介绍
智力障碍 (ID) 被定义为早期出现的认知功能缺陷，导致日常任务和社交技能困难 [ 1 ]，影响 1-2% 的学龄儿童 [ 2 ]，并带来社会和医疗挑战。自闭症谱系障碍 (ASD) 是另一种患病率很高 (1-2%) 的神经发育疾病，其特征是存在刻板或重复行为的社交沟通困难 [ 3 , 4 , 5]。许多患有神经发育障碍的患者都有同时发生的病症，并且通常障碍的定义特征是重叠的。临床研究表明，约 70% 的 ASD 患者表现出某种形式的学习或智力障碍。此外，焦虑和多动是 ASD 的相关特征，据报道 68% 的 ASD 患者在某些时候表现出攻击性[ 3,6,7 ]。神经发育障碍中的这些重叠特征表明，类似的分子途径和神经回路在各种疾病中都受到了破坏。

染色质结构调节和表观遗传机制与认知过程有关，ID 和 ASD 中的许多突变基因编码染色质调节因子[ 8,9,10 ]。已知许多染色质重塑因子在对神经发育和可塑性重要的过程中彼此相互作用[ 11 ]。X 连锁阿尔法地中海贫血 (ATRX) 是一种 ATP 依赖性染色质重塑蛋白，可维持染色质结构完整性并调节基因表达。ATRX基因的亚形性突变会导致 ATR-X 综合征，这是一种主要影响男性的先天性综合征，因为女性受到偏斜的 X 染色体失活的保护[ 12]。ATR-X 综合征患者表现出多种症状，包括轻度至重度智力障碍、癫痫发作、小头畸形和髓鞘形成障碍。

除了智力障碍之外，ATR-X 综合征患者的一部分还表现出自闭症特征[ 13,14,15 ]。此外，ATRX突变已在患有 ID 的非综合征患者中观察到 [ 16 ]，并在 ASD 患者中得到鉴定 [ 17 , 18 ]。SFARI 基因数据库将 ATRX 列为与 ASD 相关的 1 类（高置信度）风险基因 ( https://gene.sfari.org/ )。根据这些报告，我们可以自信地推断ATRX突变与 ID 和 ASD 高度相关。

ATRX 位于基因组的异染色质区域，参与维持基因组完整性所需的抑制状态[ 19,20,21,22 ]。ATRX 在保持基因组完整性方面的作用对于活跃分裂的细胞至关重要。由于 ATRX-null 胚胎干细胞太不稳定，无法产生传统的基因敲除小鼠。在胚胎发生早期或神经祖细胞中删除 ATRX 会导致胚胎或产后早期死亡[ 23,24,25 ]。进一步的研究表明神经祖细胞中Atrx缺失后 DNA 损伤和 TP53 诱导的细胞死亡增加[ 24、25、26 ]。​ 因此，为了研究 ATRX 功能障碍如何导致所观察到的临床表型，应用条件灭活方法来灭活 ATRX，特别是在非增殖（有丝分裂后）细胞中，以避免 DNA 复制应激介导的细胞死亡。我们之前报道过，使用 αCaMKII-Cre 系小鼠删除兴奋性前脑神经元中的 ATRX 会导致长期海马依赖性空间记忆和与突触调节相关的转录变化的雄性特异性缺陷[27 ]。然而，雄性或雌性Atrx CaMKIICre小鼠均不存在自闭症表型[ 28 ]。

这使我们推测，可能需要更早地删除Atrx才能复制临床观察到的认知缺陷和自闭症谱系障碍的特征。在当前的研究中，我们利用小鼠的 NEX-Cre 驱动系从 E11.5 开始删除胚胎前脑有丝分裂后神经元中的Atrx [ 29 ]。这些动物存活到成年，可以对其行为进行彻底评估。一系列测试表明Atrx NEXCre雄性和雌性小鼠的恐惧记忆和自闭症谱系障碍特征均受损。我们还观察到性别二态性行为差异，包括男性特有的攻击性和感觉门控的改变。总体而言，这些小鼠代表了一个临床相关模型，用于研究神经元 ATRX 缺陷引起的 ASD 和 ID 的根本原因。

结果
生成胚胎前脑兴奋性神经元 ATRX 缺失的小鼠
使用 NEX-Cre 小鼠驱动系，从胚胎日 (E)11.5 开始，产生前脑有丝分裂后兴奋性神经元缺乏Atrx 的小鼠 [ 29 ]。神经元螺旋-环-螺旋蛋白-1（NEX，也称为 NeuroD6）是一种在背侧前脑有丝分裂后未成熟神经元中表达的转录因子，参与终末分化[ 30 ]。我们通过 E13.5 和 P20 的冠状脑冷冻切片的免疫组织化学证实了 ATRX 的丢失。结果表明，到 E13.5，ATRX 的损失在皮质板中很明显，神经元开始分化并表达 βIII-微管蛋白（图1 A、B）。在 P20 时，ATRX 染色表明Atrx NEXCre的 NeuN 阳性神经元中不存在该蛋白男性皮质和海马体（图1 C、D）。我们注意到 ATRX 蛋白在 P20 和 3 个月时仍然在海马齿状回的一部分细胞中表达，可能对应于神经祖细胞和 GABA 能中间神经元 [ 31 ]。ATRX 缺陷也在 E13.5 和 P20 的Atrx NEXCre女性脑冷冻切片中得到证实（图 S 1 AD）。

Atrx NEXCre小鼠的记忆障碍
动物模型中使用学习和记忆范式来测量与临床智力障碍相比的认知缺陷。用于评估智力障碍小鼠模型的两种常见学习和记忆范式是恐惧记忆测试和莫里斯水迷宫范式 [ 32 , 33 ]。首先，我们利用恐惧记忆测试，在测试的调节部分，将小鼠放置在一个侧面有明显视觉图案且铺有金属格栅地板的不透明盒子中 3 分钟。在 2.5 分钟时，动物会通过金属格栅地板受到足部电击。我们观察到，所有小鼠，无论性别或基因型如何，对电击都有相同的初始冻结反应（图2 ）A）。在测试的记忆部分，足部电击后 1.5 或 24 小时将动物放回同一装置中，并测量冻结行为。我们发现，与性别匹配的对照小鼠相比，雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠在足后 1.5 小时（雄性：p <0.0001，F=1.299；雌性：p <0.0001，F=3.250）和足后 24 小时的冻结时间明显减少休克（男性：p = 0.0002，F = 2.019；女性：p <0.0001，F = 2.830）（图2 B，C），表明ATRX的丢失导致恐惧记忆缺陷。

对于 Morris 水迷宫，将小鼠放入水浴中并进行为期 4 天的每天 4 次试验的训练，以利用空间线索找到水下平台 [ 33 ]。当小鼠在 90 秒的试验中无法找到平台时，它们被引导至平台，报告试验时间为 90 秒。在 4 天的训练中，雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠未能找到平台（图S2 A）。我们还观察到，在训练阶段，Atrx NEXCre小鼠游泳的时间逐渐减少，保持靠近墙壁或表现出漂浮行为（图 S 2 B，电影1）。自从Atrx NEXCre老鼠无法学习这项任务，我们无法使用这种范例来测试空间记忆。为了探讨莫里斯水迷宫学习阶段的失败是否可能部分是由于冷漠感增加造成的，我们进行了 6 分钟的强制游泳测试，将动物放在一个高的水缸中 6 分钟，静止的时间是测量[ 34 ]。结果显示，与性别匹配的对照组相比，Atrx NEXCre雄性小鼠不动的时间更长（ p = 0.0292，F = 2.028），这表明它们在水中表现出冷漠（图S2 C）。相反，雌性Atrx NEXCre小鼠不动的时间较少（p =0.0154，F=3.149）。性别歧视指数的计算表明，对水的冷漠行为存在显着的性别差异（p = 0.0002，F = 2.370）。

Atrx NEXCre小鼠的多动症、焦虑样行为减少和重复梳理行为
自闭症谱系障碍 (ASD) 患者和自闭症谱系障碍 (ASD) 小鼠模型通常会同时诊断多动症 [ 35 , 36 ]。因此，我们测试了活动水平，并观察到雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠表现出多动症，通过在开放区域中的行进距离和速度来测量（雄性：距离p =<0.0001，F=6.974，速度p =0.0009，F=3.678；雌性： ：距离p =<0.0001，F=13.02，速度p =0.0012，F=4.256）（图3 A、B）。

在开放场地中心花费的时间被用来衡量啮齿动物模型中的焦虑样行为。对照小鼠和Atrx NEXCre小鼠在中心花费的时间没有差异（图3C ）。由于Atrx NEXCre小鼠过度活跃，我们还测试了在中心移动的距离。与性别匹配的对照组相比， Atrx NEXCre雄性和雌性小鼠在开放区域中心移动的距离显着更长（雄性：p <0.0001，F = 2.691，雌性：p = 0.0012，F = 4.256），这表明神经元 ATRX 的丢失可能具有抗焦虑作用（图3D））。然而，在检查中心行驶距离时，运动活动的增加也可能是一个混杂变量。因此，为了进一步支持这些发现，我们在明暗盒范例中对Atrx NEXCre小鼠进行了 15 分钟的评估，并测量了与封闭的黑暗空间相比在开放和明亮区域花费的时间。与对照组相比，雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠在黑暗区域花费的时间显着减少（雄性：p <0.0001，F = 2.746，雌性：p = 0.0003，F = 1.016）。Atrx NEXCre之间从暗室进入明室的次数以及反之亦然的次数没有显着差异和对照小鼠相比，这表明突变小鼠表现出的较高活动水平不能解释在光下度过的时间增加的原因。(图3E )。我们还尝试评估高架十字迷宫中与焦虑相关的行为，然而Atrx NEXCre小鼠从装置上跳下来，无法完成任务。

重复行为代表了自闭症的一个核心特征，这一特征在小鼠的过度理毛表型中表现得很明显[ 4 ]，并在对照小鼠和Atrx NEXCre小鼠中进行了 15 分钟的评估。这表明雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠表现出重复行为，如梳理毛发的时间增加所示（雄性：p = 0.0030，F = 5.450，雌性：p = 0.0042，F = 1.281）（图3 F）。一些小鼠的重复梳理导致大片皮毛缺失，在严重的情况下，小鼠需要因自伤而被安乐死（图S3A）。

Atrx NexCre小鼠的感觉门控和嗅觉缺陷
自闭症谱系障碍患者存在感觉处理异常。为了测试这种表型，我们利用预脉冲抑制测试来检查惊吓反应和感觉门控 [ 28 , 37 ]。首先，动物接受 50 次 115 db 脉冲试验，每次试验持续 20 毫秒，每次试验间隔 20 秒。我们观察到雄性 Atrx NexCre 小鼠对这种声音刺激有夸张的惊吓反应，但雌性Atrx NexCre小鼠则没有（雄性：p = 0.0008，F = 18.08）（图4 ）A）。接下来，动物接受测试的预脉冲抑制部分，包括仅 115 db、长度 40 ms 的脉冲和四种类型的预脉冲试验： 类型 1：75 db、30 ms 之前惊吓脉冲，类型 2：80 db，惊吓前 30 毫秒，类型 3：75 db，惊吓前 100 毫秒，类型 4：80 分贝，惊吓前 100 毫秒。与对照组相比，雄性Atrx NEXCre小鼠表现出降低的预脉冲抑制（雄性：1 型：p = 0.0286，F = 1.414，2 型：p = 0.0261，F = 2.048，3 型：p = 0.0042，F = 1.549，Type 4：  p =0.0008，F=2.510）。相反，雌性Atrx NEXCre小鼠并未表现出类似的 PPI 降低（图4 ）B、C）。统计分析显示 1 型、2 型和 4 型 PPI 设置中存在显着的性别差异 [1 型 ( p = 0.0125，F = 2.955)、2 型 ( p = 0.0074，F = 6.064) 和 4 型 ( p = 0.0093，F) =1.338)]。这些数据共同揭示了 ATRX 缺失对感觉门控的男性特异性影响。除了听觉感觉门控之外，嗅觉是自闭症谱系障碍患者中另一种受损的感觉过程[ 38 ]。我们发现 ATRX 的缺失显着影响雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠的嗅觉，表明这些小鼠存在额外的感觉处理缺陷（图S3 B）。

Atrx NEXCre小鼠的社交行为缺陷
三腔测试用于评估社会表型。所有实验动物在 10 分钟的适应期内自由探索该室（图S3 B）。在此测试中，对照小鼠和Atrx NEXCre小鼠表现出对陌生小鼠相对于物体的预期偏好（图5 A）。自闭症谱系障碍（ASD）患者普遍存在社交记忆受损的情况。在小鼠模型中，可以在三室测试的第三部分中评估社交记忆，其中涉及社交新颖性测试。正如预期的那样，对照雄性小鼠与新小鼠相处的时间更长，尽管这没有达到显着性标准 (p=0.0536)，而Atrx NEXCre雄性小鼠则没有。这表明AtrxNEXCre雄性小鼠可能存在社交记忆缺陷（图5 B）。对雌性小鼠进行的社会记忆测试是不确定的，因为对照小鼠未能表现出对该范例中新小鼠的偏好（图5 B）。

我们注意到，在三室测试中，当有陌生小鼠在场时，Atrx NEXCre雄性雄性小鼠表现出摇尾巴的表型。尾巴嘎嘎作响通常被认为是小鼠的一种攻击行为，通常与恐惧有关或在攻击性社交遭遇中表现出威胁[ 39 ]。定量显示，与对照组相比， Atrx NEXCre雄性小鼠在陌生小鼠身上表现出明显更多的尾巴嘎嘎声事件（p = 0.0013，F = 10.35），而雌性小鼠则没有表现出这种行为（图5 C）。这些结果确定了Atrx NEXCre小鼠中雄性特有的社交攻击性增加。此外，我们观察到Atrx NEXCre小鼠在处理员在场的情况下会被搅动。我们使用反映处理过程中咬人、躯干卷曲和发声事件的激动评分 (0-5) 来量化这种不寻常的行为（电影 2）。根据这些标准，与对照组相比， Atrx NEXCre雄性和雌性小鼠在处理时都显着更加激动（雄性：p <0.0001，F = 4.160，雌性：p = 0.0003，F = 3.290）（图5 D）。躁动评分没有发现性别差异。我们还发现Atrx NEXCre雄性小鼠对其同窝小鼠具有攻击性，有时会因受伤而导致分离（8/35 笼子）。Atrx NEXCre雌性小鼠没有发现同窝打架的问题。为了确定这种攻击行为的程度，我们进行了一项少年居民入侵者测定。结果表明，Atrx NEXCre雄性小鼠的攻击潜伏期缩短，攻击性显着增加，而Atrx NEXCre雌性小鼠则没有观察到这种行为（雄性：p = 0.0006，F = 2.187）（图5 E）。辨别指数表明他们对入侵者的反应没有显着的性别差异（图5E）。

讨论
本研究的主要目标是确定前脑兴奋性神经元中 ATRX 的胚胎删除是否会导致比先前在这些相同神经元中出生后删除 ATRX 时观察到的更广泛的缺陷。当出生后兴奋性神经元中的 ATRX 被删除时，小鼠表现出长期空间记忆受损，但没有 ASD 样特征 [ 27 , 28 ]。然而，ATR-X 综合征患者表现出更广泛的认知和神经系统问题 [ 15 ]。因此，我们假设需要较早删除Atrx来诱导 ASD 相关性状。事实上，我们确定了成人Atrx NEXCre的两个核心 ASD 特征小鼠：社交缺陷和重复行为。我们还观察到多动症和男性特有的声感觉门控缺陷。根据 DSM-V [ 40 ]，感觉处理受损现在被认为是 ASD 的核心特征。根据已发表的和当前的神经元 ATRX 失活模型，可能存在一段脆弱时期（妊娠中期到青春期早期），其中背侧前脑对 ATRX 功能丧失高度敏感，这会对成年期的行为产生可怕的后果，特别是对于自闭症样特征。先前的报告支持了这一点，显示自闭症谱系障碍风险基因在胎儿发育中后期的皮质中高水平表达，并且在成熟的兴奋性神经元谱系中大量富集[ 41]。此外，研究表明，自闭症谱系障碍患者的大脑发育不典型，皮质中适当的神经元迁移发生变化[ 42 ]，许多在妊娠中期出现并在皮质生成中发挥重要作用的转录因子已被证明与自闭症谱系障碍有关。风险基因 [ 43 , 44 ]。

本研究中描述的Atrx NEXCre小鼠提供了一个很好的模型，可以帮助理解前脑发育早期发生的结构和分子变化，并导致认知能力的改变。针对突触蛋白突变的小鼠模型的研究发现了与Atrx NEXCre小鼠类似的行为改变。例如，Shank3（一种编码突触后蛋白的基因）发生突变的小鼠会表现出过度反应行为、逃避倾向、攻击性和重复行为增加 [ 45 , 46]]。含有自闭症相关突触后神经连接蛋白家族突变的动物模型表现出多动、重复行为和攻击性[ 47,48,49 ]。此前，我们的实验室鉴定了几个与突触功能相关的 ATRX 靶基因，其中包括Neuroligin 4 ( Nlgn4 )，它在突触后间隙发挥作用，是已知的自闭症相关基因 [ 50 , 51 ]。其他相关的 ATRX 调节基因包括 miRNA137，其靶基因涉及适当的突触功能 [ 27 ] 和Xlr3b，一种印记基因，涉及树突中 mRNA 运输的调节 [ 52]]。未来的工作应集中于描述雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠在确定的易感期期间的转录变化，以获得对随后的认知功能障碍的机制理解。

我们观察到两性Atrx NEXCre小鼠的恐惧记忆均存在显着缺陷。这与Atrx CamKIICre小鼠（从 ~P20 开始缺失）形成鲜明对比，其中仅在雄性中观察到恐惧记忆缺陷 [ 27 ]。女性保护理论已被广泛审查，并表明雌激素水平在预防认知障碍方面发挥神经保护作用[ 53 , 54]。之前的一项研究使用计算模型来研究男性和女性 ASD 患者的拷贝数变异 (CNV) 分子网络。他们发现女性中的 CNV 影响更多的基因，并且女性 ASD 患者中被破坏的基因在分子网络中功能更重要。这些数据支持了之前的假设，即女性需要比男性经历更严重的连通性影响才会出现自闭症谱系障碍症状[ 55 ]。Atrx CamKIICre和Atrx NEXCre之间的保护效果差异雌性小鼠表明，在神经可塑性环境中，激素可以赋予神经保护作用；然而，在胚胎删除的情况下，异常的网络连接可能不会那么可塑。对Atrx NEXCre小鼠性别特异性细胞和连接变化的研究可以揭示所观察到的行为的保护机制或可逆性。

在我们的模型中，雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠均表现出多动、重复行为和嗅觉缺陷。我们还发现了其他男性特有的行为变化，包括社交攻击、社交记忆缺陷、声音过敏和 PPI 下降。临床上，男性对许多神经发育障碍的诊断存在偏见，包括智力障碍、自闭症谱系障碍和多动症。其原因，无论是女性保护、男性脆弱性、诊断偏差还是男性和女性之间的社会差异，都存在很大争议[ 56 , 57 ]。在科学文献中，人们越来越担心与男性相比，女性自闭症谱系障碍的识别不足[ 58]。目前，缺乏涵盖雄性和雌性小鼠的综合研究。因此，与男性相比，尚不清楚女性如何受到影响，这阻碍了我们对诊断不足的根本原因的理解。获得自闭症谱系障碍的性别特异性数据可能有助于阐明这一现象。

结论
Atrx NEXCre小鼠模型的行为特征使其成为研究与 ATRX 功能障碍相关的一系列神经异常的可行系统。该模型有可能揭示大脑发育过程中自闭症谱系障碍易感期的相关机制，并揭示自闭症谱系障碍的性别差异和女性保护理论。需要做更多的工作来确定潜在的连接中断、受 ATRX 丢失影响的下游目标，以及雄性和雌性Atrx NEXCre小鼠之间的整体分子和结构差异。最终，该模型提供了一个临床相关平台来识别治疗靶点，并作为测试潜在疗法的临床前模型