介绍
胃肠道缺血/再灌注（I/R）损伤与失血性休克、胃溃疡出血、微血管功能障碍和胃肠道疾病患者的高发病率和死亡率有关。由于氧化应激，缺血再灌注导致胃损伤1。

内皮损伤增加通透性和细胞水肿，损害血流调节，缺血再灌注 (I/R) 后组织中出现溶解2。胃I/R导致胃粘膜严重损伤3,4。

在I/R损伤产生的急性胃病变的病理学中，自由基、脂质过氧化和中性粒细胞浸润发挥着重要作用。活性氧 (ROS) 水平升高会促进细胞膜完整性的破坏，导致溃疡发展5。ROS的过度形成、中性粒细胞对内皮细胞的粘附、促炎介质的合成和释放以及胃酸输出的变化都是I/R诱导的胃粘膜损伤的病理生理学因素。这些事件会导致细胞损伤，并增加血管通透性、组织坏死和器官衰竭6。

自由基清除剂或抗氧化剂可以帮助保护胃组织免受自由基损伤7。Hesperidin [(2 S )-3΄,5-DiHydroxy-4ʹ-methoxy-7-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyloxy]flavan-4-one]，一种强效抗氧化剂黄烷酮柑橘类水果外皮中发现的糖苷，具有与维生素 E 类似的抗氧化特性8。文献报道橙皮甙可以消除自由基9。体外和体内研究表明，橙皮苷除了具有抗氧化作用外，还具有抗菌、抗病毒、抗高血压、降血脂、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎和抗肝毒性作用10,11。由于目前尚未发表橙皮苷对胃I/R损伤模型的保护作用的研究，本研究的目的是探讨橙皮苷对实验性胃I/R损伤模型的保护作用及其作用机制。

方法
本实验研究是在获得动物实验当地伦理委员会批准后在土耳其屈塔希亚健康科学大学实验动物中心进行的（决定号：2014.08.08）。大鼠购自屈塔希亚健康科学大学实验动物中心。所有实验均按照生命科学研究委员会实验动物资源研究所出版的《实验动物护理和使用指南》进行12。

材料
橙皮苷（Hesperetin 7-rhamnoglucoside; Cirantin; Hesperetin-7-rutinoside, C 28 H 34 O 15 , MW: 610.56, 纯度 ≥ 95%, CAS Number: 520-26-3）购自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.（美利坚合众国加利福尼亚州圣克鲁斯）。将该化合物溶解在含有0.5％Tween-80的盐水溶液中。橙皮苷以100mg/kg的剂量腹膜内(ip)施用。手术前 60 分钟进行给药。根据之前的实验，橙皮苷剂量是优选的13。

动物模型
使用体重250至300g的成年雄性Sprague Dawley大鼠。在开始工作前一周将大鼠带到实验室，以确保遵守用药规定。实验期间给它们喂颗粒饲料并喝水。所有动物均在黑暗中饲养 12 小时，在光照下饲养 12 小时，并在最佳室温下饲养。它们被分成五个一组，放入五个透明的聚碳酸酯笼子中。将大鼠随机分为 5 组（每组 10 只）如下：

第1组：对照组（C），胃被切除，没有任何手术治疗方案和I/R；

第2组：假手术组(S)，其中对大鼠进行相同的手术程序，但没有I/R。剖腹手术前几分钟给予1mL生理盐水；

第3组：胃缺血损伤(I)组；

第4组：胃缺血/再灌注损伤（I/R）组；

第5组：橙皮苷+I/R(H+I/R)组，手术前60分钟给大鼠腹腔注射100mg/kg橙皮苷。

组织匀浆的制备
对于生化分析，将组织样品与冷工作溶液（50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.40）混合，并用机械均质器（Analytik Jena speedmill plus，耶拿，德国）均质化。然后将混合物在 4°C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟，并将上清液保存在冰上用于生化分析。

外科手术
对动物进行称重，然后通过腹膜内注射 70 mg/kg 氯胺酮（Ketalar；Pfizer，伊斯坦布尔，土耳其）和 10 mg/kg 盐酸赛拉嗪（Rompun；Bayer，伊斯坦布尔，土耳其）进行麻醉。手术过程中，通过恒温解剖台将体温维持在37℃。I/R损伤模型如前所述进行14。切开手术切口部位后进行手术，并用聚维酮碘清洁皮肤。实验动物在麻醉下通过前腹壁前内侧切口进行剖腹手术。用无损伤血管夹(Vascu Stop，Bulldog Clamp)夹住腹腔动脉45分钟。通过无脉搏或胃颜色苍白来评估缺血。缺血后，移除夹子，并进行 60 分钟的再灌注。心跳的开始和红色的恢复被认为是胃再灌注的迹象。

实验室分析
样品采集
再灌注60分钟后，实验终止。在麻醉下处死动物，并小心切除胃。用冷肝素盐水溶液冲洗胃组织样本以去除任何红细胞或凝块。部分胃样本用 10% 缓冲福尔马林固定，用于组织病理学和免疫组织化学分析。将另一部分胃组织样品放入Eppendorf管中并立即保存在-80°C直至生化分析。

组织匀浆的制备
对于生化分析，将组织样品与冷工作溶液（50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.40）混合，并用机械均质器（Analytik Jena speedmill plus，耶拿，德国）均质化。然后将混合物在 4°C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟，并将上清液保存在冰上用于生化分析。

测量组织总抗氧化状态、总氧化状态和总硫醇水平
使用商业试剂（Rel Assay Diagnostic）在 Beckman Coulter AU680 分析仪（Beckman Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国）上测量组织总抗氧化状态（TAS）、总氧化状态（TOS）和总硫醇（TT）水平，加济安泰普，土耳其）基于 Erel 开发的新型自动化测量方法15–17 号。TAS 水平表示为 mmol Trolox Eq/mg 蛋白质。TOS 水平表示为 mmol Trolox Eq/mg 蛋白质。TOS水平表示为μmol H 2 O 2 Eq/mg蛋白质。TT水平表示为μmol/mg蛋白质。

氧化应激指数的计算
TOS与TAS的百分比被认为是氧化应激指数（OSI），是氧化应激程度的指标。为了计算 OSI，将 TAS 的单位（每毫克蛋白质的 mmol Trolox 当量）转换为每毫克蛋白质的 mol Trolox 当量，方程：118被使用：

(1)
组织超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定
使用 Ransod 试剂盒（Randox Laboratories Ltd.，Crumlin，英国）在 Beckman Coulter AU680 分析仪（Beckman Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国）上测量组织超氧化物歧化酶（SOD）活性。SOD活性以U/mg蛋白质表示。使用Ransel试剂盒（Randox Laboratories Ltd.，Crumlin，英国）在Beckman Coulter AU680分析仪（Beckman Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国）上测量组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性。GSH-PX 活性表示为 U/mg 蛋白。

组织丙二醛 (MDA) 水平的测量
基于硫代巴比妥酸反应物质方法，使用商业酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒（Cayman Inc.，安娜堡，密歇根州，美国）在酶标仪（BMG Labtech Spectrostar）上测量组织丙二醛（MDA）水平Nano，GmbH，奥滕贝格，德国）。MDA 水平表示为μM/mg 蛋白质。

组织蛋白水平的测量
根据Bradford方法在Beckman Coulter AU680分析仪（Beckman Coulter，迈阿密，佛罗里达州，美国）上测量组织蛋白水平19。

组织病理学检查
将胃粘膜样本固定在10%甲醛溶液中，石蜡包埋，制备4微米厚的切片。在脱蜡和分级水化后对切片进行苏木精-伊红 (H&E) 染色，并由对研究组不知情的病理学家在光学显微镜（奥林巴斯 BX41；日本东京）下进行研究。张等人使用的量表。用于评估 H&E 染色切片20。粘膜上皮根据损伤情况（包括点糜烂、溃疡、点出血）分为0～3级：

0：无溃疡、无糜烂；

1：长度≤1毫米的侵蚀；

2： > 1 毫米且 ≤ 2 毫米长的侵蚀；

3：> 2 毫米且 ≤ 3 毫米长的侵蚀。

如果病变宽度 > 1 mm，则将刻度折叠为 2。高碘酸-希夫 (PAS) 引起的胃上皮肌肉损失分级为 0 至 320,21。

免疫组织化学检查
采用免疫组织化学方法检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和增殖细胞核抗原（PCNA）。根据制造商的说明，使用市售试剂盒（HIF-1α、Santa Cruz sc-10790；PCNA abcam ab18197）进行免疫组织化学染色。将胃组织石蜡化并再水化。制备 4-5 微米厚的切片，用于 PCNA 和 HIF-1α 的免疫组织化学评估。用 0.5% 过氧化氢的甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶活性。应用针对 PCNA 和 HIF-1α 的引物抗体 60 分钟。DAB 可以提高过氧化物酶活性。应用苏木精进行轮廓染色。在 400 倍放大倍数下对阳性反应细胞进行计数。所有组织形态学和免疫组织化学评估均使用 Olympus CX 41 光学显微镜进行。总之，七个随机选择的县被纳入免疫组织化学评估。计算产生阳性反应的细胞的百分比。

细胞凋亡的原位检测
我们使用原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）测定法来测定胃细胞凋亡的程度。对于 TUNEL，使用 Roche 11684817910 染色试剂盒。从石蜡包埋的组织制备的切片用二甲苯脱蜡。然后将其通过95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇和70%乙醇。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤切片5分钟。蛋白酶K在室温下孵育20分钟。用PBS洗涤两次后，将组织在37℃下进行TUNEL 60分钟。在光学显微镜下在 400 倍放大倍数下评估 TUNEL 阳性细胞。计数凋亡细胞22。

统计分析
数据通过 Windows 版社会科学统计软件包 16.0 版（SPSS Co.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行分析。使用夏皮罗-威尔克检验来测试数值数据的正态性。正态分布数据表示为平均值±标准差 (SD)，而非正态分布数据表示为中位数和四分位距 (IQR)。根据数据的分布，使用方差分析（ANOVA）和Kruskal-Wallis检验来测试组间数值变量的比较。利用Levene统计量进行变量方差齐性检验，以选择事后检验。对通过方差同质性检验的变量使用 Bonferroni 多重比较事后检验，对未通过方差同质性检验的变量使用 Dunnett T3 多重比较事后检验来测试检查变量的多重比较。P < 0.05 水平具有统计学显着性。

结果
组织总抗氧化状态、总氧化状态、氧化应激指数和硫醇水平
测定组之间组织 TAS、TOS、OSI 和 TT 水平的差异表示在表格1。TAS、TOS、OSI 和 TT 值在各组之间观察到显着差异（分别为 P < 0.0001、P < 0.0001、P < 0.0001、P < 0.0001）。与对照组和假手术组相比，I/R 导致 TOS 和 OSI 水平显着升高（P < 0.05），TAS 和 TT 水平显着降低（P < 0.05）。与 I/R 组相比，橙皮苷降低了 TOS 和 OSI 水平，升高了 TAS 和 TT 水平（P < 0.05）。

 缩略图
表 1
测定组之间组织 TAS、TOS、OSI、TT、MDA 水平以及组织 SOD 和 GSH-PX 活性的差异。
组织超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性
测定组之间组织 SOD 和 GSH-PX 活性的差异表示在表格1。SOD 和 GSH-PX 活性在各组之间观察到显着差异（分别为 P < 0.0001、P < 0.0001）。I/R组SOD和GSH-PX活性显着低于对照组和假手术组（P < 0.05）。与 I/R 组相比，橙皮苷增加了 SOD 和 GSH-PX 活性 (P < 0.05)。

组织丙二醛水平
测定组之间组织 MDA 水平的差异表示为表格1。各组之间的 MDA 水平存在显着差异 (P < 0.0001)。与对照组和假手术组相比，IR组的MDA水平显着升高（P < 0.05）。与 I/R 组相比，橙皮苷降低了 MDA 水平（P < 0.05）。

组织病理学和免疫组织病理学结果
各测定组之间胃组织样本中评分的组织病理学和免疫组织化学值的比较见表 2 . 在组织病理学检查中，我们的结果表明，与对照组和假手术组相比，I/R损伤导致总组织病理学胃损伤评分显着增加（分别为P < 0.05、P < 0.05）。与I/R组相比，100 mg/kg剂量的橙皮苷显着降低了胃损伤评分（P < 0.05）。

 缩略图
表2
各检测组胃组织样本评分组织病理学和免疫组织化学值的比较。
与对照组和假手术组相比，I/R组观察到明显的表面溃疡（2级）。然而，H + I/R 组（1 级）上皮溃疡有所改善（无花果。1和2）。当使用TUNEL法检测胃组织细胞凋亡时，我们观察到与对照组和假手术组相比，I/R损伤导致细胞凋亡指数显着增加（分别P < 0.05，P < 0.05）。与I/R组相比，100 mg/kg剂量的橙皮苷显着降低了细胞凋亡指数（P < 0.05）（图3）。通过PCNA免疫染色检查橙皮苷对细胞增殖的影响。研究结果表明，与对照组和假手术组相比，I/R损伤导致PCNA阳性细胞数量显着减少（分别为P < 0.05、P < 0.05）。

图1
试验组胃组织的组织病理学检查，苏木精和伊红(H&E)×100。对照组和假手术组含有正常的胃粘膜、上皮。缺血组溃疡表面上皮，2级。缺血/再灌注组，溃疡表面上皮2级。橙皮苷+缺血/再灌注组，上皮溃疡改善，溃疡上皮1级。
图 2
检测组胃组织的组织病理学检查，高碘酸希夫 (PAS) × 100。对照组和假手术组含有正常的胃粘膜和含粘蛋白的上皮。缺血组，上皮2级粘蛋白减少。缺血/再灌注组，上皮中3级粘蛋白减少。橙皮苷+缺血/再灌注组，上皮粘蛋白丢失改善，细胞含有粘蛋白（PAS用红色箭头表示）。
图3
检测组胃组织细胞凋亡情况，末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）×400。从随机选择的视野中计算每100个TUNEL阳性细胞的数量。凋亡指数计算为凋亡（TUNEL 阳性染色）细胞的百分比。对照组和假手术组、TUNEL阳性细胞数较少、缺血组、阳性反应细胞数较多、缺血/再灌注（I/R）组、阳性反应细胞数较多、I/R组TUNEL阳性反应细胞数较多，I/R损伤引起细胞凋亡指数显着升高，橙皮苷+I/R组与TUNEL组相比，与缺血组和I/R组相比，阳性反应细胞数较少。橙皮苷显着降低细胞凋亡指数。TUNEL 阳性染色由红色箭头指示。
然而，与 I/R 组相比，橙皮苷增加了 PCNA 阳性细胞的数量（P < 0.05）（图4）。使用免疫组织化学染色检查 HIF-1α。研究结果表明，与对照组和假手术组相比，缺血再灌注损伤导致 HIF-1α 显着增加（分别为 P < 0.05、P < 0.05）。与 I/R 组相比，橙皮苷预处理减少了 HIF-1α 阳性细胞数量（P < 0.05）（图5）。

图4
实验组胃组织中增殖细胞核抗原（PCNA）表达检测，PCNA×400。对照组和假手术组PCNA弥漫性阳性反应，缺血组，少量细胞PCNA阳性反应，缺血/再灌注组中，少数细胞出现PCNA阳性反应。评估PCNA阳性细胞的百分比。缺血/再灌注损伤导致PCNA阳性细胞数量明显减少，橙皮苷+缺血/再灌注组PCNA阳性反应细胞数量较缺血组和缺血/再灌注组较多。与缺血/再灌注组相比，橙皮苷增加了PCNA阳性细胞的数量。PCNA 由红色箭头指示。
图5
各实验组胃组织缺氧诱导因子1α（HIF-1α）表达检测，HIF-1α×400。对照组有少量阳性细胞，假手术组，少量细胞阳性，缺血组，阳性反应细胞数较多，缺血/再灌注组，阳性反应细胞数较多。与对照组和假手术组相比，缺血/再灌注损伤导致HIF-1α阳性细胞数量显着增加，但橙皮苷减少了HIF-1α阳性细胞数量。HIF-1α 用红色箭头表示。
讨论
胃肠粘膜是对缺血最敏感的组织之一。I/R和脂质过氧化（LPO）后发生的自由基的细胞毒性作用在胃粘膜病变的形成中发挥重要作用23。I/R 的自由基和酸度增加导致胃粘膜糜烂和溃疡。结果，分泌和吸收功能恶化，粘膜坏死。24,25。胃 I/R 是一种复杂的情况，尽管对损害进行了如此多的调查，但可以获得的信息有限26,27。胃内血流减少或切断，以及造成不同程度的组织损伤后发生的再灌注。I/R 模型可以通过实验创建，也可以在许多其他器官中创建。I/R 损伤增加胃粘膜中自由基的形成，导致 LPO。

然而，许多研究表明，抗氧化剂和自由基清除剂通过抑制LPO而具有胃保护作用。许多抗氧化物质在胃I/R损伤的实验模型中具有胃保护作用，这一点最近已被不同的研究证实，尽管还没有橙皮苷这一模型的研究28,29。

组织中氧化剂和抗氧化平衡的退化是由氧化应激引起的。这会对胃粘膜造成严重损伤，并对 I/R 期间的正常功能产生负面影响。氧化应激导致细胞膜中 LPO 产物增加30。我们的结果表明，橙皮苷对胃 I/R 的保护作用的机制可能与其降低 MDA 水平的能力有关。在这项研究中，我们观察到与对照组和假手术组相比，I/R 组的 MDA 水平有所增加。在 I/R 之前施用橙皮苷可通过降低 MDA 水平来提供针对胃 I/R 损伤的保护作用。这些结果与之前的一项研究一致，其中腹腔注射 100 mg/kg 橙皮苷因此，橙皮苷预处理可能通过减少 LPO 来证明对胃 I/R 损伤的保护作用31。

氧自由基 (SOR) 的增加在胃 I/R 损伤的功能障碍中起着重要作用。尽管细胞可以保护自身免受氧化损伤，但抗氧化系统在 I/R 损伤中存在缺陷。生物体内的内源性抗氧化酶如SOD和GPx在减少SOR的有害作用方面发挥着重要作用。然而，在 I/R 模型的研究中，这些酶的水平在再灌注过程中下降。这可能是自由基增加的结果32–34。缺血期间，由于缺血组织中的氧化剂，观察到SOD、GPX等酶的失活加速。在再灌注过程中，细胞更容易受到氧自由基的影响。I/R损伤的改善取决于胃粘膜的自我更新能力35。在这项研究中，我们发现与对照组和假手术组相比，I/R 组的抗氧化酶活性（SOD、GPx）显着降低。此外，我们发现 100 毫克/千克剂量的橙皮苷似乎可以提高抗氧化酶的活性。

我们的结果与之前给予 100 mg/kg 剂量橙皮苷的研究一致32–34,36。橙皮苷对胃I/R损伤的保护作用可能是通过抗氧化防御系统实现的。缺血 45 分钟和再灌注 60 分钟后，我们观察到 I/R 组中 TOS 和 OSI 水平（自由基引起的损伤指标）升高。橙皮苷预处理逆转了所有这些结果。

据报道，橙皮苷在许多不同剂量、给药途径和给药时间的实验模型中都发挥了保护作用。Korthuis 和 Gute 报告称，橙皮苷可大大减少诱导小鼠肠道 I/R 损伤对他们的工作造成的损害37。Dorkina 在急性肝炎研究中通过给豚鼠注射 CCL4 证明了 100 毫克/千克剂量的橙皮苷的保肝作用38。

HIF-1是在缺血中起关键作用的调节因子之一。它由两个亚基α和β组成。α亚基与细胞氧敏感性密切相关。HIF-1α 缺血期间对缺氧的敏感性增加39。在我们的研究中，与对照组和假手术组相比，I/R 组中 HIF-1α 阳性细胞的百分比显着增加。橙皮苷治疗组中HIF-1α阳性细胞的比例低于I/R组。因此，橙皮苷可能通过降低 HIF-1α 蛋白水平来预防胃 I/R 损伤。

Qiao等人的研究中，虽然胃粘膜在缺血时受到轻微影响，但发现出现更严重的损伤，特别是在再灌注的第一个小时内，胃粘膜的自我修复能力极其差。高，并在完全修复的第三天完成。他们认为这是通过抑制胃粘膜细胞凋亡和增加增殖细胞数量来实现的40。

关于胃粘膜凋亡和增殖的研究有限。一些研究得出不同的结果。在胃粘膜中，凋亡细胞和增殖细胞一起指出41。

胃I/R损伤与胃粘膜损伤增加、细胞凋亡和胃粘膜细胞增殖减少相关。在整个细胞周期中，PCNA 在细胞内以不同浓度存在。PCNA 是一种辅助蛋白，在细胞周期的最大 S 期期间分泌。通过组织病理学分析和PCNA免疫染色证实了橙皮苷对细胞增殖的影响42。

100 mg/kg剂量的橙皮苷导致细胞增殖增加。采用TUNEL法测定组织中的凋亡细胞。TUNEL法结果显示，缺血组和I/R组染色阳性细胞数高于对照组，且差异有统计学意义。这些发现与实验 I/R 模型中橙皮苷的保护作用相似。我们研究中用于细胞凋亡的 TUNEL 和用于细胞增殖的 PCNA 与这些结果相似43,44。橙皮苷导致细胞凋亡减少和细胞增殖增加。我们的研究结果表明，氧化应激在胃缺血再灌注损伤中起着重要作用，橙皮苷预处理可能有助于对抗这种损伤。

结论
这项研究表明橙皮苷可能对胃缺血再灌注损伤具有保护作用。橙皮苷预防胃缺血再灌注损伤的保护作用机制与减少脂质过氧化、增加内源性抗氧化酶活性、减少细胞凋亡和增加增殖的能力有关。