。我们之前也报道过由基底外侧杏仁核（BLA）兴奋性毒性损伤引起的类似损伤。在第二次接触醋溶液期间，这些病变破坏了与 AN 相关的 Prh 活性模式 [ 3 ]。尽管如此，被破坏的关键机制尚不清楚。

有证据支持 BLA 参与口味新颖性检测。事实上，BLA 永久性和可逆性损伤已被发现会干扰对 0.5% 糖精钠溶液的恐惧症 [ 4 , 5 ]，并且一种新型糖精溶液在 BLA 中诱导的 c-Fos 表达高于熟悉的糖精溶液诱导的表达 [ 6 ]。然而，Lin 和同事 [ 4] 使用 0.1% 乙酸戊酯溶液，未发现 BLA 损伤对气味恐惧症有影响。这是一个相关问题，因为在自然条件下很少发现味道是孤立的，但它与其他成分（例如气味）相关，因此使用“风味”一词更加合适。事实上，我们报告称，使用苹果醋溶液（一种含有乙酸气味成分的香料），伏隔核壳 [ 7 ] 和内侧前额皮质 [ 8 ] 在第二次暴露期间活性增加。然而，没有关于 BLA 在醋熟悉过程中的作用的数据。

细胞色素氧化酶 (CCO) 是神经活动的标志物，指示 ATP 根据氧化代谢活动需求而增加和减少。因此，与其他标记物不同，CCO 不仅可以让我们检测到大脑活动的增加，还可以检测到大脑活动的减少。该技术之前已被应用于使用潜在抑制程序来评估与厌恶性调节的味觉熟悉度相关的大脑代谢活动的变化[ 9 ]。同样，CCO 组织化学已被证明对于绘制参与空间学习获取 [ 10 , 11 ]、检索 [ 12 ] 和消退 [ 11 ]的功能性大脑网络具有巨大价值。]。它还对各种治疗对空间记忆的影响敏感，例如社会隔离[ 13 ]、母亲分离[ 14 ]、锻炼[ 15 ]和药物干预[ 16 ]。

因此，第一次和第二次接触醋期间的 CCO 定量将使我们能够评估 BLA 在检测风味新颖性或风味熟悉度方面的潜在参与。第一次风味接触期间 BLA 代谢活性的增加将支持新奇检测的作用。这与使用纯味觉解决方案发现的结果一致。另一方面，在第二次风味接触期间 BLA 代谢活性的增加表明在风味熟悉中发挥作用。这与报道的 BLA 损伤对 AN 的破坏是一致的。考虑到所用香料的气味成分，评估了作为附加控制区域的嗅梨状皮层 (Pir) 以及尾状核/壳核 (Cpu) 的代谢活动。17 ]。因此，使用雄性大鼠来与之前的大脑活动结果进行比较，从而减少使用的动物数量。此外，使用雄性可以避免评估发情周期所需的轻度侵入性程序。

材料与方法
行为程序
将 21 只幼稚成年雄性 Wistar 大鼠单独圈养并维持在 12 小时明暗周期（8:00–20:00 小时）中。食物可随意获取，但水的获取仅限于每天 10:00 进行的 15 分钟实验性饮水，以及每天 16:00 进行的额外 20 分钟补液。早上记录水基线 (BL)，在 BL1、BL3 和 BL5 后对大鼠进行 3-5 分钟的处理以避免应激。在饮水基线后，将动物随机分配到以下组之一：新组（n = 8）、熟悉组（n = 5）和对照组（n = 8）。在一次（新的）或两次（熟悉的）实验过程中可以使用苹果醋溶液 (3%)。对照组在整个实验过程中喝水。

实验结束 90 分钟后，处死每只动物，取出大脑并快速冷冻在异戊烷（2-甲基丁烷；Sigma-Aldrich，德国）中，保存在 − 80 ℃ 下。在低温恒温器（Microm，HM505E，德国）中切割脑冠状切片（20 µm）。从每个大脑中取出 60 个切片，以评估 BLA、Cpu 和 Pir 中的 CCO。根据Paxinos和Watson图集[ 18 ]评估的大脑区域的立体定位坐标如图 1所示。

该程序经格拉纳达大学动物研究伦理委员会和安达卢西亚农业、渔业和农村发展地区部 (17-02-15-195) 批准，遵循 ARRIVE 指南并符合 2010 年欧盟指令/63/EU 用于动物实验。

CCO组织化学
定量 CCO 组织化学的程序已在其他地方描述过 [ 13 , 19]。简而言之，从 Wistar 大鼠获得不同厚度（10、30、50 和 70 µm）的组织匀浆标准品以量化酶活性后，将切片和标准品在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中孵育 5 分钟（ 7.6 pH），含 10% 蔗糖 (w/v) 和 5% 戊二醛 (v/v)（默克，德国）。然后将载玻片在含有 10% 蔗糖 (w/v) 的 0.01 M 磷酸盐缓冲液 (7.6 pH) 和含有 275 mg/L 六水合氯化钴、10% 蔗糖 (w/v) 的 0.05 M Tris 缓冲液 (7.6 pH) 中漂洗 3 次。 v) 和 0.5% 二甲亚砜 (v/v) 10 分钟。随后加入 1 × 0.01 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.6）。然后，将切片和标准品在 0.0075% 细胞色素-c (w/v)、0.002% 过氧化氢酶 (v/v)、5% 蔗糖 (w/v)、0.25% 二甲基亚砜 (v/v) 和 0.05% 二氨基联苯胺中孵育四盐酸盐（Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）。将切片和标准品在 0.1 磷酸盐缓冲液 (7.6 pH) 中孵育 5 分钟，在 37 ℃ 下孵育 1 小时。通过将组织固定在缓冲的 4% (v/v) 福尔马林中 30 分钟 RT 来终止反应。最后，将载玻片脱水，用二甲苯清洗并用Entellan（默克，德国）盖玻片。使用计算机图像分析系统（MCID Elite，Interfocus Imaging Ltd.，英国）通过光密度测定分析来量化 CCO 染色的强度。使用三个连续切片测量右半球每个区域的平均光密度 (OD)。在每个部分中，使用根据每个区域大小进行调整的方形采样窗口获取四个不重叠的读数，每个区域和受试者总共进行 12 次测量。对这些区域进行平均以获得每只动物的每个区域的平均值。然后，将 OD 值转换为通过光谱测定标准品的酶活性确定的 CCO 活性单位。

实验设计和统计分析
使用双因素混合方差分析设计评估风味恐新症和AN，其中包括2个水平的组间因素组（对照组饮用水；熟悉的组喝醋两次）和3个水平的受试者内因素天数（水基线） ，第一次醋暴露，第二次醋暴露），作为大鼠 ID 的随机因素（动物被随机分配到组）。应用事后 Bonferroni 测试。

考虑到需要牺牲动物来评估大脑 CCO 活动，需要额外的 Novel 组。因此，应用了双因素混合方差分析设计，包括 3 个水平的组间因素组（对照组饮用水；新组喝醋一次，熟悉组喝醋两次）和受试者内因素感兴趣区域（ROI） ）具有 3 个级别（BLA、Cpu、Pir）。同样，由于动物是随机分配到各组的，因此大鼠 ID 是随机因素。通过事后 Bonferroni 测试进行事后比较。

结果
图 2显示了饮用 3% 苹果醋溶液的熟悉组的平均摄入量 (± SEM)，这证明了与对照组饮用水相比，第二次出现的恐惧反应及其减弱。混合 2（组）× 3（天）方差分析显示受试者内的日效应 [ F (2, 18) = 41.121, p  = 0.001, η p 2  = 0.820] 和组 × 天的交互作用 [ F (2 , 18) = 61.407, p  < 0.001, η p 2  = 0.872]。也发现了群体效应 [ F (1, 9) = 23.982, p  < 0.002, η p 2 = 0.727]。Levene 检验显示所有受试者内变量的方差同质性。事后 Bonferroni 测试表明，小组互动是由于熟悉组在第 1 天喝的新型醋溶液的量少于水（基线）( p  < 0.001) 和第 2 天熟悉的醋溶液 ( p  < 0.03) 。对照组没有发现差异（p  > 0.05）。

关于 CCO 结果，图 3显示了三组（对照组、新颖组和熟悉组）每个感兴趣区域的平均 (± SEM) CCO 单位。进行混合 3（组）×3（ROI）方差分析。Levene 的检验显示所有受试者内变量的方差同质性。分析显示 ROI 具有显着影响，[ F (2,36) = 38.858, p  < 0.001, η p 2  = 0.179]。交互作用 Group × ROI [ F (4, 36) = 1.964, p  > 0.05, η p 2  = 0.683] 和主要因素 Group [ F (2, 18) = 3.235, p  > 0.05, ηp 2  = 0.264] 显着。事后 Bonferroni 测试显示，BLA 中的代谢活性高于 Pir ( p  < 0.001) 和 Cpu ( p  < 0.01)，其中 Pir 活性高于 Cpu ( p  < 0.005)。尽管交互作用并不显着，但对每个 ROI 都应用了单向方差分析，因为测试我们的假设需要了解 BLA 中各组之间的差异。他们表明仅在 BLA [ F (2,18) = 5.365, p  < 0.05, η p 2  = 0.373] 中存在显着差异，但在 Pir [ F (2,18) = 1.374, p  > 0.05, η p 2中没有显着差异 = 0.132] 或 Cpu [ F (2,18) = 0.148, p  > 0.05, η p 2  = 0.016]。事后 Bonferroni 测试表明，Familiar 组比首次饮用醋的 Novel 组 ( p  < 0.05) 和饮用水对照组 ( p  < 0.05) 表现出更高的代谢 BLA 活性。新颖组和对照组之间没有差异（p  > 0.05）。

讨论
行为结果与之前报道的一致[ 3]。新型醋溶液的摄入量减少证明了风味新恐惧症和AN，随着风味变得熟悉，第二次接触时摄入量显着增加。结果表明，两次接触醋溶液的组的 BLA 代谢活性高于接触一次的组。这支持该区域选择性地参与导致安全味道记忆形成的过程，但不支持新颖性检测。我们的结果不允许我们就与 BLA 活动相关的具体过程得出结论。BLA 在恢复第一次接触期间形成的味道记忆方面的潜在作用是可以想象的。安全记忆的检索和稳定应该在第二次风味接触中发生。因此，所报告的 BLA 活性增加与记忆恢复之间存在关联是可行的。事实上，记忆形成应该在第一次暴露期间就开始了，但在此阶段没有发现 BLA 活性变化。此外，第二次接触醋期间 BLA 活性的增加可能与选择性稳定过程有关。

此外，由于在 Pir 中没有发现显着的影响，这削弱了 BLA 中能量消耗增加可能是由于第二次暴露期间嗅觉处理增强所致的假设。这与我们之前使用 c-Fos 免疫组织化学的发现一致 [ 20 ]。我们没有发现在评估的前梨状皮层区域和后梨状皮层区域中一次和两次醋暴露引起的活性之间存在显着差异。事实上，我们之前曾报道过，在六次暴露后饮用熟悉的醋溶液会导致活性增加，但在两次暴露后则不会，仅在后 Pir 的喙部 [ 20]。该区域对应于本研究中评估的水平。因此，两次暴露后没有差异证实 Pir 在熟悉过程中没有作用。此外，在 Cpu 中没有发现风味暴露的影响，这一事实证实了 BLA 选择性参与风味熟悉。

这些发现表明，新恐惧症和 AN 可能是依赖于可分离大脑区域的独立过程。因此，与饮用水相比，饮用熟悉的醋溶液的动物的 BLA 活性选择性增加，而饮用新醋溶液的动物则没有变化。我们之前在伏隔核壳 [ 7 ] 和内侧前额皮质 [ 8]中报告了类似的结果]。尽管我们的结果不允许我们绘制电路方法，但可以想象 BLA 将与这些区域形成一个功能网络。因此，我们不能放弃所报告的 AN 期间 BLA 活动变化可能是由前额皮质等区域自上而下的控制驱动的。先前的报告表明，饮用新型糖精溶液时 BLA 活性较高 [ 6 ]，但使用 0.1% 乙酸戊酯溶液时，BLA 损伤对气味恐惧症没有影响 [ 4 ]。目前的研究结果表明，BLA 参与了风味熟悉，但不参与新颖性检测。因此，那些由有气味成分组成的风味在风味安全记忆的形成过程中将涉及BLA活性。

我们的结果证实了 CCO 技术在探索与学习和记忆相关的变化方面的价值。因此，味道识别记忆被添加到味觉和空间学习中，其中 CCO 已被证明是识别所涉及的大脑区域的有用技术。事实上，之前的报告表明，在空间学习任务训练的第一天，BLA 中的 CCO 活动有所增加 [ 21 ]。

总而言之，我们的结果将支持杏仁核在检索和/或稳定过程中的相关作用，从而导致安全的味道记忆。

结论
该研究的主要发现是，接触熟悉的醋溶液的组的 BLA 代谢活性高于接触水或新醋溶液的组。这些结果与病变研究的结果一致，并支持基底外侧杏仁核参与导致味道新恐惧症减弱的过程。