介绍
心力衰竭（HF）是一组病因多样、导致心脏结构异常和功能障碍的临床综合征。随着人口老龄化，心力衰竭已成为当代社会高发的“流行病”，给公共卫生系统带来持续的压力。引文1 ]。因此，探讨心力衰竭发生、发展的病理生理机制，并在此基础上阻断病情进展，及时、有效、个体化治疗具有重要意义。然而，心力衰竭的发生过程中涉及到与心功能恶化相关的宏观和微观结构、细胞和分子水平上的复杂机制网络，迄今为止尚未阐明。最近，心外膜脂肪组织（EAT）被越来越多地用于促进这一研究过程。引文2 ]。

EAT是位于房室沟和室间沟的具有代谢活性的内脏脂肪组织。引文3 ]。EAT的积累被认为是与心力衰竭相关的慢性代谢状态的一个显着特征。此外，在过去的临床研究中，我们报道了 EAT 体积与亚临床左心房功能障碍和左心室整体纵向应变受损独立相关，但分子指标尚未阐明。引文3 ]。作为一种活性代谢因子，EAT能够产生多种生物活性分子，包括携带小非编码RNA（sncRNA）的微粒，以旁分泌方式作用于心房心肌。

SncRNA是不能翻译成蛋白质但通过翻译后修饰调节靶基因表达的RNA。最近，发现了一种不同于典型sncRNA的、源自转移RNA（tsRNA）的新型小RNA。引文4 ]。这些tsRNA并不是从转移RNA上随机切下的无功能的小分子片段，而是发挥各种生物活性并动态影响生物体的各种细胞功能。根据切割位置的不同，tsRNA可分为两类[引文5 ]：长度约为14-30 nt的tRNA衍生片段（tRF），可分为四个子类：tRF-1、tRF-3、tRF-5和i-tRF；tRNA 衍生的应激诱导 RNA (tiRNA)，长度为 28-36 nt，是在缺氧、紫外线辐射和氧化应激等应激条件下通过血管生成素特异性裂解产生的。tRF和tiRNA在不同的生物过程中积累并参与多种生物功能，例如癌细胞的生长和转移。引文5 ]、基因和蛋白质的表达[引文6】、病毒的入侵过程【引文7 ]和神经退行性疾病[引文8 ]。然而，文献中尚未说明 tsRNA 在与心力衰竭相关的心外脂肪中的作用。

因此，本研究通过RNA高通量测序评估心衰患者EAT中tsRNA的表达水平，预测靶基因并结合生物信息学评估潜在的信号通路，为发现心衰新的治疗靶点提供充分的理论依据。

材料和方法
患者和组织取样
本研究前瞻性选取2018年4月至2018年8月期间入住北京朝阳医院心脏中心的连续患者。心力衰竭的诊断标准参考2021年ESC急慢性心力衰竭诊断和治疗指南[引文9 ]。排除标准如下：（1）妊娠；(2)甲状腺疾病；(3)严重肾功能障碍，预计肾小球滤过率低于30 ml/min/1.73m 2处于基线；(4) 癌症；（五）严重感染。根据心力衰竭诊断标准，将患者分为急性心力衰竭组和对照组。两组均 4 例患者接受冠状动脉旁路移植术，1 例患者接受心脏瓣膜置换术。本研究方案经首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会批准（2021-ke-246），并已在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR2100045905，www.chictr.org.cn）。所有参与者都提供了知情同意书。EAT样本取自两组患者。详细的过程在我们之前的研究中有描述[引文10 ]。

RNA 提取、文库制备和 tsRNA 测序
使用 miRNAeasy Mini Kit（Qiagen，希尔登，德国）从冷冻 EAT 中提取总 RNA。使用琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 1000 进行质量检查，以确保 RNA 样品的完整性。

tsRNA 的预处理、文库制备和小 RNA 测序如前所述进行[引文11 ]。简而言之，在去除一些可能干扰文库构建的修饰后，将RNA样品连接到3'和5'小RNA接头上，并用Illumina的引物依次扩增以生成cDNA。从 PAGE 凝胶中纯化扩增的 cDNA，并使用 Agilent 2100 生物分析仪进行定量。将制备的文库变性并稀释至装载体积为 1.3 mL、浓度为 1.8 pM，然后装载到试剂盒上并转发到 Illumina NextSeq 500 系统上进行测序。

tsRNA 的鉴定
生成的通过 Illumina 贞操过滤器的原始测序数据用于以下分析。通过比对、读长和片段序列偏差进行比对统计分析后，使用 R 包 edgeR 筛选 tsRNA 的表达谱。对于统计计算和图形，主成分分析（PCA）、相关分析、饼图、维恩图、层次聚类、散点图和火山图是在 R 3.5.1 或 Perl 环境中构建的。

tsRNA 的生物信息学和功能分析
使用 TargetScan 和 miRanda 对所选 tsRNA 和目标 mRNA 之间的关系进行计算预测。为了确定所选 tsRNA 的潜在生物学功能，基于基因本体论 (GO) ( http://www.geneontology.org ) 和京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路分析 ( http://www.geneontology.org) 进行富集分析。进行了基因组.jp/kegg ）。重要的 GO 术语，包括生物过程、细胞成分和分子功能，用p ≤ 0.05表示 。KEGG富集分析表明了定位基因的功能预测，其中较低的P值表明更重要的通路。

实时定量聚合酶链式反应 (qRT–PCR)
使用 miRNAeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）从 EAT 中分离总 RNA，然后使用 rtStar TM First-Strand cDNA Synthesis Kit合成 cDNA 。qRT–PCR 在 ViiA 7 实时 PCR 系统上进行。采用2 −ΔΔCt法计算tsRNA的相对表达量，并以U6作为内参。

统计分析
使用SPSS 24.0（IBM Corp，Armonk，NY）统计软件对临床数据进行统计分析。计量资料符合正态分布的用均数±标准差表示，不符合正态分布的用中位数和四分位距表示。根据组间测量数据是否服从正态分布，采用独立样本t检验或非参数Mann-Whitney U检验进行比较。采用卡方检验或精确概率法对分组计数数据进行分析。使用R包对测序数据进行分析，包括PCA、相关性分析、维恩图、层次聚类和GO/KEGG分析。所有统计分析均通过双边检验进行，并且p  < 0.05 被认为具有统计显着性。

结果
在我们的研究中，我们鉴定了 EAT 中 343 个 tsRNA 的表达谱。其中，总共 24 个 tsRNA 在 HF 和对照之间表达显着差异：17 个上调，7 个下调（倍数变化 > 1.5，p  < 0.05）。随机选择四种 tsRNA（tiRNA-Pro-TGG-001、tRF-Met-CAT-002、tRF-Tyr-GTA-010 和 tRF-Tyr-GTA-011）并通过 qRT-PCR 进行验证。生物信息学分析揭示了 tRF-Tyr-GTA-010 和 tRF-Tyr-GTA-011 之间靶基因的密集相互作用。基于功能分析，这两个tRF可能通过靶向主要负责钙离子转运的基因，通过鞘脂和肾上腺素信号通路发挥调节作用。

tRF 和 tiRNA 概况概述
基线特征和临床参数见表格1。根据所包含样本的相关系数热图，两个比较组相似（图1A）。PCA 是一种无监督统计分析，用于降低大型数据集的维度，并根据 tsRNA 的每百万总对齐读取 (CPM) 值的计数来探索样本类别。如图所示图1B，这些样品呈现出可区分的 tRF 和 tiRNA 光谱。测序后，我们最终确定了 HF 组和对照组之间所有 343 个 tsRNA 的表达谱。维恩图显示总共 177 个常见表达的 tsRNA，其中 29 个 tsRNA 在 HF 样本中特异表达，22 个 tsRNA 在对照中特异表达。此外，284 个检测到的 tsRNA 被描述为新的 tRNA 衍生物，这些衍生物以前从未在 tRF 数据库中注释过（图1(C-D)）。饼图总结了 HF 组和对照组中 tsRNA 亚型的分布（图2），表明大多数 tsRNA 是由成熟 tRNA 生成的。还发现 tRF-5c、tRF-3a 和 tRF-1 是两组中最丰富的亚型。与对照相比，在心功能不全的情况下，tRF-5c和tRF-3a的表达水平降低，而其他亚型的表达水平保持不变或增加。此外，基于堆积条形图（图2），tRF和tiRNA亚型分布来自相同的反密码子tRNA，但是这两组中亚型的长度分布完全不同。

tRF 和 tiRNA 的表达谱
如层次聚类所示（图3A）， EAT 样品中的 tRF 和 tiRNA 表达谱是可区分的。散点图 (图3B）的创建是为了呈现 HF 组和对照组之间的 tsRNA 表达变化，而火山图（图3C）显示了两组之间差异表达 tsRNA 的倍数变化和 P 值。总体而言，我们总共鉴定了 24 个 tsRNA，它们在 HF 和对照之间表达显着差异：17 个上调，7 个下调（倍数变化 > 1.5，p  < 0.05，表2）。

qRT-PCR 验证
为了验证高通量测序数据的可靠性，对 tiRNA-Pro-TGG-001、tRF-Met-CAT-002、tRF-Tyr-GTA-010 和 tRF-Tyr-GTA-011 四种 tsRNA 进行了测序。在更大的队列中选择进行 qRT-PCR（HF 与对照， 每组n = 15）。与非HF组相比，HF组中tiRNA-Pro-TGG-001和tRF-Met-CAT-002显着上调，而tRF-Tyr-GTA-010和tRF-Tyr-GTA-011在HF组中显着下调，表明测序和 PCR 数据中的相似表达模式（图4）。

tsRNA的预测靶基因及功能分析
tsRNA 在与 AF 相关的 EAT 中的生物学作用的机制尚不清楚，但有一些证据表明 tsRNA 可能表现出类似 miRNA 的作用模式。结果，四个候选差异表达的 tsRNA 随后被用于通过 TargetScan 和 miRanda 预测其靶基因。基于 tsRNA/mRNA 相互作用网络，我们确定了与四种经过验证的 tsRNA 相关的各种靶基因（图5A）。具体来说，tRF-Tyr-GTA-010 和 tRF-Tyr-GTA-011 之间存在靶基因的密集相互作用（图5B）。

我们通过 GO 和 KEGG 分析确定了两种下调 tRF 的潜在作用。GO富集分析显示，两个tRF的靶基因主要负责钙离子转运（GO：00006816）和一氧化氮合酶结合（GO：0050998），以及体树突区室的细胞成分（GO：0036477）（图6）。在KEGG通路分析中，确定了14条显着富集的信号通路：候选tRF调节的前三个相关通路是鞘脂信号通路（hsa04071）、心肌细胞中的肾上腺素信号通路（hsa04261）和mRNA监视通路（hsa03015）。图6,表3）。

讨论
迄今为止，与心脏功能恶化相关的宏观和微观结构、细胞和分子水平上的复杂网络尚未明确阐明。鉴于tsRNA在肿瘤发展中不可或缺的作用[引文5 ]、神经退行性变[引文12 ]和代谢功能障碍[引文[13 ]，目前的工作旨在确定心外膜脂肪库中的 tsRNA 是否参与心脏功能受损的病理生理学。因此，对 tsRNA 进行了整合的小 RNA 测序分析，我们的研究结果首次对人类 EAT 中参与 HF 发展的 tsRNA 表达进行了全面评估。在这项研究中，鉴定了 EAT 中 343 个 tsRNA 的表达谱。总共有 24 个 tsRNA 在 HF 组和对照组之间表达存在显着差异，并且 tsRNA 相对于 tRNA 同解码器的亚型数量以及各组之间相对于长度的频率比较是不同的，这意味着这些 tRNA 衍生物可能以未定义的作用参与了 HF 过程。 。

TsRNA 于 20 世纪 70 年代末首次在癌症患者的尿液中被发现。引文14 ]，但直到近年来它们才引起更多关注。随着高通量测序和先进生物信息学技术的出现，这些特定的tsRNA不再被视为tRNA随机裂解的衍生物，而是在不同的生物过程中具有多种生物学功能。TsRNA 可以采取类似 miRNA 的模式，并通过翻译后途径影响 mRNA 稳定性来参与基因表达的调节。引文5 ]。据胃肿瘤报道[引文[15 ]，tRF-3017A与Argonautes结合并下调肿瘤抑制基因的表达，有助于癌细胞迁移和侵袭。此外，据报道，tsRNA 可以作为蛋白质诱饵，竞争性地结合 RNA 结合蛋白，从而影响靶 RNA 的稳定性。引文16 ]。Srikar 及其同事揭示了动态细胞状态转变背景下 5'-tsRNA 的分化依赖性富集：这些特定的 5'-tsRNA 可以优先与 RNA 结合蛋白相互作用，从而影响转录稳定性和随后的多能性翻译。促进因子 c-Myc，从而调节小鼠胚胎干细胞中的干细胞状态。引文17 ]。此外，tsRNA 可以通过调节与生殖细胞发育相关的基因来调节生物表观遗传学。多项证据表明，精子 tRF 促进小鼠特定代谢表型的代际传递。引文13 ]。正如乌帕斯纳（Upasna）所示[引文[18 ]，父亲饮食可以改变整个男性生殖道和成熟精子中 tRNA 片段的水平，并且 tRNA 片段 tRNA-Gly-GCC 抑制内源性逆转录因子驱动的转录物的表达，从而对代谢产生下游影响。总体而言，这些小RNA可以通过多种分子机制发挥多种生物学功能，包括基因和蛋白质表达的调节以及表观遗传修饰。

研究已经确定了这些 tsRNA 在参与最简单到最复杂的生物过程中的作用，包括应对环境应激条件、致瘤细胞的快速增殖、干细胞分化和神经系统疾病的发展。在心血管疾病的背景下，研究表明 tsRNA 是热量限制预处理的潜在治疗靶点，以改善心肌缺血性损伤。引文19]。然而，关于tsRNA在心功能障碍中的生物学作用，之前还没有研究开展相关工作。我们的研究描述了心力衰竭患者心外膜脂肪样本中 tsRNA 表达模式的改变，表明心输出量恶化后 EAT 中的 tsRNA 谱显着改变。由于tsRNA可能具有类似miRNA的生物活性，因此我们预测了候选tsRNA的潜在靶点结合mRNA，并构建了用于生物信息学分析的tsRNA-mRNA交互网络。此外，在GO富集分析中，我们发现tRF-Tyr-GTA-010和tRF-Tyr-GTA-011的靶基因主要集中在钙离子转运的调控上。众所周知，心力衰竭是一种致心律失常状态，心律失常是晚期心力衰竭患者死亡的主要原因。考虑到钙2+重叠可能导致后除极延迟并引发心律失常，Ca 2+浓度的调节至关重要。Philipp 及其同事证明，在扩张型心肌病患者的诱导多能干细胞衍生的心肌细胞中，胞质钙缓冲的增加有助于产生细胞致心律失常底物。引文20 ]。此外，David C. 发现了一种新的肌膜背景 Ca 2+通过TRPC 6 通道流入，导致高频中的肌浆网 Ca 2+过载和 Ca 2+波。引文21 ]。研究还表明，Bcl-2 19 kilodalton 相互作用蛋白 3 通过影响内质网-线粒体钙和离子稳态，有助于射血分数降低的心力衰竭的心肌重塑和进展。引文22 ]。

在KEGG通路分析中，心肌细胞中的鞘脂信号通路和肾上腺素信号通路是受候选tRF-mRNA网络影响的前三大信号通路之一。鞘脂和相关代谢物与细胞存活、衰老和代谢的关系越来越密切。鞘脂代谢的改变被认为与心力衰竭的发病机制有关。引文23 ]，并且越来越多的证据表明，在心力衰竭的情况下，循环系统和心脏组织中的鞘脂神经酰胺水平升高[引文24、引文25 ]。布列塔尼等人。报道称，长链神经酰胺的增加部分通过线粒体功能障碍、氧化应激和线粒体自噬导致脂毒性心肌病。引文26 ]。此外，Linda 及其同事发现，在压力超载的心脏中，鞘脂生物合成限制酶的抑制作用的丧失可能导致心肌细胞中神经酰胺的积累，抑制“保护性自噬”的发生并导致严重的心脏功能障碍。引文27 ]。此外，众所周知，心力衰竭期间，肾上腺素能信号的激活被触发以维持心输出量，并在血管张力的调节中发挥着至关重要的作用。引文28 ]。然而，血浆儿茶酚胺水平升高的长期交感神经刺激会促进心内膜下和间质纤维化、细胞质空泡化和矿化。引文29 ,引文30 ]。因此，β受体阻滞剂是当前心力衰竭治疗的支柱。一般来说，这些 tsRNA 的生物学变化及其与其他因素的共同关联可能对心脏功能的恶化做出反应。

我们的研究应该考虑一些局限性。首先，我们的 tsRNA-mRNA 串扰网络主要基于计算机方法，应在体外和体内进一步鉴定 EAT 中与 HF 相关的 tsRNA 表达。其次，tsRNA 谱应该在大规模研究中再次验证，因为我们目前的测序数据仅分析了 10 名患者，并且相对较小的队列限制了有关候选 tsRNA 作用的进一步有价值的信息。最后，粗略地描述了 tsRNA 的概况，未来的研究重点是 tsRNA 和 mRNA 之间的生物学功能和相互作用。

结论
总之，本研究首次分析了心力衰竭 EAT 中的 tsRNA 表达，并确定了心功能恶化发病机制的潜在靶基因和 tsRNA-mRNA 相互作用的综合维度。我们的研究激发了关于 EAT 在邻近心肌中的作用的更多新观点，并且有利于开发心脏保护的预防和治疗方法。