介绍
脊髓刺激 (SCS) 被用作治疗多种慢性神经性疼痛疾病的安全有效的选择（Kumar 等人，2007 年；Kemler 等人，2008 年；Slangen 等人，2014 年）。SCS 已被证明通过许多生理过程发挥作用，包括调节神经炎症反应（例如神经胶质激活（Vallejo 等人，2016 年；Sato 等人，2014 年；Shu 等人，2020 年）和神经递质的调节（例如，细胞内伽马射线的释放） -氨基丁酸（GABA）或促进涉及血清素能机制的下行抑制（Janssen等人，2012年；Song等人，2009年；Cui等人，1997年）; 斯密茨等人。2012年；崔等人。1996年；巴尔基尼等人。2012）。虽然不同的刺激范式已应用于临床实践（例如常规、高频、突发），但这些范式如何影响脊髓和脊髓上回路仍有待充分阐明（Smits 等人，2012 年；Joosten 和Franken，2020 年） ；詹森和布朗斯通2019）。然而，人们一致认为，基于感觉异常的 SCS 通过激活背柱中大的有髓鞘纤维来调节疼痛处理，这一点已通过传导速度 (CV) 测量得到证实（Dietz 等人，2022 年；Parker 等人， 2012 年；Mekhail）等人。2020）。诱发复合动作电位 (ECAP) 已成功用作量化 SCS 在背柱纤维神经激活方面的影响的客观测量，因为它们代表了激活纤维产生的动作电位的总和（Parker 等人，2012 ））。ECAP 具有三相形态，其振幅可以根据第一个负 (N1) 和第二个正 (P2) 峰之间的差异计算（Parker 等人，2020 年；Parker 等人，2013 年；Parker 等人，2020 年））。一旦达到 ECAP 阈值 (ECAPT)，ECAP 幅度就会随着刺激电流线性增加，并与患者感觉异常的感觉强度增加相关 (Gmel 等人，2021 )。人类刺激引起的感觉的知觉阈值已被证明与 ECAPT 一致（Gmel 等人，2021 年；Pilitsis 等人，2021 年），并且治疗 ECAP 目标被设置为患者知觉阈值和振幅之间的值。感觉变得不舒服（Parker et al. 2020）。ECAP 记录的一个主要且独特的优势是，它们可以合并到闭环 SCS 系统（ECAP 控制的 CL-SCS）中，该系统允许实时调整 SCS 剂量，以纠正在姿势改变和生理变化（Parker et al. 2020）。因此，与开环 (OL)-SCS 相比，ECAP 控制的 CL-SCS 可以有效地控制由所传递的电流确定的 SCS 剂量，从而产生一致的背柱激活水平 (Parker et al. 2020 )，并且，重要的是，在人体研究中已被证明优于 OL 刺激（Brooker 等人，2021 年；Mekail 等人，2022 年）。

啮齿动物行为研究中使用的 SCS 参数基于刺激引起的运动反射（运动阈值，MT）（Smits 等人，2013）和/或通过观察动物行为的细微变化，这些变化可能表明刺激感觉的开始（Koyama 等人）等2018）。与 MT 不同，ECAPT 已被证明与临床环境中的感知阈值密切相关（Gmel 等人，2021 年；Pilitsis 等人，2021 年）。因此，ECAP 记录提供了一种客观的测量方法来评估刺激引起的感觉的发生，可用于临床前 SCS 模型。我们最近证明了在幼稚（非神经病性）麻醉且自由行为的大鼠中记录背柱 ECAP 的可行性（Dietz 等，2017）。2022），其他人在幼稚麻醉动物中也取得了同样的成果（Parker et al. 2013；Parker et al. 2020；Cedeño et al. 2023）。然而，此类记录尚未用于评估目前在人类患者中用于神经性疼痛动物模型的基于 ECAP 的疗法。

为了解决这一差距，本研究的目的是双重的。首先，在接受神经病理性疼痛（神经损伤，SNI）实验模型的大鼠中表征背柱纤维对 SCS 的反应，并与未受伤的对照组进行比较。其次，在这些动物中评估了 ECAP 控制的 CL-SCS 在降低机械和冷过敏方面的功效。这项研究首次在体内证明了在 ECAP 控制的 CL-SCS 中使用基于 ECAP 的 SCS 剂量在神经性疼痛的临床前模型中产生了镇痛作用。

方法
动物
成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠（n  = 45；8-10 周龄；200-300 g；Charles River Laboratories 和 Envigo）在到达后至少 7 天适应群体室，并以 2 只为一组饲养每个聚乙烯笼子 3 只动物（英国纽卡斯尔大学比较生物学中心）。植入 SCS 引线（如下所述）后，将大鼠饲养在单独的笼子中。动物在受控温度 (21 °C) 和湿度 (55%) 下维持 12 小时昼夜循环（上午 8:00 开灯；晚上 8:00 关灯），并可随意获取食物和水。在整个研究过程中对他们进行监测，以确保动物福利。所有实验均在英国内政部许可 (P6694C943) 下进行，并获得动物福利伦理审查机构 (AWERB) 的当地批准，并符合 1986 年《动物（科学程序）法》中定义的英国现行立法。此外，报告本研究遵循动物研究：体内实验报告 (ARRIVE) 指南。我们尽一切努力尽量减少动物的痛苦并减少研究中使用的动物数量。

实验设计
实验结果最终分析中包含的不同条件下的动物数量如图 1 A所示。


所有假手术对照（n  = 24）均未受到神经损伤。六只动物没有接受铅植入（假手术；图 1A）。其余 18 只动物继续进行导线植入；然而，由于与数据记录的信噪比相关的技术问题，8只大鼠被排除在随后的实验步骤和分析之外。在这 10 只动物中，有 6 只动物被分配到假 SCS-OFF 组并且不接受 CL-SCS（图 1 A）。其余四只动物接受 CL-SCS（假 SCS-ON；图 1 A）。此外，假 SCS-OFF 组的两只动物在未接受刺激一天后接受 CL-SCS，因此假 SCS-ON 组总共由 6 只动物组成（图 1）。 1A）。

所有 SNI 动物均遭受神经损伤（n  = 21）。六只动物未接受植入或 CL-SCS（SNI；图 1 A）。其余 15 只动物植入 SCS 引线，并接受无刺激（SNI SCS-OFF；图 1 A）或 CL-SCS（SNI SCS-ON；图 1 A）。SNI SCS-ON 组的 8 只动物中有两只被排除在分析之外，因为它们对刺激的运动反应是在对侧而不是受伤侧观察到的。

实验步骤如图1B所示。 实验前对动物进行处理并使其习惯测试程序。疼痛诱导后 8-15 天植入导线，并在植入导线约两天后施用 CL-SCS。在每次手术之前和之后评估所有动物对机械和冷刺激的反应以及对 CL-SCS（假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON）的反应。在同一时间范围内评估未植入引线（假手术和 SNI）或未接受 CL-SCS（假手术 SCS-OFF 和 SNI SCS-OFF）的动物。动物被随机分配到实验组，直至并包括导线植入阶段（图 1 ）B）。实验设置排除了将动物随机分为 SCS-OFF 组和 SCS-ON 组的可能性。出于实际原因，SCS-OFF 和 SCS-ON 组的分配是基于输入输出 (IO) 函数收集期间获得的各个记录的信噪比。实验设置防止行为测试人员对 SCS（SCS-ON 和 SCS-OFF 组）的应用视而不见。为了减轻这种限制，第二位行为观察者证实了动物反应的结果。还应该指出的是，本研究并不是为了研究 CL-SCS 对大鼠的最佳刺激强度，也不是为了研究 CL-SCS 与 OL-SCS 相比的功效，正如之前的临床研究那样 (Mekhail et al. 2020 ; Mekhail等2022）。所有疼痛过敏评估和记录都是在自由行为的动物中进行的。

使用定制的硬膜外导线进行刺激和记录，该导线具有 6 个通道 (0.3 × 1.0 mm)，每 4 mm 等间距，并连接到连接到专门设计的多通道系统 MKII（MCS；Saluda Medical）的各个记录通道（Dietz 等人）等人，2022 年；帕克等人，2013 年）。刺激时，使用一个通道进行刺激，其余五个通道进行录音。数据采集​​是使用定制软件进行的，该软件控制由 United Electronic Industries 设计的数据采集 (DAQ) 单元，采样率为 30 kHz 和 24 位模数转换器。这种设置允许在刺激过程中连续监测和实时显示 ECAP。

疼痛诱导和过敏评估
疼痛感应
使用 SNI 模型（Decosterd 和 Woolf 2000 ）诱导神经性疼痛。动物通过鼻锥进行全身麻醉，5% 异氟烷和氧气（流速为 2 L/min）作为载气进行诱导，1.5-2.5% 进行维持。该手术涉及用 5.0 丝线横断坐骨神经 3 个远端分支中的 2 个、腓总神经和胫神经，同时保持腓肠神经完好无损。除了腓总神经和胫神经的结扎和横断之外，假手术过程是相同的。

疼痛过敏评估
使用一系列 von Frey 细丝（弯曲力 0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 和 26.0 g）测定机械超敏性。将逐渐增加力的冯弗雷细丝施加到后爪的外侧部分、腓肠区域、损伤侧的同侧，从最低力的细丝（0.07g）开始，施加五次。引起观察到的退缩反应率为 60% (3/5) 的 von Frey 细丝的力被指定为机械缩爪阈值。26.0 g 弯曲力被定义为截止值。为了符合韦伯定律并获得线性尺度，阈值乘以 10,000 并进行对数转换（Mills 等人，2012）。

为了评估冷过敏症，使用丙酮试验（Choi et al. 1994）。通过对 50 µl 丙酮滴的反应的缩爪潜伏期来测试冷过敏。用连接到注射器的钝针将丙酮滴施加到同侧爪子的外侧足底表面，避免对爪子的机械刺激。戒断潜伏期定义为从使用丙酮到观察到的戒断反射结束的时间（以秒为单位）。

在进行超敏反应评估之前，将动物放置在高架网状地板上的透明盒子中，并允许其适应实验装置 30 分钟。在 SNI 诱导前 (BS1) 以及 SNI 后 8-15 天（导线植入前）进行超敏反应评估，以确认机械和冷超敏反应 (BS2) 的发生。然后，在导线植入后大约两天，在 CL-SCS 开始前（0 分钟）、CL-SCS 期间进行两次（15 和 30 分钟）以及 CL-SCS 终止后两次（45 和 60 分钟）进行超敏反应评估。确定 CL-SCS 对机械过敏和冷过敏的影响。首先对动物进行机械过敏性评估，然后进行冷过敏性评估。

电生理学
铅植入
动物被植入定制的硬膜外导线（图 1A）。导线植入是在通过鼻锥进行全身麻醉的情况下进行的（5% 异氟烷和氧气（流速为 2 L/min）作为用于诱导的载气；1.5–2.5% 用于维持）。在 T11 或 T12 水平进行小型椎板切除术，随后将 SCS 导线尾部插入硬膜外腔，使活动通道延伸到脊柱水平 T11-L3，对应于下胸椎 (T) 和上腰椎 ( L) 椎骨。手术过程中硬脑膜保持完整。使用组织胶将导线固定到椎板切除平面尾部的椎骨上。第二根导线放置在皮下并用作参考电极和接地电极（除了一只动物，其中参考电极和接地电极与刺激和记录通道位于同一导线）。伤口被分层缝合，导线的近端穿过皮下隧道以离开颈部底部的皮肤。两条引线的微触点均连接至电缆，从而能够连接至 MCS（Dietz 等人，2017）。2022）。通过计算机断层扫描 (CT) 扫描（SkyScan 1176，Bruker）或 X 射线（Orange 1040HF，EcoRay）确认引线位置。植入铅后，将动物单独饲养在单独的笼子中。动物在手术期间接受布比卡因和利多卡因的混合物（隧道区域和切口，利多卡因高达 10 mg/kg，布比卡因高达 4 mg/kg）以及恩诺沙星（皮下注射 10 mg/kg）。然后，他们在术后接受恩诺沙星（10 mg/kg 皮下注射），持续四天，每天一次。在 CL-SCS 期间进行超敏反应评估之前，允许动物恢复 1.80 ± 0.17 天。

IO功能
在 CL-SCS 递送之前，立即从接受刺激的所有动物中收集 IO 功能（假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON；图 1 A）。在数据收集过程中，记录了响应传递电流 (mA) 的 ECAP 幅度 (mV)。ECAP 幅度定义为 N1 和 P2 峰值之间的绝对差。该通道覆盖 T13，与吻侧水平相比，刺激似乎可以更有效地缓解疼痛（Smits 等人，2012 年）），用于刺激。刺激电流从 0.0 mA 开始逐步增加，直到在记录屏幕上、在逆向方向最接近刺激通道的通道处观察到 ECAP。随后，增加电流强度直至在动物的中下部躯干或同侧后腿中观察到运动反应。使用 2 组不同的刺激频率和脉冲宽度刺激参数（PW；2 Hz 200 μs 和 50 Hz 200 μs），从所有动物的逆向方向获得将 ECAP 幅度与刺激电流相关的 IO 函数。刺激频率和 PW 的值基于之前的临床前研究，其中使用 2 Hz 200 μs 来确定 MT（例如，10,31–34），而50 Hz 200 μs用于提供基于感觉异常的刺激（例如，6,8–10,31–34）。这些参数设置使我们能够将 ECAP 控制的 CL-SCS 结果与之前的工作进行比较。

ECAPT 和 MT
使用两种方法来定义 ECAPT。首先，在数据离线分析过程中，通过将 IO 函数线性外推至 0 幅度来定义外推 ECAPT（Biesheuvel 等人，2018）。x 轴截距定义为 ECAPT。其次，目视观察到的 ECAPT 定义为去极化阈值足以在逆向方向上最接近刺激通道的通道处产生可检测到的 ECAP 的电流，在 50 Hz 的 IO 功能采集过程中在记录屏幕上观察到200 μs（Dietz 等人，2022）。根据临床实践，目视观察的 ECAPT 用于设置 CL-SCS 的刺激强度（如下所述），而外推的 ECAPT 用于分析。为了最大限度地减少偏差，目视观察的 ECAPT 由两名观察者确定，第一个离线可检测的 ECAP 由同一观察者针对所有 IO 功能确定。MT 被定义为导致可观察到的运动反应的电流，并在整个实验过程中由同一观察者确定。通过测量和比较这些阈值的相对大小，建立了 ECAPT (mA) 和 MT (mA) 之间的关系。此外，还对不同刺激参数下的假手术动物和 SNI 动物进行了比较。

简历
CV（米每秒 (m/s)）是 ECAP 信号沿神经通路传播的速度。通过刺激 T13 处的通道并测量最靠近刺激通道的三个通道来测量沿导线的 ECAP 传播，从而在逆向方向上计算 CV。施加的电流为 MT 的 66-90%，对应于之前实验中使用的刺激强度 (Smits et al. 2013 )。CV 基于 IO 功能收集期间的记录。

CL-SCS
记录的 ECAP 用于根据单独确定的 IO 功能设置刺激强度，并纳入 CL 程序，该程序自动逐脉冲调整电流传输，即在 50 Hz 编程时每秒自动调整 50 次，以保持恒定水平背柱激活（Parker et al. 2020）。使用 50 Hz 200 µs 在逆向方向最接近刺激通道的通道处记录的目视观察的 ECAPT（如上所述）用于确定刺激强度，刺激强度设置为高于 ECAPT 的电流，该电流产生足够大的 ECAP 以保持恒定背柱激活水平（CL）。CL-SCS 以 50 Hz 的频率和 200 µs 的 PW 传输 30 分钟。覆盖 T13 的通道用于刺激，其余逆向通道用于记录从刺激通道尾部传播的 ECAP。

数据分析与统计
使用 MATLAB 定制工具箱（2013 版；Mathworks, Inc.）和用 MATLAB（2022 版；Mathworks, Inc.）编写的自定义脚本进行 ECAP 的预处理和表征。

使用适用于 Windows 的 GraphPad Prism 版本 9.5.1 进行统计分析。所有数据均以平均值±平均值标准误差 (SEM) 的形式呈现。样本量基于之前发表的研究和测试的验证性质（Curtis 等人，2018）。此外，假设行为和电生理学实验结果来自正态分布的人群（Gosselin 2019）。配对t-使用测试来比较 ECAPT 与 MT。使用综合方差分析 (ANOVA) 研究假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON 动物之间 IO 功能斜率、ECAPT、MT、MT:ECAPT 比率和 CV 以及刺激参数的潜在差异。此外，还进行了综合方差分析 (ANOVA)，以评估机械和冷超敏反应的发展以及 CL-SCS 的效果。显着的交互作用之后进行事后t检验，并使用 Bonferroni 校正进行多重比较。统计显着性定义为p  < 0.05（已校正）。

结果
疼痛过敏的确认
通过比较治疗组之间随时间推移的缩爪阈值（冯弗雷试验）和缩爪潜伏期（丙酮试验），证实了所有 SNI 动物中神经性疼痛的发展，通过测量机械和冷过敏来评估。双向方差分析研究时间（BS1；BS2；0；15；30；45 和 60 分钟）和治疗组（假手术；假手术 SCS-OFF；假手术 SCS-ON；SNI；SNI SCS-OFF 和 SNI）的影响SCS-ON）对机械过敏的影响显示两个因素之间存在显着的相互作用（F (30, 186)  = 31.418, p  < 0.001）。同样，研究时间和治疗组对冷过敏的影响的双向方差分析显示出显着的双向交互作用 ( F (30, 186)  = 4.805，p  < 0.001）。Bonferroni校正的事后t检验显示，与假手术对照相比，SNI 动物在 SNI 手术之后 (BS2) 而不是之前 (BS1)，对机械刺激的反应显着增加（假手术与 SNI：5.01） ± 0.06 对比 3.13 ± 0.08，t (9.147)  = 17.956，p  < 0.001；假 SCS-OFF 对比 SNI SCS-OFF：5.11 ± 0.09 对比 3.48 ± 0.14，t (9.768)  = 10.004，p  < 0.001；假 SCS-ON 与 SNI SCS-ON：5.23 ± 0.09 与 3.76 ± 0.21，t (6.725)  = 6.599，p = 0.005）。此外，与假手术对照组相比，SNI 动物在 SNI 手术后 (BS2) 而不是手术前 (BS1) 对冷刺激的反应显着增加（假手术与 SNI：0.18 ± 0.08 与 26.07 ± 2.07，t (5.016)  = 12.500，p  < 0.001；假 SCS-OFF 与 SNI SCS-OFF：0.01 ± 0.01 与 19.66 ± 0.87，t (6.003)  = 22.458，p  < 0.001；假 SCS-ON 与 SNI SCS-开：0.00 ± 0.00 与 19.82 ± 2.17，t (5.000)  = 9.138，p  = 0.004）。这些发现证实了所有 SNI 动物（而非假手术对照组）都出现了机械过敏和冷过敏。

确认脊髓中的导联位置
CT 或 X 射线图像证实了所有动物中导线的硬膜外植入以及每个通道的位置（图 2）。将导线尾部插入脊椎动物 T11 或 T12 水平的背侧硬膜外腔，覆盖 T11-L3 椎骨。

ECAP 录音的表征
记录所有接受刺激的动物的 ECAP（假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON；图 1 A）。图3示出了从在2Hz 200μs和50Hz 200μs刺激的自由行为的假SCS-ON和SNI SCS-ON动物中记录的ECAP的示例 。正如预期的那样，所有动物记录的 ECAP 均显示出特征性三相形态，并且随着施加较高电流 (mA)，振幅（P2-N1，mV）增加（Dietz 等人，2022 年；Parker 等人， 2020 年；Parker 等人，2020 年）。 2013年）。N1 峰值代表引发的 ECAP 从刺激通道 (Ch5) 行进 4 mm 到记录通道 (Ch4) 所需的时间，在 1.373–1.433 ms (2 Hz 200 µs) 和 1.373–1.453 ms (2 Hz 200 µs) 之间诱发。 50 Hz 200 µs）在假 SCS-ON 动物中。同样，在 SNI SCS-ON 动物中，N1 峰在 1.293–1.387 ms (2 Hz 200 µs) 和 1.360–1.387 ms (50 Hz 200 µs) 之间诱发。ECAP 信号与从刺激通道记录的任何信号明显区分开来。

收集 IO 功能以确定每只动物的刺激强度和背柱激活之间的关系。IO 函数表示来自最接近刺激通道 (T13) 的逆向方向的离线分析记录（图 4 ））。在两个假 SCS-ON 对照中，在整个实验过程中刺激是在 L1 而不是 T13 处传递的；然而，这对实验结果没有影响。原始数据点（从第一个离线可观测 ECAP 到 MT）均使用 Matlab（2022 版；Mathworks, Inc）中实现的无假设样条曲线（平滑参数 = 0.95）进行插值。根据先前在 Matlab 中获得的内插数据点进行线性回归，并通过 IO 函数线性外推至 0 幅度来确定外推 ECAPT。随后，插值函数的当前范围在 0.0（外推 ECAPT）和 1.0（MT）之间缩放。2 ; 假：0.88 ± 0.09 和 SNI：0.88 ± 0.06）和 50 Hz 200 µs（R 2；假：0.98 ± 0.01 和 SNI：0.92 ± 0.03）。假 SCS-ON 动物的平均斜率使用 2 Hz 200 µs 时为 20.53 ± 3.13 mV/mA​​，使用 50 Hz 200 µs 时为 21.03 ± 2.45 mV/mA​​。在 SNI SCS-ON 动物中，使用 2 Hz 200 µs 时的平均斜率为 23.56 ± 6.37 mV/mA​​，使用 50 Hz 200 µs 时的平均斜率为 22.71 ± 7.60 mV/mA​​。在假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON 动物之间（ F (1, 20)  = 0.195，p  = 0.663）以及刺激参数之间（F (1, 20)  = 0.001，p = 0.975） ，均未发现斜率存在显 着差异。 。

不同条件下 ECAPT、MT 和 CV 的比较
双向方差分析表明，与假 SCS-ON 对照相比，SNI SCS-ON 动物中产生 ECAPT 所需的平均电流显着较小（F (1, 20)  = 6.410，p  = 0.020），但它并没有2 Hz 200 μs 和 50 Hz 200 μs 之间存在差异（F (1, 20)  = 0.001，p  = 0.976）。此外，双向方差分析表明，假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON 动物之间（F (1, 20)  = 3.847，p  = 0.064）以及刺激参数之间（F (1, 20)  = 0.002，p  = 0.964)。

MT:ECAPT 比率用于测量生成 MT 所需的相对电流与生成 ECAPT 所需的电流相比。配对t检验表明，当使用 2 Hz 200 μs 刺激时，在假 SCS-ON (2.20 ± 0.15 倍，t (5)  = 8.973，p  < 0.001；图 5 A) 和 SNI SCS-ON（3.08 ± 1.19 倍，t (5)  = 2.690，p  = 0.043；图 5 B）动物。同样，当使用 50 Hz 200 μs 时，引发 MT 的电流明显高于假 SCS-ON 中产生 ECAPT 所需的电流（2.32 ± 0.23 倍，t (5)  = 11.884，p  < 0.001；图 5 C) 和 SNI SCS-ON (2.63 ± 0.34 倍，t (5)  = 8.975，p  < 0.001；图 5 D) 动物。此外，分析 MT:ECAPT 比率的双向方差分析显示，假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON 动物之间（F (1, 20)  = 0.895，p  = 0.356）以及不同刺激参数之间没有显着差异（F (1, 20)  = 0.066，p  = 0.800）。

图6 A显示了从通道 4-1（距刺激通道 4-16 毫米；L1-L3）在空间和时间上传播 ECAP 的示例。在 此示例中，刺激应用于通道 5（ T13)，电流为 0.034 mA，相当于 MT (0.049 mA) 的 69% 和 ECAPT (0.024 mA) 的 1.4 倍。所有动物中 ECAP 幅度随着距刺激通道距离的增加而减小（示例如图 6A所示；4 毫米：0.63 mV，8 毫米：0.20 mV，12 毫米：0.09 mV，16 毫米：0.08 mV）。66-90% MT 水平下逆向方向的平均 CV 如图 6所示B. 这里，在 T13 处施加刺激，并在逆向方向 (T13-L2) 上最靠近刺激通道的三个通道上获得记录。与假 SCS-ON 对照相比，SNI SCS-ON 动物的平均 CV 明显较慢（F (1, 13)  = 4.762，p  = 0.048），但是，观察到的刺激参数之间没有差异（F (1 ,13)  = 0.540, p  = 0.476)。

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CL-SCS 对疼痛超敏反应的影响评估
目视观察到的 ECAPT 是通过在 50 Hz 200 µs 的 IO 功能收集期间观察记录屏幕来估计的，用于确定 CL-SCS 的刺激强度。该阈值在假 SCS-ON 动物中为 0.036 ± 0.007 mA，在 SNI SCS-ON 动物中为 0.025 ± 0.002 mA。在假 SCS-ON ( t (5)  = 1.198，p  = 0.285) 和 SNI SCS-ON ( t (5) =  0.233 ， p = 0.825 ) 中，目视观察到的 ECAPT 与外推 ECAPT（如上所述）之间没有 显着差异） 动物。

CL-SCS
ECAP 控制的 CL-SCS 已成功应用于所有 SCS-ON 动物。将 CL-SCS 以 ECAPT 和 MT 之间的刺激强度应用于覆盖 T13 的通道 30 分钟，从而在逆向方向上最接近刺激通道的通道上记录产生稳健的 ECAP。图7 A显示了 SNI SCS-ON 动物 30 秒期间 OL-SCS 与 CL-SCS 的对比示例。在 OL-SCS 期间，输入电流 (mA) 保持恒定，并且 ECAP 幅度(mV) 波动。在 CL-SCS 期间，输入电流会自动调节，以保持 ECAP 振幅更加恒定，从而确保脊髓激活更加一致。

显示了 SNI SCS-ON 动物中 CL-SCS 30 分钟期间测量的 ECAP 幅度和传递电流的频率分布（图 7 B）。本例中的 ECAP 目标幅度设置为 0.1495 mV。平均测量的 ECAP 幅度值为 0.1500 ± 0.0001 mV。值遵循目标值周围的正态分布（左图）。电流在 0.029 mA 和 0.049 mA 之间变化，以将幅度保持在目标值附近（右图）。在 30 分钟的 50 Hz CL-SCS 期间，记录了 89,914 个 ECAP。电流和振幅值高于或低于平均值三个标准差被认为是异常值，并被排除在每只动物的分析之外。显示了每只动物的测量 ECAP 幅度与目标 ECAP 幅度之间差异的频率分布（图 7 ）C）。平均而言，假 SCS-ON 动物的 ECAP 幅度为 MT 的 22.18 ± 3.11%（平均 MT：0.9500 mV），SNI SCS-ON 动物的 ECAP 幅度为 MT 的 33.69 ± 11.24%（平均 MT：0.7884 mV）。此外，还显示了每只动物的测量电流和 ECAPT 之间差异的频率分布（图 7D）。

ECAP 控制的 CL-SCS 和疼痛超敏反应
ECAP 控制的 CL-SCS 对机械和冷超敏反应的影响持续 60 分钟，包括 30 分钟的 CL-SCS 应用（0-30 分钟）和 30 分钟的 CL-SCS 终止（30-60 分钟）。分钟）。如上所述，双向方差分析研究了时间（BS1；BS2；0；15；30；45 和 60 分钟）和治疗组（假手术；假手术 SCS-OFF；假手术 SCS-ON；SNI；SNI SCS 的影响） -OFF 和 SNI SCS-ON）对机械超敏反应的影响显示两个因素之间存在显着的相互作用（F (30, 186)  = 31.418, p  < 0.001）。事后t-Bonferroni 校正测试表明，与未植入铅的 SNI 动物相比，CL-SCS 在 15 分钟和 30 分钟时显着降低了 SNI SCS-ON 动物的机械过敏性（SNI；15 分钟：t (5.000)  = 25.677，p  < 0.001；30 分钟：t (6.015)  = 17.821，p  < 0.001）和不接受刺激的 SNI SCS-OFF 动物（SNI SCS-OFF；15 分钟：t (9.498)  = 10.307，p  < 0.001； 30 分钟：t (10.937)  = 10.009；图 8A）。此外，两个独立的单向方差分析研究了 CL-SCS 应用期间（0-30 分钟）和 CL-SCS 终止后（30-60 分钟）的 von Frey 曲线下面积 (AUC)，显示出显着效果治疗组的 von Frey AUC（0-30 分钟：F (5, 31)  = 71.957，p  < 0.001；30-60 分钟：F (5, 31)  = 53.891，p  < 0.001；图 8 B）。Bonferroni 校正事后t检验显示，与 SNI 相比，SNI SCS-ON 动物的 AUC 有所增加（0-30 分钟：t (31)  = 10.464，p  < 0.001；30-60 分钟：t (31)  = 8.298，p < 0.001）和 SNI SCS-OFF（0–30 分钟：t (31)  = 8.010，p  < 0.001；30–60 分钟：t (31)  = 6.385，p  < 0.001）动物在 CL-SCS 期间和之后。

丙酮测试也存在类似的疼痛敏感性降低的情况。研究时间和治疗组对冷过敏的影响的双向方差分析显示出显着的双向交互作用（F (30, 186)  = 4.805，p  < 0.001）。与 SNI SCS-OFF 动物相比，SNI SCS-ON 动物的冷过敏反应显着降低（15 分钟：t (10.147)  = 5.421，p  = 0.004；30 分钟：t (9.020) = 5.335，p = 0.007；30 分钟：t (9.020)  = 5.335，p  = 0.007。图 8C )。对于 AUC 方差分析，在 ( F (5, 31)  = 11.262, p期间观察到治疗组对丙酮 AUC 的显着影响 < 0.001) 和应用 CL-SCS 后 ( F (5, 31)  = 12.651, p  < 0.001; 图 8 D)。与 SNI 动物相比，在应用 CL-SCS 期间，SNI SCS-ON 动物的丙酮 AUC 降低（0-30 分钟：t (31)  = 3.483，p  = 0.023）。

讨论
这是第一项研究，在神经性疼痛实验模型中，自由行为的大鼠在 SCS 期间，对背柱纤维的体内 ECAP 记录进行表征和利用。重要的是，我们的研究首次成功应用了 ECAP 控制的 CL-SCS，显着降低了神经损伤引起的机械和冷超敏反应，这与临床神经性疼痛受试者报告的疼痛强度的降低相当（Broooker 等）等人，2021 年；Mekhail 等人，2022 年）。这种 CL-SCS 效应与背柱中大的有髓纤维的激活直接相关，正如硬膜外导联位置和诱发信号的 CV 所证实的那样。与我们之前的工作一起（Dietz et al. 2022），目前的发现可能有助于通过引入目前 SCS 领域缺乏的客观实时测量来更好地理解 SCS 的作用机制。

在 ECAP 控制的 CL-SCS 临床试验中（Brooker 等人，2021 年；Mekhail 等人，2022 年），患者设置刺激强度以感知主观舒适感，并引发可测量的 ECAP。该强度决定了 ECAP 目标（即有效 SCS 剂量）。Law ( 1983 ) 和 Holsheimer ( 2002 ) 进一步提出，刺激强度≥产生可感知感觉的强度的 1.3 倍才能获得治疗效果。由于感知阈值和 ECAPT 已被证明相对等效（Gmel 等人，2021 年；Pilitsis 等人，2021 年）），ECAPT 可以提供一种客观的测量方法来近似非语言动物的感觉。事实上，感觉阈值定义为当刺激强度约为 MT 的 40-50% 时，动物变得警觉并适应身体姿势或可以观察到其行为出现明显干扰的强度（Song 等人，2014 年；Shechter）等人，2013）。在我们的研究中，生成的 ECAPT 几乎是 MT 的一半，这很可能与感觉阈值相关。在研究 SCS 机制的临床前模型中，仅在术中 SCS 实验中使用诱发神经生理学反应来告知 SCS 剂量（Yang 等人，2014 年；Yang 等人，2020 年；Guan 等人，2010 年））。我们目前的研究结果表明，ECAPT 可用于设定自由行为大鼠的有效 SCS 剂量。虽然这是临床前模型开发中的重要一步，但目前尚不清楚 Law ( 1983 ) 和 Holsheimer ( 2002 ) 提出的用于临床刺激强度的 1.3 因子是否适用于临床前模型并值得进一步研究。

鉴于 ECAP 控制的 CL-SCS 的有效性，我们使用频率直方图评估 CL 设置的精度，以分析 ECAP 目标值周围的 ECAP 振幅分布（即方差）（见图 7  C）和系统自动选择的刺激强度对应的刺激强度分布（见图 7D）。为了帮助与临床结果进行比较，我们的研究中定义了从 ECAPT 到 MT 的范围，作为先前在最近的 CL-SCS 临床研究中描述的治疗窗口的转化替代（Mekhail 等人，2022 ））。在该研究中，ECAP 控制的 CL-SCS 与 OL-SCS 相比表现出更好的疼痛缓解效果，因为 CL 系统确保了背柱纤维更大、更一致的激活。与我们的动物模型中证明的 CL-SCS 相比，OL-SCS 期间背柱激活的变异性与临床试验中看到的相符（例如，参见 Mekail 等人( 2022 )的图4）。虽然目前的临床前 SCS 模型在自由行为的动物中使用 OL-SCS 范式，但背柱纤维激活的潜在变异性以及因此的 SCS 剂量是一个需要进一步研究的因素，特别是与推测的 SCS 范式相关的因素。动物的亚感觉阈值，例如高频或突发 SCS（Zhai 等人，2015）。2022 年；廖等人。2020 年；廖等人。2020 年；宋等人。2014年；陈等人。2019）。重要的是，根据目前的研究结果，ECAP 控制的 CL-SCS 可以提供一种有价值的方法，通过控制背柱纤维的激活来确定最佳刺激强度，并针对每只动物进行个体化。反过来，这可以进一步了解临床前和临床结果之间现有的差异，并为有关利用不同刺激范例的 SCS 亚细胞作用机制的持续争论提供信息（Meuwissen 等人，2018 年；Shechter 等人，2013 年；Cedeño 等人，2013 年）。2023）。

与之前在大鼠、绵羊和人类中的记录一致（Dietz 等人，2022 年；Parker 等人，2020 年；Parker 等人，2013 年），本研究中的 ECAP 在 SNI 动物及其对照中都显示出特征性的三相形态。正如预期的那样，ECAP 振幅随着 ECAPT 后的电流强度线性增长（Dietz 等人，2022 年；Parker 等人，2013 年；Sharma 等人，2023 年）。然而，我们的工作与最近发表的临床前研究的直接比较（Cedeño 等人，2023 年；Sharma 等人，2023 年））强烈建议在分析 ECAP 记录时应仔细考虑多种因素。特别重要的是用于刺激和记录通道的植入引线的位置。我们从等距通道 (4 mm) 记录 ECAP 以控制距离，而 Cedano 等人。( 2023 ) 记录了来自距刺激接触点未报告距离的单独导线的 ECAP。这导致了从幼稚麻醉大鼠中记录的具有非线性 IO 功能的更复杂的 ECAP 形态。此外，夏尔马等人。( 2023）描述了具有非肌电图慢信号的三相 ECAP，该信号显示为突触后信号，同样是在幼稚麻醉的大鼠中，当从刺激通道下方的两个椎骨水平记录时。Sharma 等人描述的慢峰。( 2023 ) 也可能出现在我们的记录中（参见Dietz 等人的图2 B、C 和3 B、C 。 ( 2022））。对这些突触后信号的进一步表征，特别是它们的存在或不存在，以及对镇痛效果的可能影响，将成为未来研究的有趣方向。由于施加刺激和 ECAP (N1) 开始之间的延迟是刺激和记录部位之间距离的函数，因此即使使用相同的刺激参数，不受控制的距离也可能导致不同的结果。此外，之前已经在绵羊和人类身上证明，当距离刺激通道的距离增加时，ECAP 的振幅会减小（Parker 等人，2012 年；Parker 等人，2013 年；Parker 等人，2020 年）。虽然我们的研究中也观察到了这一点（Dietz 等人，2017）。2022），未来的研究需要确定这种现象的本质。在分析临床前模型中的 ECAP 记录时要考虑的另一个重要因素是 SCS 引线的形态测量。而塞达诺等人。( 2023 ) 使用直径为 0.72 mm 的圆柱形引线，Sharma 等人。（2023）使用直径为 0.5 毫米的圆柱形引线，我们的引线（0.2 毫米厚，​​触点宽 0.3 毫米）更类似于人类使用的桨式引线，因此几乎肯定会在激活结构中具有不同的刺激特性。脊髓。然而，这需要对临床前 SCS 研究中使用的模型进行调查和进一步审查。

当前研究的一个意外发现是，与假 SCS-ON 对照相比，SNI SCS-ON 动物中观察到的 ECAPT 和 CV 存在差异。由于临床前模型中使用的刺激强度通常报告为 MT 的百分比 (66-90%) (Smits et al. 2013 )，因此本研究调查了 ECAPT 和 MT 之间的关系。在 2 Hz 和 50 Hz 刺激过程中，在自由行为的假 SCS-ON 和 SNI SCS-ON 动物中，引发 MT 所需的电流显着高于产生 ECAPT 所需的电流，并且该比率与我们之前报道的一致研究结果（Dietz 等人，2022）。有趣的是，与假 SCS-ON 对照组相比，SNI SCS-ON 动物的 ECAPT 显着较低。然而，MT:ECAPT 比率和 MT 没有显着差异。我们还注意到，与假 SCS-ON 对照相比，SNI SCS-ON 动物的 CV 明显较慢。CV 降低先前已在神经病临床前模型中得到证实（Hopkins 和 Gilliatt 1971），并且已知也发生在人类周围神经病中（Pietri 等人1980 ））。然而，应该考虑进一步的研究来调查这些结果是否可以用更大的样本量复制，因为脊髓反应的这些变化可以提供有关神经损伤的病理生理学、神经性疼痛的发展和维持以及神经性疼痛的潜在机制的信息。南海。

结论
总之，这项研究提供了第一个证据，证明 ECAP 控制的 CL-SCS 诱导的 SNI 大鼠镇痛与大的有髓鞘背柱纤维的激活直接相关。在大鼠模型中实施 CL 控制可以通过背柱纤维的受控和持续激活来更好地转化临床前 SCS 模型。未来研究使用 ECAP 控制的 CL-SCS 调查剂量反应关系可以确定最佳刺激剂量。此外，应将 CL-SCS 的功效与其他刺激范例（如 OL-SCS）进行比较，并应进一步研究 SCS 的潜在作用机制，以改善 SCS 的临床应用。