介绍
抑郁症是最常见的精神疾病之一，患病率为15-25%，可导致患者在所有职业领域以及社会和家庭关系中的表现显着下降[ 1 ]。血清素 (5-HT)、去甲肾上腺素或去甲肾上腺素 (NA) 和多巴胺 (DA) 等神经递质功能下降是抑郁症的部分原因 [ 2 ]。

氧化应激是各种中枢神经系统疾病的影响因素，可以加速衰老过程并导致与抑郁和焦虑相关的行为。在氧化应激过程中，自由基的产生超过了人体抗氧化防御系统的能力，包括酶成分（如过氧化氢酶）和非酶成分（如维生素C和维生素E）来中和它们。因此，自由基通过攻击各种成分，包括核酸、蛋白质、酶和细胞膜脂质，导致细胞损伤和死亡[ 3]。血清丙二醛（MDA）水平是脂质过氧化的标志物之一，也是评价氧化应激的关键指标。据解释，患有重度抑郁症的人血清总抗氧化能力显着降低[ 4 ]。

一氧化氮 (NO) 是一种游离气体和信使分子，可调节神经和免疫系统。一些研究表明，NO 与抑郁和压力有关[ 5 ]。用于NO产生的一氧化氮合酶有三种不同的遗传亚型[ 6 ]，包括神经元一氧化氮合酶（nNOS）、内皮一氧化氮合酶（eNOS）和诱导性一氧化氮合酶（iNOS）。多项研究表明 nNOS 在抑郁症病理生理学中的作用，并且抗抑郁药已被证明可以降低患者血清中的NO水平[ 7,8,9 ]。

抑郁症的药物治疗可能会产生不良副作用，例如抗胆碱能和心律失常作用，这越来越需要识别用于治疗抑郁症的常用药物[ 10 , 11 ]。药用植物是活性次生代谢产物的丰富来源，广泛引起研究人员的关注[ 12 ]。

Auaptene (7-geranyloxycoumarin) 是从一些柑橘果皮中分离出来的香豆素衍生物，是天然香叶氧基香豆素最丰富的形式。Aurapten存在于许多柑橘属植物中，例如葡萄柚和橙子[ 13 ]，具有宝贵的药用特性，包括抗癌、抗菌、抗真菌、抗炎和抗氧化。Aurapten 还可以保护神经系统 [ 14 , 15 , 16 , 17 ]。

从植物中分离出的一些香豆素化合物对单胺氧化酶具有抑制作用。单胺氧化酶 A (MAO-A) 选择性地靶向血清素和去甲肾上腺素神经递质的催化剂，是寻找治疗抑郁症的有益药物的药理学靶点 [ 18 ]。有证据表明，香豆素化合物通过影响 NFkB 核转运并抑制 LPS 刺激的巨噬细胞和单核细胞系中 P38、JNK1/2、PKC 激酶的磷酸化来抑制 TNF-α 或 PGE2 分泌。此外，研究表明，所有香豆素化合物都通过降低 iNOS 基因及其蛋白质的表达和活性来影响 NO 的产生，这表明香豆素化合物具有抗炎活性，例如 Auaptene [ 19]]。香豆素化合物已被证明通过下调 PI3K/Akt 和 MEK/ERK 通路以及增加 P-gp 表达而表现出抗癌特性 [ 20 ]。

因此，本研究旨在探讨 Auaptene 在雄性小鼠中与 NO 途径的作用相关的抗抑郁作用。

材料和方法
学习规划
将80只雄性 NMRI 小鼠分为八组 (n = 10)，如下[ 21,22,23 ] ：

1.
该组接受生理盐水。

2.
实验组接受Auraaptene，剂量为10 mg/kg。

3.
实验组接受Auraptene，剂量为30 mg/kg。

4.
实验组接受Auraaptene，剂量为100 mg/kg。

5.
该组接受一氧化氮合成酶[ 6 ]抑制剂（L-NAME）10 mg/kg。

6.
该组在测试前 45 分钟接受 100 mg/kg 的 L-精氨酸 (L-arg)。

7.
该组接受了亚有效剂量的 Auaptene 加 L-NAME。

8.
该组接受了有效剂量的 Aurapten 加 L-arg。

Aurapten 与NO介质同时腹腔内快速注射[ 21,22,23 ]。注射后，进行行为测试，然后在氯仿深度麻醉下采集小鼠的大脑和血液样本，以最大程度地减少压力。然后测定小鼠脑和血清中的丙二醛含量、抗氧化能力和一氧化氮。

行为测试
旷场测试 (OFT)
该测试用于评估啮齿动物的压力和情绪稳定性。实验组使用开放场设备（一个尺寸为 60 × 50 × 40 厘米的有机玻璃制成的盒子）在 PND 45 上进行评估。

将箱底面积分成16个相等的正方形，并监测每只小鼠的运动5分钟。该测试还用于根据垂直和水平方向以及身体抓挠的量来评估焦虑[ 24 ]。

尾部悬挂测试（TST）
为了进行 TST，将每只小鼠用距离尾尖约 1 厘米的透明胶带悬挂在杆的边缘（桌面上方 50 厘米）。在悬挂之前通过将小鼠的尾巴穿过小塑料圆筒来禁止尾部上升。记录不动时间6分钟。当动物被动地悬挂并保持完全一动不动时，它们被认为是不动的[ 25 ]。

强迫游泳测试（FST）
该测试已被批准用于调查啮齿动物的抑郁症。根据马丁·塞利格曼的无助理论，如果动物持续承受压力而无法摆脱，它就会逐渐失去逃脱的希望，变得一动不动。玻璃容器（25×12×15cm）中盛满25℃水，将动物从20cm高度轻轻放入水中。鼠标运动的停止被认为是不动。FST 的总持续时间为 6 分钟，其中 2 分钟用于动物适应，4 分钟用于测量不动性。不动时间增加被认为是抑郁症，其减少被认为是抗抑郁治疗的有效性[ 26 ]。

生化测试
大脑和血浆丙二醛水平的测量
使用工作溶液来测量丙二醛(MDA)的量。其含有0.5g硫代巴比妥酸，80ml 20%乙酸，用pH计加入氢氧化钠(NaOH)使pH达到5.3，并通过加入20%乙酸将其最终体积增至100ml。在下一步中，将 100 µl 样品、100 µl 8.1% SDS 和 2.5 ml 工作溶液在玻璃试管中混合，然后将试管在沸水中混合一小时。然后将管冷却并以 4000 rpm 离心。然后在 523 nm 处记录上清液的吸光度 [ 27 ]。

血清和脑总抗氧化能力测定
FRAP 方法的基础是血清在 TPTZ 试剂存在下将 Fe+3 铁离子还原为亚铁 Fe+2 的能力。在此方法中，Fe+2 与 TPTZ 试剂反应生成蓝色 Fe+2-TPTZ 复合物，最大吸光度为 593 nm。通过使用分光光度法增加上述复合物的浓度来测量血清的还原能力[ 28 ]。

测定海马体的一氧化氮水平
为了测定海马中的一氧化氮水平，在存在和不存在选择性一氧化氮合酶抑制剂的情况下，根据格里斯试验，在不同组的动物中，在存在和不存在选择性一氧化氮合酶抑制剂的情况下，测量了不同组动物在施用不同剂量的Auraptene后的亚硝酸盐。该反应的基础是在酸性介质中亚硝酸盐的帮助下形成磺酰胺的重氮化染料，然后与芳香胺 N-萘乙二胺1 (NEDD) 结合[ 22 , 29 ]。

数据分析
使用Prism软件进行统计分析，结果以Mean±SEM表示。通过单因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后检验对数据进行分析。结果以平均值加SEM 的形式表示。P < 0.05 被认为是显着性水平。

结果
OFT 中水平移动的次数
如图 1所示，与生理盐水组相比，Auraptene（10mg/kg）和L-NAME的共同给药显着增加了OFT中的水平运动次数（P<0.05），并且该组在10毫克/千克（P<0.001）。然而，与正常组相比，接受其他剂量 Auaptene 的组之间没有观察到显着差异。

OFT 中垂直运动的次数
单向方差分析和 Tukey 事后检验（图 2 ））表明，与生理盐水组相比，30 mg/kg Auaptene 的给药显着增加了 OFT 的垂直运动次数（P < 0.01）。此外，与生理盐水组相比，Auraptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 联合给药显着增加了这种运动 (P < 0.01)。与单独服用 10 mg/kg Auaptene 的组相比，服用 10 mg/kg Auaptene 加 L-NAME 显着增加了垂直运动的次数（P < 0.001）。与单独接受 30 mg/kg Aurapten 的组相比，以 30 mg/kg 剂量加 L-Arg 施用 Auraptene 显着减少了垂直运动的次数（P < 0.001）。然而，

OFT 中的刮擦量
OFT中抓挠量的结果(图 3 )表明，Auraptene以30和100mg/kg的剂量给药与生理盐水组没有任何显着差异。值得注意的是，与生理盐水组相比，10 mg/kg剂量的Auraptene给药显着减少了OFT中的抓挠量（P < 0.05）。此外，与单独接受 10 mg/kg Auaptene 的组相比，以 10 mg/kg 剂量加 L-NAME 施用 Auaptene 显着增加了这种行为的数量（P < 0.01）。

TST 中不动的持续时间
如图 4所示与生理盐水组相比，Auraptene (30 mg/kg) 的给药显着缩短了 TST 中不动的持续时间 (P < 0.01)。因此，与生理盐水组相比，100 mg/kg Auaptene 给药显着增加了不动的持续时间（P < 0.05）。此外，与生理盐水组相比，施用L-NAME（10mg/kg）和施用L-Arg（100mg/kg）显着缩短了不动的持续时间（P<0.001）。根据结果​​，我们观察到，与接受生理盐水的组相比，10mg/kg剂量的aurapten没有发挥抗抑郁样作用；因此，选择该剂量作为亚有效剂量并与L-NAME共同给药。此外，研究结果表明，30 mg/kg 剂量的 auraptene 具有类似抗抑郁的作用；因此，我们选择该剂量作为有效剂量并与L-Arg共同给药。与生理盐水组相比，Auraptene (30 mg/kg) 和 L-Arg 联合给药显着缩短了不动时间 (P < 0.001)。与单独接受 10 mg/kg Auaptene 的组相比，Auraptene (10 mg/kg) 加 L-NAME 的给药显着缩短了 TST 中不动的持续时间 (P < 0.001)。

FST 中不动的持续时间
本研究的结果(图 5 )显示，与生理盐水组相比，施用30mg/kg的Auraptene显着缩短了FST中的不动持续时间(P<0.05)。此外，与生理盐水组相比，这次给予L-NAME（10mg/kg）的时间显着减少（P<0.01）。与单独服用 10 mg/kg Auaptene 的组相比，Auraptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 联合给药显着缩短了不动的持续时间（P < 0.05）。

血清和脑中 NO 水平
如图 6所示，与生理盐水组相比，30mg/kg的Auraptene给药显着降低了血清NO水平(P＜0.05)，而10和100mg/kg的剂量与对照组相比没有产生任何显着差异。生理盐水组。与生理盐水组相比，注射10 mg/kg L-NAME显着降低血清NO水平（P < 0.001）。Auaptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 联合给药显着降低了血清水平；与接受 10 mg/kg Auaptene 的组相比，NO 水平（P < 0.05）。

根据结果​​(图 7 )，与生理盐水组相比，施用10和100mg/kg剂量的Auraptene显着增加脑内NO水平(P＜0.01和P＜0.001)。此外，与生理盐水组相比，给予100 mg/kg L-Arg显着增加脑内NO水平（P < 0.001）。与生理盐水组相比，Auraptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 联合给药显着增加了该水平 (P < 0.001)。

血清和脑MDA水平
Tukey's post hoc test(图 8 )显示，与生理盐水组相比，给予Auraptene 10mg/kg显着增加血清MDA水平(P<0.05)。与生理盐水组和单独使用 Aurapten 的组相比，Auraptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 联合给药显着降低了血清 MDA 水平（分别为 P < 0.01 和 P < 0.001）。此外，与生理盐水组和单独接受 Aurapten 的组相比，Auraptene (30 mg/kg) 加 L-Arg 的给药显着降低了血清 MDA 水平 (P < 0.001)。

结果(图 9 )显示，Auraptene以10、30和100mg/kg施用与生理盐水组相比没有产生任何显着差异。然而，与生理盐水组相比，100 mg/kg L-Arg 的给药显着增加了脑 MDA 水平（P < 0.01）。与单独服用 10 mg/kg Auaptene 的组相比，同时服用 Auaptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 显着降低了脑 MDA 水平 (P < 0.01)。

血清和大脑的抗氧化能力
与生理盐水组相比，以10mg/kg施用Auraptene显着降低血清抗氧化能力(P＜0.001，图 10 )。与生理盐水组相比，30 mg/kg Auaptene 显着降低血清抗氧化能力（P < 0.01）。然而，在100 mg/kg剂量下，没有任何显着差异。与生理盐水组相比，注射10 mg/kg L-NAME显着降低血清抗氧化能力（P < 0.05）。与生理盐水组相比，Auraptene (30 mg/kg) 和 L-Arg 联合给药显着提高了血清抗氧化能力（P < 0.001）。与单独注射 10 mg/kg Auaptene 的组相比，联合注射 Auaptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 显着提高了血清抗氧化剂水平 (P < 0.001)。

图 11说明接受10、30和100mg/kg剂量的Auraptene的组与生理盐水组之间的脑抗氧化能力没有显着差异。但与生理盐水组相比，Auraptene（30 mg/kg）加L-Arg的给药显着增加了脑抗氧化能力，并且接受30 mg/kg Auaptene的组（分别为P < 0.001和P < 0.05）。此外，与单独服用 10 mg/kg Auaptene 的组相比，同时服用 Auaptene (10 mg/kg) 和 L-NAME 显着增加了大脑中的抗氧化剂水平 (P < 0.05)。

讨论
本研究旨在研究 Auaptene 对雄性小鼠 NO 通路的抗抑郁样作用。我们的结果表明，Auraptene 减少了 FST 和 TST 中的不动持续时间，表明其具有抗抑郁样作用。我们证明，Auraptene 至少部分地通过增加抗氧化能力以及降低大脑中的 MDA 和亚硝酸盐水平而具有其抗抑郁样作用。

已经证明，啮齿类动物的抑郁症与 FST 和 TST 不动时间增加有关 [ 30 ]。临床前研究表明，具有抗抑郁样作用的药物可减少 FST 和 TST 中的不动时间 [ 31 ]。这项研究观察到 Auaptene 减少了 FST 和 TST 中的不动时间，表明其具有抗抑郁作用。

Auaptene (7-geranyloxycoumarin) 是一种香豆素衍生物，存在于许多柑橘属植物中，例如葡萄柚和橙子 [ 13 ]。据报道， Auraptene 具有多种药理学特性，包括抗癌、抗菌、抗真菌、抗炎和抗氧化作用[ 15,16,17,32 ]。一项针对健康志愿者的随机、安慰剂对照、双盲研究表明，食用 Auaptene 作为河内柑橘 (Kawachibankan) 果皮可改善认知功能 [ 33]。实验研究已确定 Aurapten 具有神经保护特性。在这方面，已经表明，Auraptene 可能通过减弱氧化应激，在戊四氮诱导的小鼠化学点燃中发挥抗惊厥作用 [ 34 ]。此外，Auraptene 可减轻脑缺血后的神经损伤并增强记忆力 [ 35 ]。我们的结果表明，Auraptene 具有抗氧化特性，可以提高抗氧化能力并降低大脑中的 MDA 和亚硝酸盐水平。这些特性可能有助于 Aurapten 的抗抑郁作用。

已经确定一氧化氮（NO）参与抑郁症等行为障碍的病理生理学[ 36 ]。在这个概念中，之前的研究表明，NO 过量产生会减轻抗抑郁药的抗抑郁作用[ 37 ]。此外，抑制 NO 产生可增强某些药物的抗抑郁作用 [ 38 , 39]。与上述研究一致，我们的研究结果表明，NOS 抑制剂 (L-NAME) 增强了亚有效剂量的 Auaptene 的抗抑郁样作用。同时，L-arg（一氧化氮前体）减弱了有效剂​​量的 Aurapten 的抗抑郁样作用。因此，NO 可能有助于 Auaptene 的抗抑郁药样开发。

临床研究已证明血浆中 MDA 浓度与抑郁症状的严重程度直接相关[ 40 ]。在这方面，研究人员报告说，重度抑郁症与抗氧化状态下降以及氧化和亚硝化途径的诱导有关[ 6,41,42 ]。现已明确，抗氧化能力降低与 MDA 水平升高相关[ 43 ]。大量证据表明，一些抗抑郁药通过提高抗氧化能力和降低MDA水平来发挥作用[ 44 , 45]。我们的结果表明 Auaptene 显着降低 MDA 并提高抗氧化能力。此外，我们观察到，同时服用 L-NAME 和 L-arg 可以减轻 Auaptene 对 MDA 水平和抗氧化能力的影响。

这项研究表明，Auraptene 通过降低 NO 和 MDA 水平并增加抗氧化能力而具有抗抑郁样作用。然而，根据我们的研究，Auraptene 的作用机制尚未完全确定，因此；需要进一步的研究来找到 Aurapten 抗抑郁样作用的确切机制。

结论
我们的结果表明，Auraptene 通过降低 NO 和 MDA 水平并增加抗氧化能力，在小鼠中发挥抗抑郁样活性。研究结果表明，Auraptene 对抑郁样行为和氧化应激标记物的有益作用是通过 NO 途径介导的。此外，我们发现 NOS 抑制作用增强，而 NO 前体减弱了 Aurapten 的有益作用。