介绍
雷公藤甲素 (TP) 是一种二萜三氧化物，是从中药雷公藤中提取的主要成分1已广泛用于自身免疫性疾病、炎症性疾病及多种肿瘤的治疗2–4。然而，大量研究表明，经 TP 治疗的动物和患者存在严重的生殖系统毒性5,6。TP可显着诱发卵巢损伤，导致卵泡闭锁、黄体数量和性腺指数下降，卵巢微观结构破坏7,8。氧化应激是TP毒性的核心分子机制之一，已被证明与卵泡闭锁和排卵障碍密切相关，包括卵巢早衰（POF）和多囊卵巢综合征（PCOS）9,10。因此，氧化应激可能是预防或治疗TP诱导的生殖毒性的合理目标，而药理氧化应激调节剂可能是有前途的候选药物。

除了细胞凋亡（TP 诱导的生殖毒性的一个主要标志）之外，其他形式的程序性细胞死亡 (PCD)，例如自噬，也可以主要在颗粒细胞 (GC) 中被激活9。自噬是一种高度保守且密切调节的过程，它将细胞底物转运至溶酶体进行大量降解，包括巨自噬、线粒体自噬和分子伴侣介导的自噬。其中，线粒体自噬降解受损的线粒体，线粒体作为 PCD 的效应器并促进细胞死亡过程。

此外，先前的研究表明，氧化应激诱导的线粒体通透性转变会导致线粒体膜电位去极化，从而导致PTEN诱导的激酶1（PINK1）在线粒体外膜上积累。随后，PINK1 招募 Parkin（一种 E3 泛素连接酶）来启动受损线粒体的自噬降解。因此，线粒体自噬可能在 TP 诱导的氧化应激反应中发挥重要作用。

辛加葱蓉土四子丸（XJCRTSZW）是一种补肾、养血、活血的中药复方。它是吴克明教授根据多年的临床经验创建的。方中肉苁蓉、菟丝子、附盆子、桑吉生、熟地黄、当归、淫羊藿、鸡血藤（鸡血藤）、香附（香附）、益母草（冲味子）、枸杞子、泽兰、山药、山茱萸 。肉苁蓉、菟丝子、红宝石为帝药，补肾益精。淫羊藿、山茱萸、熟地黄为臣药，增强帝药补肾之力。其中淫羊藿温肾阳，山茱萸熟地滋补肝肾精血。其余药物，皆为佐药。其中当归、菟丝子、枸杞、枸杞养血活血； 紫杉滋补肝肾，强筋骨；薯蓣益气健脾；而香附是妇科调经的关键，能理气活血，使诸药补而不滞。

我们课题组发现了XJCRTSZW治疗POF和PCOS的有效方法11,12。此外，我们之前的结果还表明，XJCRTSZW 减少了 TP 诱导的细胞凋亡和巨自噬的增强。然而，XJCRTSZW 在 TP 诱导的线粒体自噬介导的氧化应激中的作用仍不完全清楚。

因此，在本研究中，我们在体内和体外研究了XJCRTSZW对TP诱导的线粒体自噬介导的氧化应激的作用，以及在此过程中PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬的机制。这项研究的结果将为治疗生殖毒性，甚至是 POF 和 PCOS 提供新的见解和方法。

方法
动物
成年雌性Sprague-Dawley大鼠（7-8周，200-220 g）购自成都大硕生物科技有限公司。实验前使大鼠适应标准实验室条件7 d。给大鼠提供 12 小时/12 小时光暗循环，并在 25 ± 2°C 和 40-60% 相对湿度下随意喂食标准饮食和水。所有程序均按照成都中医药大学董事会和伦理委员会的要求严格执行。

细胞培养
人卵巢颗粒细胞系（货号CP-H192）购自Procell（中国武汉）。将细胞在人卵巢颗粒细胞完全培养基（CM-H192，Procell）中于37°C、5%二氧化碳（CO 2）下培养。

细胞转染
Pink1模拟物和Pink1抑制剂由Ribobio（中国广州）设计和合成。它是使用 RiboFectTM CP 转染试剂盒（C10511-05，Ribobio）按照实验程序进行的。

含药血清的制备
对于体外实验，首先如下制备含药血清。将 15 只大鼠随机分为 3 组（n=5)：对照组、戊酸雌二醇组(EV，西药对照组)、XJCRTSZW组。EV组大鼠先灌胃EV 0.105 mg/kg/d，每天1次，连续4 d，随后给予醋酸甲羟孕酮0.63 mg/kg/d，每天1次，连续1天。XJCRTSZW组大鼠给予XJCRTSZW 25.2 g/kg/d灌胃，对照组大鼠给予1 mL/100 g生理盐水灌胃，每天2次，连续5 d。随后，用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内麻醉大鼠后，从腹主动脉取血。分离血清并灭活补体用于体外实验。

实验分组及给药
对于体内实验，30只大鼠被随机分为六组（n= 5)：控制组、TP、TP + EV、TP + XJCRTSZW-高、TP + XJCRTSZW-中和 TP + XJCRTSZW-低组。TP、TP+EV、TP+XJCRTSZW-High、TP+XJCRTSZW-Middle、TP+XJCRTSZW-Low组大鼠分别灌胃400μg/kg/d TP（溶解于含5%DMSO的生理盐水中），持续1天。连续30天诱导生殖毒性，对照组大鼠灌胃等量生理盐水。然后，TP+XJCRTSZW-High、TP+XJCRTSZW-Middle、TP+XJCRTSZW-Low组的大鼠分别灌胃给予30、15、7.5g/kg/d XJCRTSZW，持续两周。TP+EV组大鼠先灌胃EV 0.1 mg/kg/d，每天1次，连续4 d，随后给予醋酸甲羟孕酮0.598 mg/kg/d，每天1次，连续1天。停药1天后，总共持续15天。对照组和TP组大鼠按1 mL/100 g生理盐水灌胃，每天1次，连续两周。

XJCRTSZW每剂生药总量为120g，由成都中医药大学药学系制备。方法与之前报道的一致12。XJCRTSZW高、中、低组以及EV和醋酸甲羟孕酮的浓度按成人临床剂量6kg/kg体重、人鼠换算比1:20测定。大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉后，从腹主动脉取血。分离血清并储存在-80°C以供进一步测定。快速取出卵巢组织和GC用于后续分析。

对于体外实验中，将人卵巢GC系接种到六孔板中并分为八组，包括对照、TP、TP+EV、TP+XJCRTSZW、TP+XJCRTSZW+si-Pink1、TP+XJCRTSZW+ov-Pink1、TP+ si-Pink1 和 TP + ov-Pink1 组。对照组的人卵巢GCs在人卵巢GCs完全培养基中培养，而其他七组细胞在人卵巢GCs完全培养基中培养，其中含有100 nM TP，培养6 h。然后，TP组细胞在人卵巢GCs完全培养基中培养，其中含有200μL对照大鼠的对照血清，而TP+EV组细胞在人卵巢GCs完全培养基中培养，其中含有200μL从 EV 大鼠获得的 EV 血清。TP + XJCRTSZW、TP + XJCRTSZW + si-Pink1 中的电池、TP+XJCRTSZW+ov-Pink1组采用人卵巢颗粒细胞完全培养基培养，其中含XJCRTSZW组大鼠药血清200 μL。随后，TP + XJCRTSZW + si-Pink1 和 TP + XJCRTSZW + ov-Pink1 组的细胞在人卵巢 GC 完全培养基中培养，分别包含 20 nM Pink1 抑制剂和 2 μg Pink1 模拟物。TP + si-Pink1 和 TP + ov-Pink1 组细胞在人卵巢 GC 完全培养基中培养，其中包括 200 μL 从对照大鼠获得的对照血清，以及 20 nM Pink1 抑制剂和 2 μg Pink1 模拟物， 分别。细胞维持在 37°C、5% CO 的条件下 TP + XJCRTSZW + si-Pink1 和 TP + XJCRTSZW + ov-Pink1 组的细胞在人卵巢 GC 完全培养基中培养，分别包含 20 nM Pink1 抑制剂和 2 μg Pink1 模拟物。TP + si-Pink1 和 TP + ov-Pink1 组细胞在人卵巢 GC 完全培养基中培养，其中包括 200 μL 从对照大鼠获得的对照血清，以及 20 nM Pink1 抑制剂和 2 μg Pink1 模拟物， 分别。细胞维持在 37°C、5% CO 的条件下 TP + XJCRTSZW + si-Pink1 和 TP + XJCRTSZW + ov-Pink1 组的细胞在人卵巢 GC 完全培养基中培养，分别包含 20 nM Pink1 抑制剂和 2 μg Pink1 模拟物。TP + si-Pink1 和 TP + ov-Pink1 组细胞在人卵巢 GC 完全培养基中培养，其中包括 200 μL 从对照大鼠获得的对照血清，以及 20 nM Pink1 抑制剂和 2 μg Pink1 模拟物， 分别。细胞维持在 37°C、5% CO 的条件下2额外持续 48 小时。

细胞计数试剂盒-8 检测
人卵巢GCs在96孔板中培养，接种密度为1×105/孔并在37°C、5% CO 2中维持24小时。然后，使用细胞计数试剂盒-8（Dojindo Laboratories，熊本，日本）根据制造商的规格确定细胞的增殖。使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，United States of America）在 450 nm 处记录吸光度。

组织学测定和卵泡计数
分离卵巢组织，固定，脱钙，包埋，切片。5 μm 切片用苏木精和伊红 (H&E) 染色。图片是在显微镜（DMI1，LEICA，德国）下获得的。然后，测量初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡的数量。

酶联免疫吸附测定
使用雌二醇酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测雌二醇（E2）、抗苗勒氏管激素（AMH）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、黄体酮（P）和ATP的水平（PE223，Beyotime，上海，中国），大鼠 AMH ELISA 试剂盒（YB-AMH-Ra，Ybscience，上海，中国），大鼠 FSH ELISA 试剂盒（XY-FSH-Ra，Ybscience），大鼠 LH ELISA 试剂盒（XY-LH） -Ra，Ybscience）、大鼠孕酮、PROG ELISA 试剂盒（KB3091，建明生物，上海，中国）和大鼠 ATP ELISA 试剂盒（清启生物，上海，中国），根据制造商的方案。使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific）在 450 nm 波长下测定孔的吸光度，以分析样品浓度。

生化检测
根据制造商的方案，使用脂质过氧化MDA检测试剂盒（S0131M，Beyotime）和带有NBT的总超氧化物歧化酶检测试剂盒（S0109，Beyotime）检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平。使用酶标仪 (Thermo Fisher Scientific) 在 532 nm (MDA) 和 560 nm (SOD) 波长下测定孔的吸光度，以分析样品浓度。

流式细胞仪检测
使用流式细胞仪测定评估 GC 的凋亡。简而言之，收集GC并用膜联蛋白V-APC和PI（Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）在室温下在黑暗中染色20分钟。通过流式细胞术（BD FACSVerse，Waltham，MA，United States of America）测量细胞的荧光。

根据操作手册，使用活性氧测定试剂盒（S0033，Beyotime，上海，中国）检测活性氧（ROS）水平。通过流式细胞术(BD FACSVerse)测量细胞的荧光。

JC-1染色
在盖玻片上培养的 GC 使用 0.1 μM JC-1（分子探针）在 37°C 下维持 20 分钟。荧光图像通过激光扫描共焦显微镜（Zeiss LSM 710 META）分别在 525 和 490 nm 激发下获得。CCCP (50 mM) 用作阳性对照，并在 JC-1 染色前处理 20 分钟。通过聚集的 JC-1（525 nm，红色荧光）与单体 JC-1（490 nm，绿色荧光）的比率来分析线粒体膜电位 (MMP) 的变化。

透射电子显微镜
将卵巢组织和GC固定在3%戊二醛和1%四氧化锇中，并在超薄切片机上切割。然后，切片依次用1%乙酸双氧铀和0.5%柠檬酸铅染色。使用JEM-1400PLUS透射电子显微镜观察结果。

逆转录定量聚合酶链反应
使用TRIzol试剂（宝生物技术有限公司，大连，中国）分离总RNA，并通过Bio-Rad ScripTM cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA）进行反转录（RT） ，美国），根据制造商的说明。所得 RT 产品在分析前储存于 -80°C。RT 定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR) 在 20 μL 混合物中进行，其中包含 2 μL cDNA 模板、10 μL 2x SYBR Master mix（MedChemexpress, Princeton, NJ, United States of America）、0.4 μL 10 μM 正向和反向引物以及 7.2 μL ddH 2O，使用 Bio-Rad CFX Manager 软件（Bio-Rad Laboratories, Inc.）。RT-qPCR 条件如下：95°C 5 分钟，然后在 95°C 15 秒和 60°C 30 秒以及 72°C 30 秒之间进行 40 个循环。使用2 -ΔΔCT方法计算LC3、PINK1、Parkin、p62和Hsp60的相对表达量，并标准化为管家基因β-肌动蛋白。RT 反应在 42°C 下进行 60 分钟，在 70°C 下进行 10 分钟。在 95°C 10 分钟下对基因表达水平进行定量，然后在 95°C 2 秒、60°C 20 秒和 70°C 10 秒下进行 40 个循环。U6作为内部对照。

蛋白质印迹分析
使用总蛋白提取试剂盒（BC3711，Solarbio，北京，中国）提取从卵巢或人卵巢 GC 中分离的 GC 的蛋白质样品。然后，通过蛋白质测定试剂盒(Beyotime)检测蛋白质浓度。接下来，蛋白质样品通过 10% SDS-PAGE 凝胶分离并电转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore，MA，美国）。用3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤3×5分钟后，将膜与山羊抗兔IgG（H+L）-HRP（1:10,000，ab6721，Abcam，剑桥，英国）在室温下孵育1小时。通过电化学发光试剂盒（WBULS0500；EMD Millipore）分析蛋白质条带，

使用的一抗如下：兔抗 LC3II/I (ab128025, 1:1,000, Abcam)、兔抗 p62 (ab56416, 1:1,000, Abcam)、兔多克隆 PINK1 (ab23707, 1:1,000, Abcam) )、Parkin 兔多克隆抗体 (ab15494, 1:1,000, Abcam)、Hsp60 兔多克隆抗体 (ab46798, 1:20,000, Abcam) 和兔抗 β-肌动蛋白抗体 (ab8227, 1:1,000, Abcam)。

统计分析
数据以平均值±标准差表示。使用单向方差分析和邓肯检验，使用社会科学统计包 20.0（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺斯州，美国）分析多组之间的差异。当p > 0.05 和p < 0.05 时，差异被认为在统计上不显着，而当 p < 0.05 时，差异被认为显着。

结果
XJCRTSZW 改善雷公藤甲素诱发的体内生殖毒性
大鼠接受TP治疗后，病理分析显示皮质区原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡数量减少，闭锁卵泡数量增加。部分颗粒层卵泡坏死脱落，核收缩、塌陷，有不同程度的囊性扩张。然而，这些病理症状在 EV 和 XJCRTSZW 治疗后显着改善（图1a）。

图 1
XJCRTSZW 改善 TP 诱导的生殖毒性。(a)通过苏木精和伊红染色测定卵巢的组织学分析。(b)用苏木精和伊红对卵巢进行染色后，测量初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡的数量。(c)使用商业酶联免疫吸附测定试剂盒检测血清 E2、AMH、FSH 和 LH 水平。显示了五个独立样本的平均值±标准差。
此外，卵泡数量的量化表明，EV 和 XJCRTSZW 治疗均显着增强了 TP 诱导的初级卵泡和次级卵泡数量的减少，同时显着降低了 TP 诱导的闭锁卵泡数量的增加。无花果。1b和1c）。TP治疗后血清E2和AMH水平明显降低，而FSH和LH水平显着升高。然而，EV和XJCRTSZW治疗均显着逆转了E2和AMH水平的下降，而只有XJCRTSZW治疗显着拮抗了FSH和LH水平的增强。图1d）。综上所述，我们证明 XJCRTSZW 可改善大鼠模型中 TP 诱导的生殖毒性。

XJCRTSZW抑制雷公藤甲素诱导的体内氧化应激损伤
为了确定 XJCRTSZW 在 TP 诱导的氧化应激损伤中的作用，我们首先检测 SOD 和 MDA 的水平。结果表明，所有EV、高剂量和中剂量的XJCRTSZW处理均显着升高了TP引起的SOD水平的降低，而只有EV和高剂量XJCRTSZW处理显着抑制了TP引起的MDA水平的升高。图2a）。此外，所有 EV、高、中、低剂量的 XJCRTSZW 治疗均显着拮抗 TP 诱导的 ROS 水平增加（图2b）。此外，TP治疗显着提高了GCs的凋亡率，而所有EV、高、中、低剂量的XJCRTSZW治疗均显着逆转了GCs的凋亡率（无花果。2c和2d）。因此，这些结果表明 XJCRTSZW 抑制 TP 诱导的体内氧化应激损伤和细胞凋亡。

图2
XJCRTSZW抑制TP诱导的体内氧化应激损伤和细胞凋亡。(a)使用商业试剂盒检测颗粒细胞中 SOD 和 MDA 的水平。(b)使用活性氧测定试剂盒测定活性氧水平，并通过流式细胞术测量细胞的荧光。( c和d )使用流式细胞术分析细胞凋亡率。显示了五个独立样本的平均值±标准差。
XJCRTSZW 通过体内 PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬
透射电镜显示TP治疗组GCs线粒体大量肿胀，嵴破裂、溶解甚至消失，并有少量线粒体自噬现象，而EV、高、中、低剂量XJCRTSZW治疗组减轻了线粒体自噬的程度。线粒体肿胀并增加线粒体自噬数量（图3a）。此外，TP 治疗后 ATP 和 MMP 水平明显降低，EV 和大剂量 XJCRTSZW 治疗后 ATP 和 MMP 水平明显下降（无花果。3b和3c）。与 TP 组相比，EV 和高剂量 XJCRTSZW 治疗均显着增加了 LC3-II/LC3-I 表达，同时在转录和翻译水平上显着降低了 p62 和 Hsp60 表达。无花果。3d–3f )。此外，与 TP 组相比，EV 和高剂量 XJCRTSZW 治疗后 PINK1 和 Parkin 的 mRNA 和蛋白表达水平均显着增强。总而言之，我们得出结论，XJCRTSZW 通过体内PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬。

图 3
XJCRTSZW 通过体内PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬。(a)使用透射电子显微镜评估颗粒细胞中的线粒体自噬。(b)通过酶联免疫吸附测定检测 ATP 水平。(c) MMP 通过 JC-1 染色测定。( d和e ) 使用蛋白质印迹法评估 LC3-II/LC3-I、p62、Hsp60、Parkin 和 PINK1 的蛋白水平。数据在标准化为β-肌动蛋白后表达。（F）使用定量逆转录聚合酶链式反应检测LC3、p62、Hsp60、Parkin和PINK1的mRNA水平。数据在标准化为β-肌动蛋白后表达。显示了五个独立样本的平均值±标准差。
XJCRTSZW 促进雷公藤甲素诱导的颗粒细胞活力
TP处理后人卵巢GCs的细胞活力显着下降，而EV或XJCRTSZW处理后细胞活力显着恢复。此外，基于 XJCRTSZW 处理后细胞活力的增强，PINK1 的进一步抑制或过表达分别显着降低和增加了细胞活力。与 TP 组相比，仅抑制 PINK1 或过表达 PINK1 即可分别显着降低或升高细胞活力（图4a）。同样，EV 或 XJCRTSZW 治疗显着增加了 TP 诱导的人卵巢 GC 上清液中 E2、AMH 和 P 水平的降低。XJCRTSZW治疗联合PINK1的抑制或过表达进一步降低了培养的人卵巢GC上清液中的E2、AMH和P水平（无统计学差异），或显着增加了E2、AMH和P水平。此外，仅抑制或过度表达 PINK1 即可显着降低或升高培养的人卵巢 GC 上清液中的 E2、AMH 和 P 水平。图4b）。因此，我们证明 XJCRTSZW 可以促进 TP 诱导的 GC 的细胞活力。

图4
XJCRTSZW促进TP诱导的颗粒细胞的细胞活力。(a)使用 CCK-8 检测细胞活力。(b)使用商业酶联免疫吸附测定试剂盒测定培养的人卵巢 GC 上清液中 E2、AMH 和 P 的水平。显示了三个独立样本的平均值±标准差。
XJCRTSZW 抑制雷公藤甲素诱导的体外氧化应激损伤
与体内显示的结果一样，EV和XJCRTSZW治疗显着增强了TP诱导的SOD水平的降低，XJCRTSZW联合过表达PINK1进一步显着提高了SOD水平，但XJCRTSZW联合抑制PINK1显着降低了SOD水平。相反，EV和XJCRTSZW治疗显着降低了TP诱导的MDA水平升高，XJCRTSZW联合抑制PINK1进一步显着降低MDA水平，但XJCRTSZW联合PINK1过度表达显着增加。图5a）。此外，TP处理后培养的人卵巢GCs的ROS水平和凋亡率均显着增加，而EV和XJCRTSZW处理则显着拮抗这种作用。与 XJCRTSZW 治疗相比，XJCRTSZW 治疗联合抑制或过表达 PINK1 分别显着增强或降低培养的人卵巢 GC 的 ROS 水平和凋亡率（无花果。5b和5d）。因此，这些结果表明 XJCRTSZW 抑制 TP 诱导的体外氧化应激损伤。

图 5
XJCRTSZW 抑制 TP 诱导的体外氧化应激损伤。(a)使用商业试剂盒检测颗粒细胞中SOD和MDA的水平。(b)使用活性氧测定试剂盒测定活性氧水平，并通过流式细胞术测量细胞的荧光。(c和d)使用流式细胞术分析细胞凋亡率。显示了三个独立样本的平均值±标准差。
XJCRTSZW 在体外通过 PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬
EV 和 XJCRTSZW 治疗组中 TP 诱导的 MMP 降低显着升高，与 XJCRTSZW 治疗组相比，XJCRTSZW 治疗联合抑制或过度表达 PINK1 分别显着降低或升高 MMP 水平（图6a）。透射电子显微镜显示，与 TP 组相比，EV 和 XJCRTSZW 治疗后线粒体自噬有所增加。与 TP+XJCRTSZW 组相比，XJCRTSZW 治疗联合抑制或过度表达 PINK1 减少或增强了线粒体自噬数量（图6b）。EV和XJCRTSZW处理增强了TP诱导的LC3-II/LC3-I表达的减少，并显着降低了TP诱导的p62表达的升高。

图 6
XJCRTSZW 通过体外PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬。(a)通过JC-1染色测定MMP。（b）使用透射电子显微镜检测颗粒细胞中的线粒体自噬。( c和d ) 使用蛋白质印迹法评估 LC3-II/LC3-I、p62、Parkin 和 PINK1 的蛋白水平。数据在标准化为β-肌动蛋白后表达。显示了三个独立样本的平均值±标准差。
此外，与TP+XJCRTSZW组相比，XJCRTSZW治疗联合PINK1抑制或过表达组p62的相对蛋白表达显着增加或减少。此外，EV和XJCRTSZW治疗进一步显着增强了TP诱导的PINK1和Parkin蛋白水平的升高，而XJCRTSZW治疗与PINK1过度表达相结合进一步增加了PINK1水平。无花果。6c和6d）。

简而言之，我们得出结论，XJCRTSZW 通过体外PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬，从而改善 TP 诱导的氧化应激损伤。

讨论
在本研究中，成年雌性 SD 大鼠和人卵巢 GC 系先用 TP 治疗，然后用 XJCRTSZW 治疗。我们发现 XJCRTSZW在体内和体外均通过线粒体自噬改善 TP 诱导的氧化应激。从机械角度来看，PINK1/Parkin 信号通路介导的线粒体自噬在体内和体外均参与了这一过程。

TP具有抗炎、抗动脉硬化、抗肿瘤等多种药理作用，已广泛应用于临床。然而，越来越多的证据表明，TP 会对动物和人类产生严重的生殖毒性。

本研究中，TP治疗后也观察到严重的生殖毒性，表现为严重的病理症状，初级卵泡和次级卵泡减少，体内闭锁卵泡增加，这与之前的研究一致13。此外，XJCRTSZW治疗显着拮抗TP引起的病理症状以及初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡数量的变化。

下丘脑-垂体-卵巢轴（HPOA）通过激素的反馈调节机制调节卵巢功能、女性月经周期和生育功能14。因此，HPOA失调可导致女性内分泌功能紊乱和不孕。15。

我们的结果显示，XJCRTSZW 治疗显着提高了 TP 诱导的 E2 和 AMH 降低，但降低了 TP 诱导的 FSH 和 LH 增强。E2是女性体内最丰富、最活跃的雌激素。由卵泡GC分泌，受LH和FSH调节，能促进生殖系统各器官的发育，促进子宫内膜增生和脱落，维持女性第二性征16。AMH由小卵泡的GC分泌，其水平不受其他外源激素药物或妊娠的影响。因此，它是评估卵巢储备和卵巢早衰的可靠指标17 号。

LH 和 FSH 均由垂体前叶的嗜碱性粒细胞分泌。其中，FSH可以促进卵泡内GC的增殖和分化，促进卵泡的成熟，使卵巢生长。LH和FSH有协同作用，促进成熟卵子的排出，使破裂的卵泡形成黄体，分泌雌激素和P18。因此，E2、AMH、LH、FSH的水平可以直接反映卵巢的功能状态。综上所述，我们证明 XJCRTSZW 可以通过 HPOA 改善 TP 诱导的生殖毒性。

大量研究表明TP可以在体内和体外诱导氧化应激9。同样，我们的数据表明，XJCRTSZW 治疗显着提高了 TP 诱导的 SOD 减少，但降低了体内和体外TP 诱导的 MDA 和 ROS 水平的增强。SOD是一种抗氧化酶，特异性清除体内氧自由基，在体内氧化和抗氧化平衡中发挥着重要作用。SOD可以调节超氧阴离子自由基产生过氧化氢，过氧化氢在体内被GSH-PX进一步转化为水19。MDA是脂质过氧化物的降解产物，反映体内脂肪的过氧化程度。因此，SOD活性和MDA含量可以指示氧化应激的程度。

此外，肉苁蓉20,菟丝子种子21,黑莓果22,熟地黄23,鸡血藤24、 和番茄25XJCRTSZW的核心成分——已被证明对多种疾病具有抗氧化作用。ROS 水平升高会改变促氧化剂和抗氧化剂之间的平衡。因此，适当的ROS对于细胞的正常进展是必要的26。过多的ROS诱导不适合女性正常的生理反应，导致PCOS、子宫内膜异位症、不孕症等一系列生殖疾病26,27。因此，这些结果表明 XJCRTSZW 可以改善 TP 诱导的氧化应激。

我们的结果还表明，XJCRTSZW 治疗可显着降低体内和体外TP 诱导的细胞凋亡率升高。除了细胞凋亡外，自噬也主要在GC中被激活9。此外，新出现的证据表明，多种哺乳动物细胞在氧化应激条件下会激活自噬死亡，但不会诱导细胞凋亡28,29。

我们的结果表明，XJCRTSZW 处理显着增加了线粒体自噬的数量，并且 XJCRTSZW 处理还显着增强了 TP 诱导的 ATP 和 MMP 水平的降低。此外，与TP处理相比，XJCRTSZW处理在体内和体外均显着升高LC3-II/LC3-I、PINK1和Parkin的水平，并降低p62的表达。

当线粒体受损时会触发线粒体自噬，通过消除功能失调的线粒体来保护细胞免受不同的细胞毒性刺激30。作为线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PINK1 在调节线粒体动力学、运输和质量控制方面发挥着核心作用31,32。Parkin 是一种 E3 泛素连接酶，也被确定为线粒体质量控制的关键调节因子。此外，Parkin可以促进PINK1定向的去极化线粒体的自噬清除33,34。PINK1 往往稳定在受损的线粒体上以激活 Parkin，因为 MMP 的减少可防止 PINK1 的蛋白酶体降解。

此外，在本研究中，XJCRTSZW治疗联合抑制PINK1显着增加细胞凋亡率以及ROS、MDA和p62的水平。相反，它导致 SOD、MMP、LCII/LCI、PINK1 和 Parkin 水平降低。相反，XJCRTSZW 治疗结合 PINK1 的过度表达显着逆转了这些变化。此外，之前的研究表明，多余的线粒体自噬可以去除大量的线粒体，从而引起细胞凋亡35–37。此外，氧化应激可以激活线粒体自噬38。因此，我们得出结论，XJCRTSZW 通过 PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬。

结论
我们的结果表明，XJCRTSZW 可以在体内和体外通过线粒体自噬改善 TP 诱导的氧化应激。从机制上讲，PINK1/Parkin 信号通路在介导线粒体自噬中的参与是显而易见的。