介绍
目前的口腔伤口愈合疗法在口腔伤口管理和组织再生方面缺乏有效的治疗结果。口腔粘膜伤口缺乏成功的治疗方法，迫使临床医生寻找替代疗法和潜在疗法来促进口腔内愈合。

受伤后，口腔粘膜会经历几个生物愈合过程以保持体内平衡。虽然伤口愈合是已知的并且可以在皮肤伤口中进行治疗，但口腔内愈合方面的文献有限，这使得临床治疗方案变得复杂化。再生方法致力于增强口腔伤口愈合，但它们需要不同的有效选择来促进组织再上皮化和细胞外基质（ECM）重塑1。肉芽组织发生重塑，并提供促再生生长因子，如成纤维细胞生长因子 (FGF)、表皮生长因子 (EGF) 和血管内皮生长因子2。成纤维细胞迁移至临时基质，是 ECM 重塑不可或缺的一部分；这些细胞沉积基质蛋白，包括胶原蛋白和纤连蛋白，以提供愈合组织的结构完整性3。当身体在受伤后无法成功建立体内平衡时，伤口愈合的阶段就会被破坏，并导致组织再生受损。这是当炎症持续超过 7 天时。因此，上皮化延迟和组织坏死就变成了3。促炎介质的持续分泌可能会导致伤口愈合受损，其特征是肉芽肿形成、瘘管发生、伤口裂开、溃疡和出血过多4。

Ellagic Acid (2,3,7,8-tetraHydroxy-chromeno[5,4,3-cde]chromene-5,10-dione) (EA) 是一种生物活性多酚化合物（单宁），分子量为 302 gmol -1。EA显示出广泛的生物活性和对人类健康的潜在有益影响5。还报道了 EA 存在于各种具有抗氧化活性的商业产品中。EA 因其抗突变、抗菌和抗氧化特性而具有多种益处6–8。它可以防止肿瘤的形成，与细胞壁或容易形成复合蛋白的部位相互作用，从而防止转移细胞的增殖。洛索等人。9揭示了 EA 在人类细胞、肺癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌中潜在的细胞毒性和抗增殖活性，并表明 1 至 100 μmol/L 的剂量可抑制癌细胞的增殖。EA 可能通过抑制促进转移的因子导致癌细胞凋亡。EA 是一种化学预防剂，用于治疗由多环芳烃引起的癌症，并被批准用于防止癌细胞中肿瘤的持续生长，并诱导细胞凋亡或细胞死亡10。EA 通过消除自由基显示出其抗氧化特性。

EA 作为抗病毒和抗菌剂可以抑制人体病原体的生长，可能与细菌壁中的蛋白质结合，例如芽孢杆菌、葡萄球菌和沙门氏菌6。EA可预防因高血糖引起的眼睛、肾脏、心脏以及上下肢关节的损伤11它具有抑制醛缩酶还原酶的能力，醛缩酶还原酶负责在小血管中产生蛋白聚糖类化合物，导致失明、肾损伤、瘫痪、心脏病和与两种糖尿病相关的四肢丧失。EA 似乎可以增加胰岛素活性，并具有多种炎症作用和减少氧化应激作用12,13。

在此实验模型中，我们旨在研究 EA 在牙龈组织伤口中组织再生的潜力。

方法
动物
所有实验方案均得到土耳其戴勒大学当地动物实验伦理委员会的批准。使用Gpower3.1程序计算大鼠数量，效应大小=0.8，功效=0.60，α=0.15。48只12周龄的Sprague Dawley大鼠在22±2℃的不锈钢笼中饲养，正常饮食和自来水，光照12小时，黑暗12小时，不受任何限制。

手术方案
在全身麻醉下使用 90 mg/kg 盐酸氯胺酮和 8 mg/kg 赛拉嗪（肌肉注射），用聚维酮碘溶液消毒，并通过从位于牙龈的牙龈上去除直径 4 mm 的瓣来形成切除伤口区域。左磨牙区。造成创伤后开始以1cc冲洗液的形式施用冲洗剂，并且每天在同一时间以30秒的方式施用一次。丁丙诺啡被用作创伤后镇痛剂。单剂量0.01mg/kg皮下注射用于术后镇痛。EA（货号：E2250）是从德国默克公司进口的。冲洗溶液配制为 1 cc 中 1.2 mg/mL。

实验设计
烧伤组：本组动物上腭、牙龈损伤，麻醉下心内采血处死；

烧伤+EA组：对本组动物的上颚和牙龈进行烧伤，给予1.2mg/mL EA冲洗1周。在麻醉下通过心内抽血处死动物。

以下试点研究方案用于将 EA 作为口腔冲洗溶液施用14,15。

生化分析
EA 作为灌溉溶液在当地应用。由于它在消化道中被吸收，我们观察了血液中丙二醛 (MDA)、髓过氧化物酶 (MPO) 和谷胱甘肽 (GSH) 的水平。将血样收集在带有凝胶分离器的试管中，并在 1,550 g 下离心 5 分钟。取出上清液血浆并置于聚丙烯塑料管中。管子上贴有适当的样品名称和类型的标签。采集样品并储存在-80°C，用于测定 MDA、GSH 和 MPO。Draper 和 Hadley 使用双重加热法测定 MDA 水平16。MDA 值表示为每克湿组织的纳摩尔数 (nmol/g)。GSH 活性由 Paglia 和 Valentine's 测量17 号方法。数据表示为U/g蛋白质。通过类似于 Hillegass 等人描述的程序来测量组织中的 MPO 活性。18。MPO 表示为 U/g 组织。

组织病理学分析
获得牙龈切片用于组织病理学分析，并固定在 10% 缓冲福尔马林中，在乙醇（50% 至 100%）中脱水，在二甲苯中纯化，并包埋在石蜡中。切割切片（4-5毫米厚）并用苏木精和伊红（H＆E）染色，并进行研究以评估牙龈组织的病理变化19。

免疫组织化学分析
将甲醛固定的组织包埋在石蜡中以进行进一步的免疫组织化学检查。将切片在二甲苯中脱蜡并通过递减的醇系列。抗原修复过程在柠檬酸盐缓冲溶液（pH 6）中在微波炉中以 700 W 进行 15 分钟。切片在室温下冷却 30 分钟，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤两次，每次 5 分钟。内源性过氧化物酶阻断在3%过氧化氢溶液中进行7分钟。将洗涤后的样品在 Ultra V 模块（目录号 TA-015UB，ThermoFischer，美国）中孵育 8 分钟。从切片中除去封闭溶液，并与一抗 EGF（目录号：ab9695，Abcam，美国）和 FGF（目录号：ab92337，Abcam，美利坚合众国）。在 PBS 中清洗切片后，应用二抗（TP-015-BN，ThermoFischer，美国）20 分钟。将切片在 PBS 中洗涤 2 × 5 分钟，然后暴露于链霉亲和素过氧化物酶（TS-015-HR，ThermoFischer，美国）20 分钟。用 PBS 清洗的切片允许与 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB)（TA-001-HCX，ThermoFischer，美国）发色团反应。用苏木精复染，洗涤后封片。在光学显微镜下检查切片（Zeiss Imager A2，德国）将切片在 PBS 中洗涤 2 × 5 分钟，然后暴露于链霉亲和素过氧化物酶（TS-015-HR，ThermoFischer，美国）20 分钟。用 PBS 清洗的切片允许与 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB)（TA-001-HCX，ThermoFischer，美国）发色团反应。用苏木精复染，洗涤后封片。在光学显微镜下检查切片（Zeiss Imager A2，德国）将切片在 PBS 中洗涤 2 × 5 分钟，然后暴露于链霉亲和素过氧化物酶（TS-015-HR，ThermoFischer，美国）20 分钟。用 PBS 清洗的切片允许与 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB)（TA-001-HCX，ThermoFischer，美国）发色团反应。用苏木精复染，洗涤后封片。在光学显微镜下检查切片（Zeiss Imager A2，德国）20,21。

统计分析
统计分析由 IBM Statistical Package for the Social Sciences 25.0 软件（IBM，Armonk，纽约，美国）执行。通过夏皮罗-威尔克检验分析数据分布。数据记录为中位数（最小值-最大值）和平均等级值。使用曼-惠特尼检验评估二元组比较。P < 0.05 被认为是显着性水平。

结果
生化结果
生化（MDA、MPO 和 GSH）和组织学参数（上皮形成、炎症、白细胞浸润、FGF 和 EGF 表达）的统计分析显示在表格1。与对照组相比，GSH、上皮化、FGF和EGF表达均显着增加。烧伤+电针组的 MDA、MPO、炎症和白细胞浸润明显低于烧伤组（表格1）。

 缩略图
表1
烧伤和烧伤+鞣花酸组的生化和组织学参数。通过夏皮罗-威尔克检验分析数据分布。数据记录为中位数（最小值-最大值）和平均等级值。使用曼-惠特尼检验评估二元组比较。P < 0.05 被认为是显着性水平。
组织病理学结果
苏木精和伊红染色结果
在烧伤组中，我们观察到上皮变性（箭头），结缔组织区域水肿和炎症细胞浸润（箭头），血管扩张和充血（星号）。图1a）。在烧伤+电针组中，观察到牙龈上皮（星号）的改善、胶原纤维生成的增加（星号）、真皮中胶原化结构分布不均匀（箭头）（图1b）。

图1
牙龈切片的苏木精和伊红染色。(a)烧伤组；(b)烧伤+鞣花酸组。
成纤维细胞生长因子免疫染色结果
烧伤组中，成纤维细胞（箭头）和真皮其他细胞（星形）中 FGF 表达呈阳性（图2a）。在烧伤+电针组中，FGF在上皮层（星号）、真皮（星号）和血管（箭头）中表达较高（图2b）。

图2
牙龈切片的免疫组织化学染色。牙龈切片的（a和b）成纤维细胞生长因子和（c和d）表皮生长因子免疫染色（a）烧伤组；(b)烧伤+EA组；(c)烧伤组；(d)烧伤+EA组。
表皮生长因子免疫染色结果
在烧伤组中，观察到牙龈上皮（星号）和真皮层（星号）中的 EGF 免疫活性增加（图2c）。在烧伤 + EA 组中，EGF 在生发上皮细胞（星号）、结缔组织（星号）和血管（箭头）中表达呈阳性（图2d）。当我们将其与烧伤组进行比较时，可以说上皮结构和胶原纤维开始形成。

讨论
在本实验研究中，从成纤维细胞和表皮生长因子的组织病理学角度评估了电针对牙龈组织的保护作用。

EA 是一种两亲性化合物，具有抗菌和伤口愈合特性。它具有两个内酯环和四个羟基，形成亲水部分。EA 的亲水部分使其参与细胞活动。亲水部分还具有氢键受体和供体位点。它们共同使 EA 具有生物活性22,23。

EA 有很多应用。研究表明，利用水溶性EA可以去除水溶液中的二价离子金属离子，这表明EA具有金属螯合剂24。另一项研究表明 EA 适合聚合物应用25。弗雷恩等人。发现附着在 CdSe 纳米颗粒上的 EA 组件具有热稳定性，并且比 CdSe 纳米颗粒更有效地降解茜素红（一种有毒芳香化合物模型）。因此，构建这种不仅可以与环境污染物结合而且可以有效光降解它们的纳米复合材料，可以为新型高度稳定的发光材料打开新的大门，这种材料能够降解有毒化合物，用于环境修复26。在一项体外研究中，Kim 等人。研究了一种带有壳聚糖-EA (Ch-EA) 薄膜的局部药物输送系统，这是一种可植入的聚合物装置。据称，他们应用的局部递送系统由作为聚合物载体的壳聚糖和作为抗癌药物的EA组成。他们观察到，随着 EA 浓度的增加，薄膜变得更粗糙和亲水，并且观察到新的 EA 结晶峰。他们提出，在Ch-EA 0.5和Ch-EA1范围内，Ch-EA膜在短时间内对黑色素瘤细胞具有较强的抗增殖作用，并诱导细胞凋亡。27。

基于碱性 FGF 对 3T3 成纤维细胞增殖的影响，首次在大脑和垂体提取物中发现了碱性 FGF。人bFGF最初被认为是合成为155个氨基酸的蛋白质，与牛bFGF具有高度的序列同源性（98.7%），表明它在物种间高度保守28。人类 bFGF 由位于 4 号染色体的一个基因编码29,30。bFGF 已被鉴定为一种 18 kDa 蛋白质，具有多种高分子量 (HMW) (22–24 kDa) 翻译变体31,32。bFGF 蛋白的晶体学分析表明其结构完全由 β-折叠组成。bFGF 的三级结构由三个 4 链 β-弯曲基序组成，形成一个在氨基末端和羧基末端封闭的桶33。18 kDa bFGF 主要存在于细胞质中，促进细胞生长和迁移，而 HMW bFGF 主要定位于细胞核，促进细胞生长，但不促进迁移，并且是低血清条件下细胞生长所必需的34,35。

EGF是一种能够再生表皮细胞的多肽。其作用不仅体现在细胞水平上，而且体现在分子水平上。它表现为减缓皮肤的衰老。EGF 是由美国教授 Stanley Cohen 在 20 世纪 60 年代研究并发现的。他的发现受到高度赞赏，1986年他被授予诺贝尔生理学或医学奖作为标志。如今，该因子已在医学和美容学的许多领域得到最广泛的应用36。

牙龈组织不断受到机械和细菌的侵袭。牙龈愈合不成功会导致疤痕形成以及腭和上颌复合体的生长受损1。因此，为了减少口腔手术后的愈合受损，正在进行研究项目来改善这种情况。

正在研究替代策略，以结合手术干预促进口腔伤口愈合和组织再生。研究了不同的新疗法作为治疗选择，使用合成聚合物、生物移植物、凝胶状软膏、混合支架以及药物、细胞、组织或生长因子来增强口腔伤口愈合。这些研究利用组织学上皮再生和伤口闭合显微镜图像分析了口腔伤口愈合治疗的成功。

梅木等人。37研究人员通过将瘦素（一种唾液中天然存在的激素）局部应用于日本白兔的牙龈伤口来治疗口腔伤口，研究了瘦素的作用。这些伤口直径为 5 毫米，是通过将浸有 50% 醋酸的滤纸涂抹在下颌的牙龈组织上而形成的。林等人。38研究了 1% 姜黄素对兔子的局部治疗，该伤口是用 15 μL 50% 乙酸造成的 6 毫米牙龈伤口。相比之下，Kılıç 等人。39通过手术切除牙龈组织造成 15 毫米的损伤。他们用兔子进行了为期五天的研究，以测试局部应用谷胱甘肽和壳聚糖对伤口愈合不良和减少氧化的有效性。

另一项关于桃叶珊瑚苷的研究表明，与对照组相比，桃叶珊瑚苷治疗小鼠的炎症细胞在第 5 天显着减少。应用马森三色和天狼星红，结果显示，与对照组相比，在受伤后第 5 天，桃叶珊瑚苷治疗的小鼠愈合区域附近新积累的胶原蛋白显着增加40。在我们的研究中，烧伤显着降低了 GSH、上皮化、FGF 和 EGF 的表达。烧伤组MDA、MPO、炎症和白细胞浸润明显升高。电针治疗改善了这些分数（表格1）。

我们的组织病理学结果显示上皮变性，结缔组织区域水肿和炎症细胞浸润，血管扩张和充血。图1a）。在烧伤+电针组中，牙龈上皮得到改善，胶原纤维产生增加，并且观察到真皮组织化（图1b）。FGF 在成纤维细胞和真皮其他细胞中表达呈阳性（图2a）。FGF 在上皮层、真皮和血管中表达较高（图2b）。据观察，牙龈上皮和真皮层中的 EGF 免疫活性增强（图2c）。EGF 在萌发上皮细胞、结缔组织和血管中表达呈阳性（图2d）。

由于研究的局限性，研究中实验组的动物数量相当少。对更多群体和动物进行实验会产生更安全的结果。该研究主要是组织病理学的，但它可以得到不同技术和体外研究的支持。

结论
通过再生生长因子的评估，观察到组织重塑的质量更好；EGF 和 FGF，免疫组织化学。根据我们的观察，我们可能认为电针有可能为口腔伤口带来更好的愈合效果。EA 似乎对促进口腔伤口愈合具有良好的治疗效果。