介绍
最常见的退行性关节疾病是骨关节炎（OA）。骨关节炎是通过关节软骨破坏引起的，它会影响身体的整个关节，尤其是膝盖和臀部1,2。肥胖、衰老、肌肉无力和损伤等多种危险因素与 OA 疾病的发生有关3。随着年龄的增长，OA的发病率日益上升2。OA疾病的多种危险因素，如代谢过程、炎症以及分子和细胞机制，都在疾病的出现和扩展中发挥着重要作用2,4。OA 疾病涉及灵活性丧失、肿胀、僵硬、压痛和疼痛症状。超过80%的OA患者感到日常工作困难。最近发表的一项荟萃​​分析研究显示，全球15岁人群膝关节骨关节炎的发病率为16%，40岁以上人群的发病率为22.9%，女性与男性的比例为1.625。由于涉及多种危险因素，该病的治疗难度很大。

OA 疾病与类风湿性关节炎 (RA) 疾病不同3。关节的炎症反应以及关节肿胀和疼痛的炎症反应与 OA 疾病有关2,6。RA是一种自身免疫性疾病，在疾病扩展过程中涉及炎症反应7。先前的研究表明，OA患者的滑液中细胞因子和炎症介质的水平升高6,8。

很少有研究表明软骨降解标记物，如 II 型胶原 C 端交联端肽 (CTX-II) 和基质金属蛋白酶（MMP-1 和 MMP-3）在 OA 疾病的进展和传播中发挥作用3,9。此外，软骨退化标志物的改变会引起软骨基质相关酶的功能障碍，从而导致关节软骨退化。10,11。

多种因素参与 OA 疾病的扩展。MMP 在软骨降解中发挥着至关重要的作用。MMP 的作用并不限于由 90% 软骨基质蛋白组成的 II 型胶原蛋白、IV 型胶原蛋白、IX 型胶原蛋白和蛋白聚糖12。根据之前的一项研究，低度关节炎症在 OA 疾病的病程中起着重要作用。核因子 B (NF-κB) 是重要的炎症介质，在 OA 疾病的发病机制中发挥作用12。最近的研究表明，NF-κB通路的激活增加了细胞因子的水平，从而诱导关节破坏，导致OA疾病的发生和扩展13,14。炎症反应、细胞凋亡和MMPs的激活受到氧化应激及其产物的影响。它还由活性氧 (ROS) 触发，活性氧可以破坏和氧化软骨稳态，同时还通过触发细胞死亡来促进分解代谢2,15。由于炎症反应在OA疾病中的作用，研究者选择炎症药物来治疗OA疾病。多种植物提取物及其植物成分显示出治疗OA大鼠模型的药理作用。

目前治疗骨关节炎的药物是非甾体类抗炎药，如对乙酰氨基酚和阿司匹林，但这两种药物均因副作用而存在局限性，只能有效缓解骨关节炎疼痛3。然而，最近推荐关节内注射皮质类固醇用于治疗OA，但它们会引起局部和全身副作用3。此外，荟萃分析表明，各种OA补充剂如软骨素、鳄梨和葡萄糖胺可用于OA治疗，但其机制尚无定论16。

由于骨关节炎疾病缺乏有效的治疗方法，终末期骨关节炎患者可选择关节置换术或关节置换术5，但关节置换术是一项昂贵的手术，并且有可能发生感染、假体周围骨折和假体松动17 号。由于手术费用昂贵，迫切需要更多成本更低、无副作用的保护性药物来对抗OA疾病。

青藤碱是从原产于日本和中国的青藤碱植物中分离出来的生物碱化合物18,19。它在动物模型中表现出针对各种免疫相关疾病的抗炎潜力20。李等人。表现出青藤碱对雌性大鼠妊娠期糖尿病的抗氧化和抗炎作用21。青藤碱对完全弗氏佐剂（CFA）诱导的大鼠慢性炎性疼痛也表现出抗炎作用22。在这项实验研究中，我们研究了青藤碱对碘乙酸钠 (MIA) 诱导的大鼠 OA 的抗骨关节炎作用，因为它具有抗炎和抗氧化特性。

方法
动物
从动物舍中取出瑞士 Wistar 大鼠（性别雄性；体重 250-280 克；10-12 周龄）并置于聚乙烯笼中（每只大鼠）。将大鼠在部门动物房饲养，在实验室条件下饲养1周，以适应环境。整个动物实验是按照该机构的动物方案进行的。整个动物研究得到了机构伦理委员会的批准（批准号：20210004531）。

骨关节炎诱导
为了诱导大鼠骨关节炎，用异氟烷使动物镇静，并通过关节内注射MIA造成关节软骨损伤。MIA (3 mg/50 μL) 通过右膝髌下韧带在盐水中产生。给予大鼠时间从麻醉中恢复并进行监测，直到它们恢复正常活动1。

实验组
将大鼠分为五组。

I组：正常；

第二组：MIA控制；

第三组：MIA+青藤碱（2.5mg/kg）；

IV组：MIA+青藤碱（5mg/kg）；

V组：MIA+青藤碱(7.5mg/kg)。

四个星期以来，老鼠接受了已经描述过的治疗。测试组接受了溶解在羧甲基纤维素（CMC）中的新鲜制备的悬浮液，并通过口服强饲法给动物施用，青藤碱的剂量是根据先前发表的研究选择的23。四个星期后，老鼠被安乐死。安乐死前，将大鼠禁食过夜（12 h），并通过心脏穿刺采集各组大鼠的血样。将血样以 5,000 rpm 离心 5 分钟以分离血清。血清样品保存在-20°C。研究结束时，对大鼠实施安乐死，取出心脏、脾脏和肾脏等不同器官并称重。

一氧化氮产生
使用先前描述的方法估计一氧化氮水平。格里斯反应用于测定一氧化氮。简而言之，将血清样本（100μL）与格里斯试剂A（50μL）和等量的格里斯试剂B混合，并在室温（37℃）下孵育15分钟。最后，估计了 540 nm 处的光密度。

抗氧化参数
使用 5,5-二硫双（2-硝基苯甲酸）模型估算谷胱甘肽 (GSH)，得到黄色产物24。使用市售试剂盒（生物诊断试剂盒，埃及）估计最终吸光度为 405 nm。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（MyBioSource Ltd.，圣地亚哥，美国）估计丙二醛（MDA）（MBS7727872）的水平。超氧化物歧化酶 (SOD) (MBS8819950) 水平使用 ELISA 试剂盒（MyBioSource Ltd.，圣地亚哥，美国）按照制造商的方案进行估计。

酶联免疫吸附测定
软骨降解标志物例如MMP-1 (MBS7720142)、2 (MBS7727654)、3 (MBS7720097)、9 (MBS8124027)、13 (MBS7726087)；炎症参数 PGE 2 (MBS7727909)、环氧合酶-2 (MBS7721379)、诱导型一氧化氮合酶 (MBS9460915)、CTX-II (MBS2533577)、干扰素 γ (IFN-γ) (MBS697344)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) ) (MBS7720303)、糖胺聚糖 (GAG) (MBS730728)、聚集蛋白聚糖 (MBS262707) 以及肿瘤坏死因子 (TNF)-α (MBS508481)、白细胞介素 (IL)-1β (MBS697369) 和 IL-6 (MBS8123859) 等细胞因子根据制造商的方案（MyBioSource Ltd.，圣地亚哥，美国）进行估计。

统计分析
GraphPad Prism 7软件（GraphPad Prism，圣路易斯，美国）用于统计分析。本研究中的数据以所有变量的平均标准误差 (SEM) 形式给出。使用单向和双向方差分析进行多重比较。选择 P 作为有效数。

结果
身体和器官重量
在骨关节炎期间，疾病抑制了体重。OA疾病组大鼠由于疾病扩大而表现出体重减轻，而青藤碱治疗组大鼠表现出体重改善。青藤碱（7.5 mg/kg）治疗的大鼠体重显着增加。达到了几乎接近正常组大鼠的体重（图1a）。

图1
SM对MIA致OA组大鼠体质量及器官重量的影响。(a)体重，(b)心脏重量，(c)脾脏重量和(d)肾脏重量。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
OA对照组大鼠心脏重量增加，青藤碱治疗显着抑制了这种增加（P < 0.001）。青藤碱（7.5 mg/kg）治疗组大鼠的心脏重量几乎接近正常组大鼠（图1b）。我们还估计了所有组大鼠的脾脏和肾脏重量。脾脏的重量（图 1c ) 和肾脏 (图1d )各组大鼠中没有统计学差异。

一氧化氮
在各组之间的比较中，OA组大鼠的一氧化氮水平升高，而青藤碱治疗则降低了一氧化氮水平。青藤碱治疗组大鼠显着（P < 0.001）抑制一氧化氮水平，并且在青藤碱（7.5 mg/kg）治疗组大鼠中观察到最大程度的降低（图2）。

图2
SM对MIA致OA组大鼠一氧化氮的影响。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
聚集蛋白聚糖和糖胺聚糖
各组大鼠中聚集蛋白聚糖和 GAG 的水平显示在图3 . OA 诱导组大鼠的聚集蛋白聚糖水平较低（图3a）和GAG（图3b )，而青藤碱治疗的大鼠的水平相当高。青藤碱 (7.5 mg/kg) 增加聚集蛋白聚糖和 GAG 的水平。

图3
SN对MIA诱导的OA组大鼠聚集蛋白聚糖和GAG的影响。(a)聚集蛋白聚糖和(b) GAG。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
IFN-γ 和 MCP-1
OA组大鼠的IFN-γ水平受到抑制（图4a）和MCP-1的增强水平（图4b )与正常组大鼠相比。青藤碱治疗组大鼠IFN-γ水平显着提高（P<0.001），MCP-1水平降低。

图4
SM对MIA诱导的OA组大鼠INF-γ和MCP-1的影响。(a) INF-γ和(b) MCP-1。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组n=10）的形式呈现。
抗氧化参数
氧化应激会加速多种疾病，如骨质疏松症、关节炎、癌症等。OA对照组大鼠表现出相似的结果，GSH、SOD水平较低，MDA水平较高。青藤碱处理显着（P<0.001）提高GSH水平（如图。5a )、超氧化物歧化酶(如图。5b）并下调MDA水平（如图。5c）。

图5
SM对MIA诱导的OA组大鼠抗氧化参数的影响。(a) GSH、(b) SOD 和(c) MDA。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
炎症细胞因子
炎症反应在 OA 疾病的进展中很重要。在这项研究中，OA 组大鼠的 TNF-α 水平升高（图6a )，IL-1β(如图。6b )、IL-6(图6c )并抑制IL-10的水平(图6d）。青藤碱治疗组大鼠显着（P < 0.001）改变炎症细胞因子的水平。

图6
SM对MIA诱导的OA组大鼠炎症细胞因子的影响。(a) TNF-α、(b) IL-1β、(c) IL-6 和(d) IL-10。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
炎症参数
OA 诱导组大鼠的 CTX-II 水平升高（如图。7a ), PGE 2 (图7b），COX-2（图 7c ) 和 iNOS (图7d）。青藤碱治疗组大鼠显着（P < 0.001）抑制炎症参数水平。青藤碱（7.5 mg/kg）治疗组大鼠显示出最大程度的炎症参数抑制并接近正常对照。

图7
SM对MIA致OA组大鼠炎症参数的影响。(a) CTX-II，(b) PGE 2，(c) COX-2和(d) iNOS。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
基质金属蛋白酶
MMP 在 OA 疾病的传播和进展中很重要。OA诱导组大鼠的MMP-1水平升高（图8a），MMP-2（图8b），MMP-3（图8c )、MMP-9(图8d）和MMP-13（图8e )。青藤碱治疗显着抑制了 MMP 的水平。青藤碱(7.5 mg/kg)治疗组大鼠的MMPs水平显示出最大程度的抑制。

图8
青藤碱对MIA致OA组大鼠MMPs参数的影响。(a) MMP-1、(b) MMP-2、(c) MMP-3、(d) MMP-9和(e) MMP-13。所有结果均以来自三个独立实验的平均值±SD（每组 n = 10）表示。
讨论
OA 疾病根据关节软骨损失的进展和关节边界骨赘的生长进行分类25。OA疾病的治疗方法有手术治疗、药物治疗和非药物治疗，其中更注重减轻疼痛、增强整体功能等症状治疗26。然而，由于限制，研究人员的研究重点是仔细审查来自天然来源的更具保护性的药物。

在 OA 疾病期间通常会观察到体重减轻。由于骨骼结构损失或变形而导致体重减轻2,6。OA 对照组的大鼠也有类似的结果。脾脏和肾脏重量没有观察到差异，但 OA 对照组大鼠的心脏重量增加，这是由于细胞水平上 IL-6、TNF、MMP-1 等蛋白质合成的增加以及青藤碱治疗有效抑制了细胞因子和细胞因子的水平。 MMP，表明抑制蛋白质合成并减轻心脏重量。

MIA注射后，通过滑膜浸润和炎症反应引起关节肿胀27。OA疾病时可出现滑膜增生伴纤维化、关节软骨表面吸收、周围软骨水肿伴炎症细胞浸润、血管充血等。这项实验研究也发现了类似的效果，表明 OA 疾病正在进展和蔓延。自然、化学或手术的 OA 啮齿动物模型被广泛接受，用于检查软骨退变病理学和疾病的潜在治疗改变3,28。

先前的报告表明，随着年龄的增长，化学诱发的 OA 疾病也同样发生在人类身上。而且，OA疾病是一种长期慢性疾病，受试药物对啮齿类动物的保护作用需要较长时间的检验。与正常组大鼠相比，MIA诱导的OA组大鼠由于关节体积增加而表现出明显的膝关节肿胀。关节肿胀达到最大 7 天，并在实验研究结束时持续存在。在本实验研究中，我们选择了啮齿动物模型（MIA诱发的OA疾病）来考察受试药物的保护作用。

在本实验研究中，我们使用注射MIA来诱导OA。MIA的施用由于抑制糖酵解而扰乱软骨细胞的代谢并诱导软骨退化27。塌陷关节的组织学与人类关节的组织学非常相似，这是该模型的主要优点29。最后，MIA暴露于软骨下骨，损伤滑膜，诱发关节疼痛27。由于与人类类似，啮齿类动物也会产生 OA，因此该模型日益流行，用于检查测试药物的治疗和预防效果。

众所周知，ROS会引起DNA损伤。这种损伤可能归因于炎症细胞因子的产生增强27。在降解软骨损伤过程中，ROS 水平升高，这一点通过循环和软骨区域脂质过氧化的评估得到证实30,31。由于亚硝化和氧化应激在 OA 疾病发病机制中的关键作用，导致 OA 疾病期间 GSH 水平受到抑制32。

众所周知，基质周转取决于软骨细胞，软骨细胞开始在啮齿动物以及人类中产生炎症细胞因子33。多种细胞因子如 IL-1、IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-17 和 MMP 水平升高在软骨降解中发挥重要作用34。OA诱导组大鼠细胞因子水平发生变化，这是由青藤碱调节的。

众所周知，软骨的退化在 OA 疾病期间开始，并且被认为是该疾病的生物标志物25。由于 MMP 等软骨基质产物的诱导，软骨在 OA 疾病期间开始恶化，从而导致胶原蛋白网络功能障碍35,36。MMP 是蛋白酶家族成员，可以降解所有细胞外基质成分34。明胶酶（IV 型胶原酶）是 MMP 家族的成员，分为不同的亚类，例如 MMP-2（明胶酶 A）和 MMP-9（明胶酶 B），负责降解 IV 型胶原、V 型胶原、明胶和明胶。弹性蛋白37。已知MMP-2是通过成骨细胞和组织结构细胞（例如内皮细胞和成纤维细胞）产生的。MMP-9 通过炎症细胞产生，包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞38,39。MMP（MMP-2 和 MMP-9）是潜在的前体，可以通过限制性蛋白水解来触发。

OA发病过程中MMP-9水平升高，反映关节炎症反应，髋关节快速破坏与MMP呈正相关34。OA疾病的另一个生物标志物是CTX-II，广泛用于估计软骨退化的状态3。PGE 2是一种常用于识别蛋白聚糖合成抑制并促进软骨基质降解的酶40,41。OA组大鼠MMP-1、MMP-3、PGE 2和CTX-II水平显着升高，表明软骨网络功能障碍，而青藤碱治疗显着降低其水平，表明软骨受到保护。

结论
我们的数据表明，青藤碱显着改善了体重并减轻了心脏组织的重量。青藤碱显着改变抗氧化酶的水平，抑制NO、MCP-1的水平，并提高聚集蛋白聚糖、GAGs、IFN-γ的水平。青藤碱显着调节炎症细胞因子、炎症介质和基质金属蛋白酶的水平。因此，青藤碱可以作为一种保护性抗骨关节炎药物。必须进行更多的分子研究来确定治疗骨关节炎的确切机制。