介绍
周围神经接口是用于调节或监测周围神经活动的植入式神经技术，用于治疗运动、感觉或自主神经疾病以及非神经系统疾病（Larson 和Meng 2020 ）。神经外袖带电极被广泛认为是可植入神经接口中最安全但选择性最低的电极（Paggi 等人，2021）。用于靶向周围神经的袖带电极的设计和开发主要涉及创建充分包围所选组织的神经外植入物。设计理想的袖带电极面临着一些挑战，主要是由于不同动物模型和人类的神经目标存在很大差异。

首先，不同解剖位置和物种之间的周围神经大小差异很大，因此很难开发出“一刀切”的电极（图1A）。此外，不同个体或动物之间以及不同神经长度上同一神经的大小和形态存在相当大的差异（Hammer et al. 2015）。因此，神经变异性的不可预测性使得选择合适的袖带尺寸具有挑战性，即使针对相同的体内模型和神经水平也是如此。神经的束状组织是神经解剖学的一个重要方面，它给袖带电极设计带来了额外的挑战。神经纤维排列成束，称为束，每个束可能在神经本身内发挥不同的运动/感觉功能（Stewart 2003；Badia 等人2010；Jayaprakash 等人2023）。整个神经的纤维组织并不是恒定的，因为神经纤维沿着神经合并、分裂和重组 (Upadhye et al. 2022）。因此，袖带的放置和稳定性对于实现一致和最佳的治疗效果至关重要。除了神经大小之外，神经束的数量及其组织以及整体神经形状也存在显着的种间和种内差异（Pelot et al. 2020）。这些方面使设计过程进一步复杂化，因为每个因素都会影响袖带的几何形状、电极数量和分布。因此，全面了解这些因素对于实现袖带电极的最佳设计和功能至关重要。

图。1
图1
易于植入且适应性强的软袖带电极。 总结了常见目标人类、猪和大鼠神经的神经直径范围的量表。B 制作的软套囊电极示例，箭头指示其组件。插图显示了 Pt-PDMS 复合材料和微裂纹金膜的扫描电子显微镜图像。C 一个袖带（左）的示意图，它可以适应不同的琼脂糖幻神经尺寸（2-7毫米）和形状（i），并且可以在弯曲过程中顺应（虚线）（ii）。PDMS 已用蓝色着色剂着色，以提高幻神经的可见度。D 带状紧固方法可轻松进行手术植入：(i) 将袖带拉至神经下方 (ii) 将缝合线穿过狭缝 (iii) 将带拉过狭缝并锁定到位。比例尺 1 厘米

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自 20 世纪 70 年代和 80 年代发展以来（Stein 等人，1975 年；Naples 等人，1988 年），袖带电极已成为临床和临床前环境中广泛使用的工具。这些设备是实现与周围神经系统 (PNS) 微创接口的首选，其不同的设计旨在简化植入程序并确保在目标神经周围安全贴合。然而，标准袖带通常难以解决上述与神经变异、大小、形状和束状组织相关的挑战。

商业和临床袖带通常采用简单的螺旋、分体圆柱或螺旋设计（Stein 等人，1975 年；Naples 等人，1988 年；Nemeroff 等人，2006 年）。虽然这些设计已被证明在长期植入中足够有效（Christie et al. 2017），但它们仍然具有重要的局限性。在神经直径大于标称袖带值的情况下，植入物会对神经施加外部压力，导致血流阻塞和随后的神经退化（Cuoco 和 Durand 2000）。相反，袖带可能太松，导致电极接触不良和沿神经长度的潜在位移（Eldabe 等人，2015）。此外，种植体界面处的异物反应 (FBR) 通常对长期植入和功能构成重大挑战 (Carnicer-Lombarte et al. 2021 )。尽管袖带是使用硅胶等软材料制成的，但所采用的壁厚（最大 1 毫米）可能会产生巨大的压力，从而导致 FBR（González-González 等人，2018）。

为了解决这些持续存在的问题，研究人员现在正在探索一种利用创新材料和几何形状的新型神经外接口。这些新颖的设备旨在减少界面处的机械失配（Lacour et al. 2016），提高顺应性并提高刺激的空间分辨率。为此，可拉伸聚合物袖带电极已显示出有希望的结果。例如，使用可随周围神经变形的导电粘塑性聚合物创建了软袖带（Liu et al. 2020）。其他（Cuttaz 等人，2021）开发了一种基于 PDMS 绝缘材料和作为导电弹性体的 PEDOT-PSS/PU 复合材料的全聚合物袖带。这些演示强调了使用机械兼容材料来确保改善接触和降低 FBR 的好处，但多触点配置和连接器集成仍然是有待解决的挑战。事实上，这些新技术通常在简单的双极或三极环设计中得到验证，与多接触袖带相比，这些设计的束选择性有限（Polasek 等，2009）。这主要是由于互连分辨率的限制以及高通道数连接器和电线在这些新型材料上的复杂集成（Fallegger 等人，2020）。为此，人们提出了一种向前迈出的一步，即使用金纳米线作为导体的柔软且可拉伸的多接触袖带（Lienemann 等人，2023）。虽然软性和空间选择性技术的可行性已经确立，但未来的工作还需要确保易于操作、适当的锁定机制和长期稳定性的评估。

在这项工作中，我们描述了一种用于周围神经接口的新型可拉伸、选择性、适应性强且稳定的袖带电极的开发。这项工作旨在通过关注材料和力学、闭合机制及其稳定性、电极数量、连接器集成、生物集成以及电化学和体内性能来满足该领域最紧迫的要求。

该袖带采用 150 μm 硅胶层 (E  ∼  1 MPa) 作为基材，并结合可拉伸薄膜金轨道，旨在适应各种神经尺寸和形状。它具有独特的带状结构，确保近乎完整的周边覆盖并促进植入，同时最大限度地减少占地面积和对神经的压力，以降低 FBR。电化学表征和大鼠坐骨神经测试证实了该装置在不同条件下的稳定性能。该袖带的适用性在涉及猪坐骨神经刺激的平移应用中得到了进一步证明，该应用采用 16 通道设计，选择性地激活多达五个独立的肌肉。

材料和方法
补充材料中提供了与设备制造、幻神经制造和组织处理相关的详细方法。

袖口制作
该制造方法基于先前开发的结合传统微加工技术和软光刻技术的工作（Minev et al. 2015a；Schiavone et al. 2020；Fallegger et al. 2021），并在补充材料（补充材料和方法）中进行了全面描述和说明。和图S 1 -S 2）。简而言之，对 4 英寸硅片进行处理并涂上葡聚糖释放层，然后旋涂 75 μm 聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。将 23 μm 聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 片手动层压在 PDMS 上，充当荫罩。使用飞秒激光器（WS Turret、Optec 和热蒸发（Auto 306、Edwards）定义电极和轨道图案，并使用热蒸发（Auto 306、Edwards）沉积导电 Cr 和 Au (5/35 nm)。通过以下方法在另一个硅载体上制备封装层：创建 PET/PDMS/PET 堆叠 (23/75/23 μm)，具有用于电极和焊盘的激光图案开口。封装的 PDMS 层通过氧等离子体活化粘合到基板上。植入电极涂有一层使用丝网印刷的铂硅复合材料。最后，将柔性PCB对齐并连接到焊盘，2023）。固化后，使用激光切割确定植入物的轮廓，最后通过将葡聚糖层溶解在水中来释放袖带。

神经覆盖评估
使用数字显微镜（Leica DVM6）在带或不带袖带外壳的幻影聚丙烯酰胺（PAAm）神经横截面表面上进行图像采集。定量在 ImageJ 中进行。

神经压迫量化
使用数字显微镜（Leica DVM6）在带或不带袖带外壳的模型 PAAm 神经横截面表面上进行图像采集。使用数字图像相关（DIC）进行量化。简而言之，将样本垂直放置在相机下方，暴露幻神经横截面。图像是带袖带和不带袖带拍摄的。然后使用开源 Matlab (Mathworks) 软件包 NCorr (Blaber et al. 2015 ) 提取应变图，将应变图像与静止图像进行比较。然后从包中提取数据并在 Matlab 2019b 上进一步分析。

锁定稳定性测试
使用拉伸测试仪（MTS Criterion Model 42，测力传感器 1 N）以 0.1 mm/s 的速率通过机械单轴拉伸测试来测量袖带锁定稳定性。幻神经被粘合并固定在针上，针被夹在测试仪上。他们在测试前保持水分。记录移位前的最大力。

电化学阻抗谱
电化学阻抗谱 (EIS) 在体外（平坦和锁定袖带条件）和体内进行。使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 1X 中的 3 电极装置、铂对电极和 Ag/AgCl 参比进行体外测量。体内测量是在 2 电极设置中进行的，使用不锈钢针放置在皮下作为计数器。使用恒电位仪（REF 600，Gamry Instruments）发送 1 MHz 至 1 Hz 的 100 mV 正弦波进行 EIS。

电压瞬态测量
使用连接到工作电极和 Pt 对电极的示波器（Tektronix，MDO3014）测量电压瞬变 (VT)。测量在 PBS 1X 中进行，同时用电流源（隔离脉冲刺激器型号 2100，AM Systems）并行刺激，对称双相阴极优先脉冲幅度为 100 μA，脉冲宽度为 300 μs，频率为 100赫兹。体内测量是在 2 电极设置中进行的，使用不锈钢针放置在皮下作为计数器。

大鼠袖带和肌电图植入
所有动物程序和实验均获得瑞士日内瓦州兽医办公室的批准（许可证 GE82）。所有手术均在氧气和异氟烷混合麻醉下进行，诱导浓度为 4%，维持浓度为 2-2.5%。

对于急性研究，在异氟烷麻醉下，总共 5 只初始体重约为 250 g 的成年雌性 Lewis 大鼠在其左侧坐骨神经上植入软袖带电极。手术前将左后爪剃毛。简而言之，在大腿中部切开皮肤并通过钝性解剖将其与下面的结缔组织分离。通过分离筋膜并更深地解剖股外侧肌和二头肌之间来暴露坐骨神经。然后将神经从周围的结缔组织中切开 15-20 毫米，直至分支成胫骨和腓骨部分。

将软套囊小心地插入并锁定在神经周围的两个不同位置：近端，尽可能远离分支，远端，就在神经分支上方。肌电图 (EMG) 双极针电极通过皮肤定位，针对通过坐骨神经介导的两块拮抗肌、胫骨前肌 (TA) 和腓肠肌 (GM)。

手术后立即用过量的戊巴比妥（Esconarkon，Streuli）处死植入袖带的大鼠。

对于长期研究，总共 2 只雌性 Lewis 大鼠（初始体重约 250 克）被植入带有细 FlexComb 连接器的软袖带，而另外 2 只则被植入从 CorTec 购买的对照固定直径袖带 (Micro Cuff Tunnel CorTec GmbH ø =1.2毫米）。软袖口和控制袖口都用硅胶（RTV 734，Dow Corning）粘合到 3D 打印的后塞基座（Grey Resin，FormLabs）上。所有手术过程均在无菌条件下进行。电极和基座的植入方式与之前的工作类似（Wurth 等人，2017）。分别在大腿中部和下腰部区域（L3-L5水平）制作两个2cm的纵向切口。植入后肢从一只动物到另一只动物的左右交替。在大腿和背部开口之间形成皮下口袋。植入前，袖带和基座均经过紫外线臭氧消毒 10 分钟。3D 打印的基座穿过口袋下方，并通过 4 条缝线固定在背部肌肉的筋膜上。然后将袖带插入并锁定在坐骨神经的远端位置，如前所述。连接器和电线位于应力释放环中，以最大限度地减少腿部运动过程中植入物的拉力。然后缝合并闭合切口部位周围的皮肤。对照大鼠在对侧后肢接受额外的假手术（大腿中部皮肤切口、进入坐骨神经、皮肤缝合）。手术后，将大鼠转移到标准笼子中，随意进食和饮水，并在温度和光控制的环境中恢复。实验结束时，通过过量的戊巴比妥（Esconarkon，Streuli）处死植入袖带的大鼠。

大鼠坐骨神经刺激、肌电图记录与分析
电生理学测量在法拉第笼中进行。使用多通道系统刺激器 (STG4004) 执行刺激方案。双相、电荷平衡、阴极优先电流脉冲，持续时间为 100 μs，脉冲幅度在 2 Hz 下在 0 到 300 μA（步长为 20 μA）之间（每个电流幅度重复 10 次），以双极配置发送到活性位点。EMG 信号的记录通过增益为 1000 的差分交流放大器 (AM-Systems 1700) 和 300 至 5000 Hz 之间的带通滤波器进行，然后通过 Hum Bug 噪声消除器（50 Hz 降噪）进行降噪。数据连续通过 ADC（PowerLab、AD INSTRUMENTS）获取，并在 Matlab 2019b 中离线处理。在每次实验中记录两块肌肉的最大反应，并用于标准化所有肌电图信号。确定了可以实现不同且选择性肌肉激活的电流幅度窗口。具体来说，通过计算选择性指数（SI）来确定两块肌肉中每一个的选择性。这之前被定义为目标肌肉 i 的归一化复合肌肉动作电位 (CMAP) 与 TA 和 GM 肌肉中引起的归一化 CMAP 之和之间的比率（Badia 等，2017）。

猪袖带和肌电图植入
动物研究方案（编号 278/2021-PR）经意大利卫生部批准，符合意大利法律（D.lgs. 26/2014）。植入的进行与之前的工作类似（Strauss et al. 2020）。简而言之，本研究包括一头雄性农场猪（体重 30 公斤）（3-4 个月大）。给猪预先注射了Zoletil。(10 mg/kg)，使用丙泊酚麻醉，并在富含 50% 氧气的空气中维持在 1-2% 异氟醚下。然后将猪置于横向位置，通过解剖并去除膝盖和脚踝之间覆盖的皮肤来暴露目标肌肉。将 7 个双极肌内注射针 (Spesmedica) 植入 7 块肌肉，通过钩形电极进行表面刺激来识别：腓肠肌 (GM)、比目鱼肌 (SOL)、第五伸指肌 (EXT-D5)、伸指长肌 (EXT-DL) )、腓骨三肌 (PT)、腓骨长肌 (PL)、胫骨前肌 (TA)。由于植入不良和信号干扰过多，PT 肌肉被排除。通过在左后肢髌骨和尾部起点之间切开 17 厘米长的切口，进入右侧坐骨神经。插入并打开胸骨扩张器以接触股二头肌和臀浅肌。去除结缔组织以接近坐骨神经及其分叉。使用两条松紧带来抬高神经。软袖带首先锁定在坐骨上，然后锁定在分支胫神经上。

猪神经刺激、肌电图记录和分析
对神经周围的 8 对电极进行双极刺激。IZ2 刺激器 (Tucker-Davis Technologies) 生成 10–400 μA（步长为 10 μA）、脉冲持续时间为 300 μs 的双相阴极优先脉冲，并通过定制 PCB 传输到选定的袖带电极对。使用 PZ5 NeuroDigitizer 放大器（Tucker-Davis Technologies）采集 EMG 信号。信号在 10–250 Hz 下被放大 (× 1000) 和带通滤波，并在 50 Hz 下附加带阻。数据处理在Matlab 2019b中进行。考虑到所有会话（坐骨和胫骨刺激），获得每块肌肉的最大 EMG 振幅，同时如上所述计算归一化振幅和选择性指数，在这种情况下 EMG 阈值设置为 0.4，与之前的工作类似（Strauss 等人，2017）。2020）。

结果
微加工、可拉伸且适应性强的软袖口
所提出的软袖带电极的设计允许轻松植入并适应不同的神经尺寸，这些尺寸可以在针对特定神经或动物物种时发现（图1A）。带状袖带（图1 B）基于所谓的“e-dura”技术（Minev 等人，2015a；Schiavone 等人，2020；Fallegger 等人，2021）：它由 PDMS 子状态组成封装层（总厚度为 150 μm，用于直径 < 1.5 mm 的小神经，对于较大神经，总厚度为 200 μm）、可拉伸微裂纹金轨以及电极部位弹性体基质内铂颗粒的混合物，提高机械和电化学性能（Minev 等人，2017）2015b）。微裂纹结构允许薄金属化层通过面外变形进行拉伸，同时保持确保导电性的渗透路径（Lacour et al. 2006）。先前关于所选技术的报告（Schiavone 等人，2020 年；Fallegger 等人，2021 年））强调了基于晶圆的工艺的易于定制性以及高产量和可重复性，因此使其成为制造不同类型神经和电极配置的植入物的最佳选择。此外，由于应变对器件功能的影响极小，所选技术可被认为适合高动态神经系统中的应用，正如之前的工作中所报告的那样（施加 45% 应变时，1 kHz 时阻抗增加 2 倍）（Minev等人，2015a）。通过使用定制的柔性印刷电路板 (PCB)（以下称为“FlexComb”）（Fallegger 等人，2023 年）或微制造的基于聚酰亚胺的等效系统（补充材料），可以实现与外部刺激设备的电气连接和方法），它通过电极部位使用的相同 Pt-PDMS 涂层连接到金轨道。袖带还包括一个可调节的紧固件，该紧固件被设计成借助连接在带子末端的缝线穿过两个狭缝。该设计允许快速、简单的锁定机制（图1D)，不需要额外的固定辅助工具，如缝合线或胶水，仅依赖于硅胶的粗糙度和疏水性：通过带和狭缝之间的 PDMS-PDMS 接触以及 PDMS-RTV 接触来保证闭合皮带和连接器密封剂。此外，低杨氏模量（~ 1 MPa）和减小的厚度允许同一袖带设计与多个神经尺寸进行保形接触，这对于具有高种间和种内神经变异的临床和动物神经模型来说是一个重要特征（图1 C(i))。基材选择的另一个好处是其对小半径的顺应性，这不仅可以与小神经紧密接触，而且可以确保在弯曲过程中保持接触（图 1 C (ii)）。

神经覆盖和压迫
软套囊可设计成适应不同尺寸的神经，最终可达到的最小直径由不能通过狭缝的扩大的 PDMS 宽度区域的存在来确定。设计用于锁定最小直径 3 毫米的袖带在 PAAm 幻神经（3-4-5 毫米）上进行了测试，并与商业袖带进行了比较，商业袖带通常有一系列离散的圆形尺寸。所选直径被认为适合匹配所报告的人类颈迷走神经的变异性，标称平均值为 4 毫米（Hammer 等人，2015 年）。数字显微镜图像的量化（图2A) 突出显示了与标称值相比，在神经较小或较大的情况下软套囊的完整周边覆盖（超过 90%），表明在神经尺寸变化的情况下也接近完全的电极-组织接触。相反，固定直径的袖口并不能确保完全覆盖。使用5 mm 幻像神经 X 和 Y 方向的 DIC 应变量化（图2 B）来评估压迫，已知压迫会导致血流阻塞，从而导致神经变性和轴突脱髓鞘（Powell 和 Myers 1986；措科和杜兰德2000）。据报道，当压缩应变高于 0.13 时，坐骨神经的局部血液灌注会减少（Ju et al. 2006）。使用的 PAAm 产生弹性模量为 1.65 kPa 的幻神经，这在报道的神经机械性能范围内（Paggi 等人，2021）。当使用软袖带时，没有发现神经模型横截面的区域高于临界应变阈值，这表明植入时神经损伤有限，而固定直径袖带会导致可见的压痕和局部应变高达 0.3 的区域。

图2
图2
幻神经的袖带接触、压缩和稳定性。软袖带和固定直径袖带的神经周边接触比较 （示意图如左图所示）。3 mm 和 5 mm 幻像神经横截面上的软套囊接触的量化表明完全覆盖，无论神经大小如何（上图）。固定袖口不能确保完全接触（暴露区域为红色）。白色箭头表示可见的压缩凹痕（底部）。B 包裹直径约 5 毫米水凝胶神经的软袖带与固定袖带的 DIC 应变量化。使用软袖带看不到临界压缩应变区域。C 机械袖带拉动测试的实验设置（插图）和代表性的力-位移曲线，其中突出显示了袖带脱位之前达到的最大力。D 软袖带位移的最大极限力 ( n  = 4) 表明稳定性与神经尺寸无关，这与固定直径袖带 ( n  = 4) 不同。统计：双样本 t 检验，* p  < 0.05，** p  < 0.01，ns p  > 0.1

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锁定稳定性
除了潜在的神经损伤之外，袖带尺寸不当可能不利于锁定稳定性，导线迁移是周围神经刺激系统故障的主要原因（Eldabe 等，2015），而袖带在目标组织上“滑动”会导致 FBR 加剧（Carnicer） -Lombarte 等人，2021）。为了评估软套囊的稳定性及其对不同神经尺寸的适应性，进行了模拟系留力对连接器影响的拉力测试。夹住直径为 3-4-5 mm 的 PAAm 神经，对连接器施加拉力，记录袖带移位前的最大力（图2 ）C）。软袖带和商业袖带表现出不同的行为，软袖带脱位力在所有神经配置中都是相等的（图2D）。相反，固定直径的袖带在连接 3 毫米体模时无法紧密锁定，并导致 5 毫米神经本身完全断裂，这表明当尺寸不佳与较大的束缚力相结合时，可能会发生神经受压的高风险如果应力消除环未正确实施。

电化学表征
通过进行电化学测试进一步监测适形性和紧密的电极接触。通过 EIS 和 VT 对不同几何结构的软袖口进行了表征。为猪坐骨神经设计的 16 个部位（A = 0.8 mm × 0.25 mm）的软袖带首先在 PBS 平板上进行测试，然后将其锁定在 4 mm 的 PBS-琼脂糖神经周围，然后再次进行平板测试。接下来，将其植入（锁定）在直径约为4.5毫米的猪坐骨神经体内。最后，手术后在 PBS 中以解锁配置对袖带进行测试。EIS 谱（图3A）强调 3 种体外配置中的弯曲没有明显影响，由于电极-组织界面的影响，体内出现了预期的幅度和相移。1 kHz 时（图3B) 幅度增加 3 倍可归因于组织，据报道手术后 16 个电极植入的影响极小。通过使 100 μA 的对称双相脉冲流过电极，同时记录电压降来进行额外的电化学表征。不同配置和设计的结果与 EIS 测量结果一致，体内最小电压绝对值有类似的增加（图3 ）光盘）。前 3 个体外配置中电压幅度没有观察到的增加表明轨迹电阻似乎不受不同折叠条件的影响，而术中测量的净增加归因于电极的影响组织界面。手术后残余电压增加可能是由于电极部位的组织/血液残留造成的。

图3
图3
16 通道软袖口的电化学表征。A 阻抗谱表示为平均值±标准差。dev ( n  = 16) 每十年一次，在 5 个测试配置中。B 在相同测试条件下提取的 1 kHz 阻抗。C 在 5 种不同条件下在 16 个电极（用 100 μA 双相脉冲刺激）上测量的平均电压。D  16 通道软刺激期间提取的最小电压 误差条（A、B 和 D）和阴影区域 (C) 代表标准偏差

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在设定的刺激电流下，所有情况下的最小电压测量值均低于 4 V，其中大部分电压降是由于微裂纹金轨造成的电阻性电压降。由于植入式脉冲发生器（IPG）通常具有 12 V 的电压顺应性（Zhang 2022），因此电极可用于高达 300–400 μA 的电流（电极位置：0.8 × 0.25 mm 2）。因此，在接下来的实验中，根据瞬态电压测量值以及 Pt-PDMS 复合电极的电荷注入能力和电荷存储能力的已知值（ ∼ 60 μC/cm 2和∼ 50）设置电流限制，以确保安全有效的刺激。分别为mC/cm 2 (Minev et al.2015b）。

选择性刺激大鼠坐骨神经
软套囊的首次体内验证是使用大鼠坐骨神经模型进行的，该模型长期以来被认为是最适合研究周围神经损伤和再生的模型之一，因为它在临床前研究中的可用性及其操作相对容易（An et al. 2022）。沿大鼠坐骨神经的 2 个位置对袖带进行了急性测试（n = 5)，近端和远端。在远端位置，电极触点位于距神经分支点 3 mm 处，而近端位置平均选择在沿神经、距分支点 6 mm 的距离处。大鼠坐骨神经的体内定量强调了近端和远端神经直径之间已知的解剖学差异，前者测量为 0.95 ± 0.19 mm，后者为 1.28 ± 0.18 mm (n = 5)，软套囊无缝适应两种植入站点（图4A）。对袖带施加不断增加的电流 (0–300 μA)，以引起 TA 和 GM 肌肉中 EMG 反应的增加（图4 ）B），分别由神经的腓骨和胫骨分支支配。对于每个实验会话，记录最大响应并用于标准化 EMG 响应并计算选择性指数（选择性阈值：SI > 0.6，EMG > 30%）和当前窗口（图4 ）CD)，如上一节所述。具体来说，在每个疗程中，神经周界周围的 3 个双极配置中的 6 个电极位点 (ø = 250 μm) 被激活，选择性计算证实了软袖带从某些电极位点和配置引发独立肌肉反应的能力。由于大鼠坐骨神经由支配不同肌肉的 2 个主要束（腓骨和胫骨）组成，因此 3 个双极位点被认为足以确保不同分支的激活，无论一个实验到另一个实验的电极定位如何变化。代表会议（图4E) 强调了使用近端位置的电极对 E3-E4 对 TA 肌肉实现的选择性，而所有其他配置主要激活 GM。在所有疗程中都观察到类似的结果，使用不同的电极对和袖带位置实现两块肌肉的独立激活。对不同神经位置的平均选择性电流窗口大小的评估强调了远端刺激时对 GM 肌肉的选择性增强（图4 ）F）。这可能是由于与腓骨束相比，远端胫骨束（支配 GM）尺寸较大且结构明确。相反，在近端位置，束状组织不清晰可见，因此可以证明肌肉激活的相似性。此外，还评估了刺激特性，激活阈值始终通过 40-100 μA 范围内的施加电流来确定，与位置无关，并且 EMG 平台达到 100 至 200 μA 之间（补充材料，图 S 3 ）。

图4
图4
急性大鼠坐骨神经刺激选择性。 在远端和近端神经位置进行的坐骨神经刺激实验方案的示意图，突出显示了不同位置之间的解剖学差异（上）。照片（底部）：软套囊锁定在大鼠坐骨神经远端（左）和近端（右）周围，并测量了神经位置的平均尺寸。B  TA 和 GM 肌肉 EMG 信号的代表性募集曲线，电流从 0 μA 增加到 300 μA。C 作为电流幅度函数的归一化 EMG 响应。选择性窗口指示优先激活一块肌肉的电流。D 选择性指数作为肌电图响应的函数。虚线表示 30% EMG 响应和 0.6 SI 阈值。E 用于双极刺激的具有 6 个通道的软袖带以及所实现的相应选择性的示意图。虚线表示 EMG 响应和 SI 阈值。F 每块肌肉远端近端位置的平均选择性电流窗口，误差线表示标准偏差。* p  < 0.01，双样本 t 检验（n  = 5 只大鼠）。BCD 中的所有数据均指大鼠 1、E2-E5、远端位置

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慢性袖带植入的异物反应
在一项试点研究中，大鼠被植入非功能性被动软袖带 ( n  = 2) 或固定直径的对照商业袖带 (n = 2)，以评估植入 6 周后对坐骨神经的影响。此外，对照大鼠对对侧爪子进行了假手术。不同的植入组可以通过宏观形态变化来识别。主要是，6周后观察到软袖带大鼠和商业植入大鼠的束外（神经外）组织增厚（图5A），但软袖带测量到的增加明显较小（图5C）。表明神经损伤和压迫减少。同样，束外空间血管化的增加（图5 ）观察到 D），与整体组织增加相关，而神经内血管密度似乎没有变化。事实上，束外空间纤维化组织的形成通常伴随着新血管的形成，以支持组织的生长和代谢需求（Carnicer-Lombarte et al. 2021）。直观上，需要更多数量的血管来支持更大面积的新形成组织 接下来，评估 MBP 和 Tuj1 标记的切片以量化轴突密度和髓鞘化程度的变化（图 5 B），这是典型的标志由于植入 PNI 和神经压迫而导致 FBR 的降低（Gupta 2004；Carnicer-Lombarte 等人2021）。两个主要的坐骨神经束（腓骨神经束和胫骨神经束）被用作量化的感兴趣区域（ROI）。有趣的是，在整个神经水平上没有观察到对髓鞘形成的影响，而在单独的腓骨和胫骨区域可以观察到不同的影响（图5E）。具体来说，袖带植入导致腓骨束中的髓鞘形成显着减少，而它似乎对胫骨区域没有影响，如果不是与某一特定神经相关的软袖带的情况略有增加的话。在轴突密度的情况下观察到类似的、不显着的趋势，通过 Tuj1 的分析进行量化（补充材料，图 S 4A）。髓鞘形成和纤维密度的减少是预期的，但是不同 ROI 中的不同观察结果可能表明植入程序和袖带位置的副作用。事实上，所有四个袖带均沿坐骨神经远端植入，袖带具有相同的内侧-外侧方向。特别是，所有装置都锁定在内侧，对应于胫骨束的位置（补充材料，图 S 4 B-C）。如图2所示A，锁定侧是导致神经部分覆盖的一侧，而外侧/腓侧应始终保持覆盖。此外，所有连接器和电线均在内侧螺纹，因此任何电缆拉力都会导致另一侧更加紧固。此外，根据 H&E 量化，四分之三的神经在腓侧表现出更明显的组织生长，这可以支持与植入方向相关的局部损伤以及由连接器位置和设计引起的破坏性机械力的假设（Larson 和孟）2020）。

图5
图5
植入6周后异物反应。用于假手术的 H&E切片 （左）、软袖带（中）和固定袖带（右）。B 相同植入组的 MBP、Tuj1 和 DAPI 染色，对应腓骨 (P) 和胫骨 (T) 区域进行说明。C 束外组织占据的总神经面积的比例。D 不同组的血管计数，突出显示束外区域血管化的增加。E 胫骨和腓骨区域髓磷脂密度的量化。统计数据：Wilcoxon 秩和检验 * 调整p  < 0.05，使用 Bonferroni 校正进行多重比较

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猪坐骨神经的选择性刺激
软袖口设计经过缩放和调整，可用于更多临床相关模型。具体来说，选择猪坐骨神经是因为它在大小和复杂的束状组织方面与人类神经相似（Server et al. 2018），以更好地评估实现束状选择性的可能性。将 16 通道软袖带急性植入约 ø = 4.5 mm 的猪坐骨神经上，并从分别由胫骨和腓骨分支支配的 6 块肌肉进行肌电图记录（胫骨：GM 和 SOL，腓骨：EXT-DL/D5） 、PL 和 TA），如图6 A 所示。袖带设计为包括 8 对 0.8 mm × 0.25 mm 电极，以双极配置排列（图6B)，执行高达 400 μA 脉冲幅度的双相双极刺激。完整的电极功能在体外进行了评估并在体内进行了确认，如图3所示。正如预期的那样，不同的电极对引发了不同肌肉的反应，并按神经支配进行分组。可以识别清晰的拓扑组织并推断坐骨神经束结构的重建（图6 ）C）。具体来说，确定了电极激活的三个主要类别：主要激活具有胫骨神经支配的肌肉的位点（E14-E3、E15-E2）、激活具有腓骨神经支配的肌肉的位点（E9-E8、E10-E7、E11-E6）和激活具有腓骨神经支配的肌肉的位点（E9-E8、E10-E7、E11-E6）产生很少或没有反应（E13-E4、E12-E5、E16-E1），我们假设它们位于神经外膜构成的区域周围，神经外膜由结缔组织组成，不含神经纤维。软套囊在坐骨神经周围提供保形贴合，但也可以轻松解锁并植入分支胫神经（ø = 3 mm），同时仍提供最佳接触（补充材料，图 S 5）A）。在这种配置中，需要较低的刺激电流来激活并达到受该分支支配的 GM 和 SOL 肌肉的平台反应（补充材料，图 S 5 B）。当刺激胫神经时，最大反应记录为 230 μA，而坐骨神经刺激的反应则在 310 μA 时引发。在坐骨神经上，6块肌肉中的5块可以被选择性激活（GM、SOL、EXT-D5、EXT-DL），覆盖胫骨和腓骨肌群，并且8个电极配置中的5个提供了​​选择性刺激（补充材料，图S 5C）。精细运动，例如手指伸展（E11-E6位点），可以在不引起重叠的大后肢运动的情况下实现。另一方面，胫神经植入呈现出更多数量的非选择性和无反应部位。在某种程度上，这是可以预料的，因为当袖带被锁定在小于标称神经直径时，最后 2 个电极对（E16-E1、E15-E2）在退出带环时预计不会接触。EXT-DL 肌肉的激活是意料之外的，因为该肌肉通常被报道为主要由腓骨分支支配（Strauss et al. 2020），但是不能排除从胫骨分支开始对该肌肉的次要贡献，并且应通过额外的神经映射和肌电图测试进一步探索。

图6
图6
选择性刺激猪坐骨神经。 坐骨神经刺激和肌电图记录实验方案的图示。B ) 袖带电极部位的示意图。C 位于坐骨神经周围的每个电极对的标准化肌电图响应。神经卡通片强调了坐骨神经内胫骨（左）和腓骨区域（右）的存在

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讨论
这项工作介绍了一种多通道、柔软且多功能的袖带，通过其设计解决了适应性、稳定性、神经压迫和生物整合等被忽视的问题。薄的 PDMS 基板和带状锁定机构的易贴合性保证了神经接口的适应性，这使得它适用于大鼠坐骨神经刺激的所有实验过程中遇到的所有神经形状和直径，这一特点固定直径系统不可能实现。该设备还代表了柔软且可拉伸的多通道袖带的首批演示之一，该袖带是通过软材料微加工和包装的进步实现的，具有 6 至 16 通道的小型和大型动物模型设计，与临床上使用的简单 2 电极配置相比，显着增加。通过不同神经位置的刺激实验证明了袖带定位的基本作用，这强调了寻找并保持最佳位置以实现选择性的重要性，由多通道设置保证，并最终确保在临床应用中获得更好的治疗结果。通常，无论设计如何，由于疤痕组织的形成，神经接口的稳定性都会获得，从而将装置锁定到位。理想情况下，该设备应该是稳定的，不需要额外的疤痕作为屏障，使电极与目标组织远离并导致刺激阈值随着时间的推移而增加。所提出的袖带旨在通过关注锁定机构的重要性来克服这个问题，并通过使用软材料和袖带本身和连接器的小形状因数来减少疤痕。事实上，袖带电极由 150 至 200 μm 厚的 PDMS 制成，弹性模量为～1 MPa，该值确保了手术操作的简便性，同时也减少了神经损伤。一项为期 6 周的初步植入研究强调，与商用固定直径装置相比，使用所提出的软套囊有减少神经疤痕和脱髓鞘的潜力。结果应通过在不同时间点进行更大规模的研究来证实，分析巨噬细胞和成纤维细胞等其他标记物，以更好地评估 FBR 及其进化。此外，袖带定位和锁定对髓磷脂和轴突损伤的假设影响应通过测试不同的锁定方向来证实。进一步的工作还应该解决袖带的长期功能问题。

之前使用相同技术的工作（Schiavone 等人，2020）通过监测随时间变化的阻抗和电压瞬变，强调了在非人类灵长类脊髓颈硬膜外腔植入 6 周期间植入物的稳定性。此外，在 20% 施加应变下的长期循环实验表明，1 M 循环后对电极阻抗大小的影响极小（增加 2 倍）（Minev 等人，2015a）。

这种稳定性对于 PNS 中的应用也是有希望的，但由于神经和脊髓之间的动力学不同，以及不同的设备设计和电极配置，预计与之前的工作会有一些偏差。

柔软且可拉伸的袖带已成功转化为大型动物模型，并应用于猪坐骨神经刺激，证明了该设计的可扩展性和转化潜力。16 通道袖带对多达 5 块肌肉表现出选择性，超过了之前神经内和可拉伸多通道袖带的性能（Strauss 等人，2020 年；Lienemann 等人，2023 年）。虽然使用 16 个电极的 8 个双极排列已被证明是有前景的，但可以通过测试不同的电极配置和刺激方案来实现进一步的改进，并通过使用 FEA 建模进行优化。作为起点，与之前的工作类似（Lienemann 等人，2023），8 个刺激位点被认为足以获得猪后肢主要肌肉群的明显激活。此外，活动站点的数量也受到所选互连技术的限制。在使用微裂纹金技术的配置中，互连的最小宽度限制为 150 μm。因此，由于轨道设计为沿着中央狭缝的侧面行进，袖带的总宽度很快就会变得很大，特别是在处理小动物模型时。使用另一种可拉伸互连技术，例如基于剪纸的方法，允许轨道宽度降至 30 μm（Vachicouras 等人，2019 年）），将有助于最大限度地减少袖带总占地面积，同时保持高密度的电极位置。最后，还应解决袖带与生长或肿胀组织的稳定性和适形性问题，类似于之前对生长神经的研究（Liu et al. 2020）。神经尺寸的增加在发育和生长过程中显着（在刘的研究中为 140%），并且软袖带设计无法适应。然而，后者可能适合在成年动物和患者出现病理性肿胀（神经病变，例如腕管综合症）的情况下确保接触和功能。在这些条件下，横截面膨胀可能会在 30% 到 50% 之间变化 (Seok 2022），对应于 15-25% 范围内的线性应变，预计可拉伸技术可以耐受，并且最小化对神经的压缩。如果合适，袖带设计的应用范围可以扩展到其他管状和扩张组织，例如肠道。

结论
在这项工作中，我们开发了一种用于选择性神经刺激的软袖带电极。可拉伸硅基系统的带状结构使得即使在弯曲过程中也能轻松、舒适地植入相关神经形状和尺寸。袖带可设计为与选定的直径范围无缝连接，同时始终确保接近完整的神经周边覆盖。同时，即使当神经大于标称袖带直径时，也可以将袖带锁定到位，而不会对神经施加严重的压迫。这种适应性还确保了无论神经大小如何，其定位稳定性在设计范围内保持不变。电化学表征进一步证实了紧密电极神经接触的实现，袖带性能在体外不同折叠条件下保持稳定，而术中和术后测量证实了该装置在整个急性实验中的功能。由于采用多通道配置，袖带既适应较小的近端位置，又适应较大的远端位置，在对大鼠进行的所有实验中都可以实现坐骨神经支配的肌肉的单独激活。在猪身上，我们实现了 6 块测试肌肉中 5 块的选择性激活。最后，初步的生物相容性研究表明，与对照固定直径袖带相比，神经组织生长减少，脱髓鞘程度最小，凸显了在长期植入中使用柔软且顺应性材料的重要性。