背景/简介
听觉时间和频谱调制线索塑造语音识别 [ 1 , 2 ]。区分时间精细结构的能力对于语音处理至关重要 [ 3 ]，并且人类从很小的时候就具有对时间调制中细微差异进行编码的能力 [ 4 ]。听觉系统在发育过程中无法处理快速变化的声输入，可能会扰乱语音感知、语音处理并导致语言障碍[ 5 ]。婴儿期的时间处理敏锐度可预测 2 岁左右儿童的语言发展 [ 6]。据报道，自闭症谱系障碍 (ASD) 儿童的感觉处理和语言发育异常[ 7,8,9,10,11 ]。患有自闭症谱系障碍 (ASD) 的个体在检测声音持续时间、起始和偏移以及频谱时间特性的快速变化方面表现出缺陷 [ 12 , 13 , 14 , 15 , 16 ]。患有自闭症谱系障碍的儿童在再现听觉刺激的长度方面表现出困难，并且患有自闭症谱系障碍的儿童和成人都会对重复、连续的听觉刺激的音调波动产生异常的神经反应[ 17,18 ,19 ]。自闭症谱系障碍患者的间隙检测阈值增加，这是一种常用于评估听觉时间处理的范例。值得注意的是，儿童间隙检测阈值受损与较低的语音处理分数相关[ 8 ]。这些针对人类的研究为以下假设提供了支持：听觉时间处理缺陷可能会导致自闭症谱系障碍患者的言语和语言功能异常。异常时间处理和发育性阅读障碍之间的联系也被提出，表明发育中更广泛的后果[ 20 ]。

虽然语音和语言功能无法在动物模型中直接研究，但时间处理可以量化。然而，神经发育障碍中时间处理缺陷的发育轨迹和潜在神经机制仍不清楚，需要与翻译相关的动物模型。识别何时出现时间处理缺陷对于确定临床前模型和临床研究中潜在治疗测试的最佳治疗窗口至关重要。在这里，我们提出了一种使用 ASD 模型小鼠脑电图记录来评估快速噪声间隙时间处理的新方法，该方法可以相对容易地转化为人类，并且我们在听觉时间处理中显示出强大的皮层区域特异性发育延迟。

脆性 X 综合征 (FXS) 是遗传性智力缺陷和 ASD相关行为（如重复行为、感觉、认知和社交障碍）的主要原因 [ 21,22,23,24,25 ] 。患有FXS的人表现出言语缺陷和语言障碍[ 7,26,27,28,29 ]。FXS 分别影响多达四千分之一/七千分之一的男性/女性个体，是X 染色体上脆性 X 信使核糖核蛋白 ( Fmr1 ) 基因沉默的结果 [ 30 , 31]]。这导致脆性 X 信使核糖核蛋白 (FMRP) 部分或完全丧失，并随之改变大脑中的突触发育和可塑性 [ 32 , 33 ]。临床、行为和电生理学研究已证明 FXS 患者在多个领域存在感觉超敏反应 [ 25 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ]。

感觉超敏反应在FXS的Fmr1 KO 小鼠模型中也始终可见[ 39,40,41,42 ]。值得注意的是，Fmr1 KO 小鼠对听觉刺激表现出与人类相似的异常反应，为研究感觉回路病理生理学的发育概况和神经机制提供了一个转化平台[ 43 ]。FXS 患者的脑电图记录显示皮质振荡活动发生改变，可能导致感觉过敏 [ 44 ]。更具体地说，与健康对照组相比，FXS 患者的宽带伽马频率功率有所增加 [ 31]。当使用时变听觉刺激时，窄带（~ 40 Hz）引起的伽马同步存在缺陷。FXS 患者的听觉 ERP 振幅也增强，习惯性降低 [ 45 ]。这些结果表明 FXS 基线皮质活动升高，破坏了皮质发生器将其振荡与动态刺激同步的能力。对重复刺激的反应增强也表明持续的皮质活动升高。在Fmr1 KO 小鼠中观察到类似的脑电图表型：在Fmr1 KO 小鼠中发现宽带伽马功率升高、窄带伽马同步降低以及皮层对重复刺激的反应增加[ 42 , 46 ,47、48、49 ]。​​​ 总而言之，人类和小鼠感觉超敏行为和脑电图表型的相似性表明Fmr1 KO 小鼠是解决 FXS 感觉功能障碍的有用模型。

在Fmr1 KO 小鼠的听觉脑干中观察到细胞大小和突触标记表达的发育异常，该区域与高分辨率时间处理密切相关[ 50 ]。这表明听觉时间处理异常可能在发育早期出现。然而，尚未在Fmr1 KO 小鼠或任何 ASD 动物模型中研究时间处理的发展。目前的研究测试了以下假设：Fmr1 KO 小鼠在早期发育过程中就存在皮质时间处理和听觉敏感性缺陷。我们在Fmr1中记录了来自听觉皮层和额叶皮层（AC、FC）的脑电图信号三个年龄的 KO 和野生型 (WT) 小鼠：p21、p30 和 p60。为了量化时间处理保真度，我们利用 40 Hz 噪声间隙 ASSR（听觉稳态响应，下文称为间隙 ASSR）范例来评估皮层对不同调制深度下的短暂噪声间隙做出持续响应的能力 [ 51 ] 。间隙刺激已在人类和小鼠中广泛用于研究听觉颞敏度，并且与单个单元记录相比，在人类和小鼠中进行脑电图记录相对更容易[ 52 , 53 ]。自闭症儿童整合背景声音中时间间隙中存在的信息的能力下降，为使用噪声刺激间隙来评估时间处理提供了额外的理由[ 54]。Fmr1 KO 小鼠皮质表型存在区域差异。特别是，多项小鼠模型研究表明，FC 中的听觉时间处理异常可能比 AC 更大。例如，Wieczerzak 等人。据报道，与 AC 相比，FC 中噪声引起的听力损失后 ASSR 的恢复降低[ 55 ]。洛夫莱斯等人。据报道，成年Fmr1 KO 小鼠的 FC 中 ASSR 存在缺陷，但 AC 中没有缺陷[ 56 ]。在 FC 中具有新皮质异位的自身免疫性疾病小鼠模型中观察到时间处理障碍 [ 57]。目前尚不清楚任何小鼠模型中的这些区域差异是否存在于整个发育过程中，或仅存在于特定年龄。因此，我们在 3 个不同年龄段的时间处理方面比较了 FC 和 AC。此外，我们还评估了听觉 ERP 的响应幅度，因为它们在 FXS 患者中得到了很好的表征，并且始终表现出增强的幅度。我们假设Fmr1 KO 小鼠在所有 3 个发育时间点的 AC 和 FC 中均表现出听觉时间处理缺陷，并且与 WT 相比，ERP 振幅增加。

方法
老鼠
所有程序均得到加州大学河滨分校动物护理和使用机构委员会的批准。小鼠是从源自杰克逊实验室（缅因州巴港）的内部繁殖群中获得的。用于研究的小鼠为可见 FVB 野生型（Jax，stock# 004828；WT）和可见 FVB Fmr1敲除小鼠（Jax，stock# 004624；Fmr1 KO）。选择 FVB 背景菌株（而不是 C57bl6/J）是因为我们之前检查皮质小清蛋白和神经周围网络以及听觉皮层和下丘中的单个单元反应的发育工作使用了 FVB 菌株 [ 46 , 58 ]。Fmr1观察到显着的发育缺陷FVB 小鼠品系中的 KO 小鼠，预测时间处理缺陷。

每个笼子里饲养 1 到 5 只小鼠，光照周期为 12:12 小时，并随意进食。本研究使用的是横截面设计，而不是纵向设计，因为将硬膜外螺钉电极放置在仍在发育的大脑和头骨中是不切实际的。本研究使用以下年龄范围和样本量：WT [p21 ( n  = 10)、p30 ( n  = 10)、p60 ( n  = 11)] 和Fmr1 KO [p21 ( n  = 10)、p30 ( n  = 10），p60（n  = 11）]。本研究的年龄选择是根据之前的发现。在Fmr1中观察到小白蛋白阳性中间神经元周围的 PNN 表达减少和皮质过度兴奋在 p21 处 KO 小鼠 [ 59 ]。此外，p14-21年龄对应于听觉皮层中对音调反应和音调主题图成熟的关键时期[ 60 , 61 ]。选择 P30 是因为直到这个年龄，听觉皮层对复杂声音的反应选择性才成熟[ 62 ]。我们选择 p60 年龄组来代表青年期。仅研究了雄性小鼠。

外科手术
不同组的小鼠在三个发育时间点接受硬膜外电极植入手术：p18-20、p27-p29、p57-p66。使用腹膜内 (ip) 注射 80/20 mg/kg 氯胺酮/甲苯噻嗪（年轻小鼠）或 80/10/1 mg/kg 氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪（成年小鼠）对小鼠进行麻醉。在整个手术过程中，每 10-15 分钟通过脚趾捏反射密切监测麻醉状态。必要时给予氯胺酮补充剂。手术前通过皮下注射给予 ETHIQA-XR（1 次丁丙诺啡，3.25 毫克/公斤体重）。去除皮毛和皮肤并对头皮进行消毒（酒精和碘酒擦拭）后，切开一个切口以暴露头皮。使用 Foredom 牙钻在右侧 AC、右侧 FC 和左侧枕叶皮质上方的颅骨上钻直径约 1 毫米的孔。48,51,56,63 ]并且基于单个单元映射[ 42,48,51,56,63,64 ] 。​​ 从三通道柱伸出的电线缠绕在 1 毫米螺钉上并打入预先钻好的孔中。将牙科水泥涂在螺钉周围、柱基部和暴露的颅骨上，以固定种植体。将小鼠放在加热垫上直至完全清醒，并在进行脑电图记录之前给予 48-72 小时的恢复时间。

脑电图记录
所有脑电图记录均来自清醒且自由活动的小鼠。在三个发育时间点进行脑电图记录：p20-23、p29-31、p59-p70，我们分别将其称为 p21、p30 和 p60。使用枕骨螺钉作为参考，从 AC 和 FC 电极获得记录。小鼠被放置在一个可以在录音期间自由移动的场地中。该竞技场位于一个法拉第笼内，该法拉第笼放置在隔音消声室（俄勒冈州格雷奇肯）的隔振台上。在异氟烷短暂麻醉下，将小鼠通过植入的柱连接到脑电图电缆上。脑电图记录设置先前已报道过 [ 51 , 63]。简而言之，所连接的电缆通过换向器连接到 TDT (Tucker Davis Technologies, FL) RA4LI/RA4PA 前置放大器，后者又连接到 TDT RZ6 多 I/O 处理器。OpenEx (TDT) 用于同时记录 EEG 信号并操作用于同步视频和波形数据的 LED 灯。TTL 脉冲用于在收集的脑电图数据中的单独通道上标记刺激起始点。EEG 信号以 24.414 kHz 的采样率记录，并下采样至 1024 Hz 进行分析。在分析伪影（包括信号丢失或削波迹象）之前，对所有原始脑电图记录进行了目视检查，但没有发现任何伪影。因此，没有脑电图数据被拒绝。声音诱发脑电图记录如下。

听觉ERP
在没有刺激的情况下对录音场地进行 25 分钟的习惯后，使用扬声器（MF1，塔克戴维斯技术公司，佛罗里达州）位于距竞技场地板 20 厘米处。ERP分析和统计之前已经描述过[ 51 , 63]。简而言之，EEG 轨迹被分成多个试验，使用 TTL 脉冲来标记声音开始。每个试验均经过基线校正，以便从每个试验的试验迹线中减去声音开始之前 250 ms 基线期的平均值。然后对每个试验进行去趋势处理（MATLAB detrend 函数），并对所有试验进行平均。使用带有 Gabor 归一化的动态复 Morlet 小波变换进行时频分析。为每个频率设置小波参数以优化时频分辨率。非基线归一化单次试验功率 (STP) 不能校正平均基线功率水平，从而可以识别刺激呈现期间正在进行的“背景活动”。为了比较每个发育时间点的基因型反应，使用了非参数排列检验，65 ]。首先，对所比较的两组的每个时间频率点进行 t 检验，得出所有点的 T 值。对应于p  < 0.025 的 T 值被认为是显着的。发现了显着 T 值的簇并测量了它们的面积。接下来，随机调整分组分配，并在替代组上再次运行 t 检验和聚类测量。该替代分析执行了 2000 次，以生成我们期望偶然发现的簇大小分布。最初识别的大于 95% 替代簇的簇被认为是重要的。该方法可以识别组之间的显着差异，而无需进行过多的比较。

间隙ASSR
用于评估听觉时间处理的刺激被称为“40 Hz 噪声间隙 ASSR”（听觉稳态响应，下文称为“间隙 ASSR ”）[ 51 ]。刺激包含交替的 250 ms 噪声片段和以 75 dB SPL 呈现的间隙中断噪声。这些间隙策略性地间隔 25 毫秒，从而产生 40 Hz 的呈现速率，当从 AC 和额叶区域测量时，该速率会产生最强的 ASSR 信号，并且可能反映底层神经回路的共振频率 [ 66 , 67 , 68、69、70、71、72​​​​​​​​]。对于噪声段中的每个间隙，间隙宽度和调制深度是随机选择的。使用宽度为 2、4、6、8、10 或 12 ms 的间隙以及 75% 和 100% 的调制深度。为了测量皮层对噪声间隙做出一致反应的能力，测量了 40 Hz 的试验间阶段聚类 (ITPC) [ 73 ]。使用动态复数 Morlet 小波变换对 EEG 迹线进行变换。与每个参数对（间隙持续时间+调制深度）相对应的试验被分组在一起。将每个时频点的 ITPC 计算为试验期间记录的每个相位单位向量的平均向量（每个参数对的试验计数 > 100 次试验）。对 40 Hz 时的 ITPC 值进行平均，以提取 AC 和 FC 中参数对的平均 ITPC。

统计数据
在 GraphPad Prism (ERP) 或 R (gap-ASSR) 上进行统计。为了评估基因型（2 个水平）和年龄（3 个水平）的影响，使用双向方差分析进行 ERP 分析。使用 Tukey 和 Bonferroni 的多重比较检验进行事后比较。使用 Shapiro-Wilk 检验对 ERP 数据进行正态性检验。采用三向重复测量方差分析进行间隙 ASSR 分析，三个因素为基因型（2 个水平）X 年龄（3 个水平）X 间隙持续时间（6 个水平）。选择重复测量方差分析，因为在记录会话中从单个小鼠收集多个间隙持续时间数据点。必要时使用莫奇利球形度检验并使用 Greenhouse-Geisser 校正进行校正。使用事后对比与 Sidak 校正进行多重比较。皮质区域（AC、FC）和调制深度（75%、100%）分别进行了分析。我们通过方差分析评估了数据分析的适当性，特别是残差正态性的假设。残差的偏度或峰度测量值均不超过 ± 2，这是可接受的正态性的一个指标[74 ]。此外，残差是通过分位数-分位数图进行评估的。在每次分析中，理论正态分布和获得的残差之间的对应关系都在可接受的范围内。

结果
本研究的主要目标是比较 WT 和Fmr1 KO 小鼠听觉和额叶皮层的听觉时间处理和 ERP 的发育轨迹。我们预测，与 WT 小鼠相比，在 AC 和 FC 中， Fmr1 KO 小鼠在所有 3 个年龄段中都会表现出锁相缺陷，从而导致噪声快速间隙和更大的 ERP 振幅，分别作为 FXS 中时间处理和超敏反应表型的标记。

在发育过程中，FC 中出现异常时间处理，但 AC 中未出现
使用 40 Hz 噪声间隙 ASSR 刺激来评估听觉时间处理，以探究听觉和额叶皮层对噪声短暂间隙持续响应的能力的极限。减少间隙的持续时间和调制深度会降低皮层一致反应的可能性，从而允许检测 WT 和 KO 小鼠反应之间的偏差并跟踪发育变化。小鼠和人类的 AC 和 FC 都会对这种类型的刺激产生强大的40 Hz ITPC，但是这两个物种的反应如何发展尚不清楚，也不知道 FXS 是否存在缺陷 [ 51,72,75 ] 。

图 1显示了WT（图 1A，C）和Fmr1 KO（图 1B，D）小鼠中ITPC的gap-ASSR热图。在第 21 页的 AC 中，或者在第 60 页的 AC 和 FC 中，ITPC 没有明显的质量差异。然而，在第 21 页的 FC 中明显存在缺陷，KO ITPC 在 40 Hz 时几乎没有高于背景。表1和图 2显示了使用间隔持续时间、年龄和基因型作为因素的完整统计分析结果。

图。1
图1
Fmr1 KO 小鼠发育过程中听觉时间处理异常。在 p21 和 p60 WT（A：AC，C：FC）和Fmr1 KO（B：AC，D：FC）小鼠中，在多个间隙持续时间内以 40 Hz 频率生成 ITPC 的单个示例热图。对这些例子的定性观察显示，KO 小鼠在第 21 期（而非第 60 期）皮质时间处理存在缺陷。所有面板均显示 100% 调制深度。每个面板中间隙 ASSR 刺激的起始时间为 0 毫秒

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表1gap-ASSR数据的全面统计分析
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图2
图2
群体分析显示Fmr1 KO 小鼠发育过程中 FC 的时间处理缺陷。每个图代表组平均 ITPC 值。每行代表不同的年龄组：p21（上）、p30（中）和 p60（下）。左列代表 75% 调制深度的 AC 和 FC 数据，右列代表 100% 调制深度的 AC 和 FC 数据。正如预期的那样，两种基因型中 ITPC 都随着间隙宽度的增加而增加。Fmr1 KO 小鼠在 p21 和 p30 时显示出 FC 的显着缺陷，但 AC 没有。完整数据分析如表1所示

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听觉皮层
间隙 ASSR ITPC 受到两种调制深度下 AC 间隙持续时间的显着影响。这是预料之中的，因为与短间隙相比，神经发生器更容易对长间隙响应进行锁相响应。在 75% 或 100% 调制下，年龄对 AC 没有主要影响，但在 75% 时，间隙持续时间 x 年龄存在交互作用，表明在较长间隙下，ITPC 随着年龄的增长而改善。重要的是，在 AC 中的任何年龄或调制深度下，基因型比较都不显着（图 2，75  %调制 – p21：p  = 0.9223，p30：p  = 0.9568，p60：p  = 1.000；100% 调制 – p21：p  = 0.8664，p30：p  = 0.6906，p60：p = 1.000）。总而言之，这些数据表明任何年龄的听觉皮层的时间处理能力都有所改善，但 FMRP 的丧失不会产生影响。

额叶皮质
与 AC 类似，正如预期的那样，额叶皮层显示出间隙持续时间的主要影响。然而，与AC相反，FC间隙-ASSR显示出年龄和基因型的主要影响（图 2）以及许多相关的相互作用（表1）。在两种调制深度下，FC 响应都随着年龄的增长而有所改善，表明该区域的时间处理有很强的发育调节。与 WT 小鼠相比，在两种调制深度下，Fmr1 KO 神经元在 ITPC 中均表现出显着缺陷。基因型 X 年龄相互作用表明 ITPC 发育延迟，而成人 FC 没有表现出明显的缺陷。这些结果表明Fmr1 KO 小鼠的时间处理发育显着延迟。

FC 发育迟缓的证据通过间隙的塌陷更直接地显示出来（图 3）。当在间隙持续时间内崩溃时，KO 小鼠在 FC 的 p21 和 p30 处表现出显着的 ITPC 缺陷，这在 p60 处未见（75% 调制 – p21：p  < 0.0001，p30：p  = 0.0022，p60：p  = 0.8372；100% 调制 – p21：p  < 0.0001，p30：p  = 0.0548，p60：p  = 0.6410）。总而言之，这些数据显示，AC 和 FC 的发育对间隙 ASSR 刺激的锁相有所改善，并且Fmr1 KO 小鼠的时间处理出现 FC 特异性延迟。

图3
图3
AC 和 FC 的听觉时间处理随着年龄的增长而改善，而 FC 则发育迟缓。每个图代表跨间隙宽度折叠的组平均 ITPC 值。列代表不同的调制深度，行代表不同的皮质区域（列 - 左 = 75% 调制，右 = 100% 调制；行 - 顶部 = AC，底部 = FC）。KO 小鼠在两个调制深度的 FC 中 p21 和 p30 处均显示出显着的 ITPC 缺陷，但在 p60 处则不然。在 AC 的任何年龄或调制深度下均未发现基因型差异

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Fmr1 KO 小鼠中间隙 ASSR 单试验功率表型的开发
发育中的Fmr1 KO 小鼠 FC中 ITPC 的减少可能是由于刺激引起的非锁相活动（背景噪声）的增加，正如 FXS 人类中所暗示的那样 [ 44 , 45 ]。因此，我们检查了gap-ASSR刺激期间跨发育和基因型的单次试验功效（STP）（ 图4、5和6 ）。在 p21 时，任何间隙或皮质区域的 STP 都没有差异（图 4）。然而，在 p30 时，与 WT 小鼠相比，KO 小鼠中的 STP 显着升高，并且在两个皮质区域均可见（图 5 ））。STP 的升高影响伽玛波段频率 (25–80 Hz)，较低频率没有差异。在成年组中，AC 中 STP 差异的方向相反，因此Fmr1 KO 小鼠表现出 STP 降低，显着影响 < 25 Hz 的频率。然而，FC 中没有 STP 差异。这些数据为单次试验功率差距 ASSR 表型在发育过程中的波动提供了证据。皮层区域和年龄的 STP 缺陷和间隙 ASSR 缺陷之间缺乏一致性，这表明时间处理缺陷不是由于声音引起的持续背景活动的增加所致。

Fmr1 KO 小鼠在整个发育过程中 AC 和 FC 的 ERP 幅度增强
ERP 由一系列电压波动组成，称为“波”（P1、N1、P2），在声音出现后的特定潜伏期引发。每个波形都与特定大脑区域的群体活动相关。测量这些波的振幅和延迟可以评估响应同步性或对声音呈现的超敏度。我们还描述了响应窄带噪声突发的非基线归一化 STP，因为在听觉刺激呈现期间，FXS 患者的功率异常 [ 44 , 45 ]。表2和图 2 7和8显示跨发育和基因型的 ERP 数据的完整方差分析。下面重点介绍了两个皮质区域的主要结果。

表2 ERP数据全统计分析
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图7
图7
年龄和基因型影响 AC 中的 ERP 幅度和潜伏期。A  WT 和 KO 小鼠 AC 中记录的第 21 个（左）、第 30 个（中）和第 60 个（右）的平均 ERP。B  AC ERP 波幅的总体平均值。发育过程中 KO 小鼠的 P1 振幅显着增加，但 WT 小鼠则没有。与 WT 相比，成年 KO 小鼠 P1 振幅增加。基因型影响 N1 振幅。P2 幅度受年龄影响，但不受基因型影响。C  AC ERP 波延迟。WT 小鼠的 P1 潜伏期随着年龄的增长而减少。完整分析如表2所示

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图8
图8
年龄和基因型影响 FC 中的 ERP 幅度和潜伏期。A从 WT 和 KO 小鼠的 FC 在第 21 个（左）、第 30 个（中）和第 60 个（右）时记录的平均 ERP。B FC ERP 波幅。KO 小鼠的 P1 振幅随发育显着增加。成年 KO 小鼠中 N1 振幅增加。KO 小鼠中 P2 振幅随着年龄的增长而降低。C FC ERP 波延迟。成年 KO 小鼠的 P2 潜伏期增加。完整分析如表2所示

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听觉皮层
随着发育， Fmr1 KO 小鼠AC 中的 ERP P1 振幅显着增加（交互作用：p  = 0.0002；年龄的主效应：p  = 0.0005；KO p21-p60：p  < 0.0001；KO p30-p60：p  = 0.0001）。与 WT 相比，这些小鼠在 p60 时的 P1 振幅也显着更高（基因型的主要影响：p  = 0.0113；事后：p  < 0.0001）。我们发现基因型对 N1 振幅有主要影响。此外，我们报告了年龄对 P2 振幅的显着主效应 ( p  = 0.0575)。P1 潜伏期受年龄影响，特别是在 WT 小鼠中，潜伏期随着年龄的增长而降低（年龄的主要影响：p = 0.0053; WT p21-p60：p  = 0.0537）。这些数据显示， Fmr1 KO 小鼠AC 中的 ERP 振幅增加，与 FXS 人类中观察到的情况一致，但表明超敏反应的早期出现。

额叶皮质
与 AC 相似，Fmr1 KO 小鼠随着 FC 的发育，P1 振幅显着增加（交互作用：p  = 0.034）。成年Fmr1 KO 小鼠的 N1 振幅显着增加（基因型的主效应：p  = 0.0031；WT-KO p60：p  = 0.0251）。此外，KO 小鼠中 P2 振幅随着年龄的增长而降低（年龄的主要影响：p  = 0.0159；KO p30-p60：p  = 0.0510）。成年Fmr1 KO 小鼠的 P2 潜伏期较慢（年龄的主要影响：p  = 0.0045；WT-KO p60：p  = 0.0030）。这些数据表明Fmr1KO 小鼠额叶皮层 N1/P1 ERP 振幅异常升高。

Fmr1 KO 小鼠ERP 单试验功率表型的开发
除了 ERP 峰值幅度和延迟之外，我们还分析了用于 ERP 测量的刺激序列期间的 STP（ 图9、10 ）。STP 表型与间隙 ASSR 范式中发现的相似。AC（图9）或FC（图 10 ）中p21处的STP没有基因型差异 。在第 30 页，KO 小鼠在 AC 和 FC 中均表现出升高的 STP，其影响仅限于 25-80 Hz 之间的频率。在 p60 时，KO 小鼠 AC 在低于 60 Hz 的频率下显示出 STP 降低，但 FC 没有差异。这些结果支持 FXS 背景功率表型发育波动的观点。

图9
图9
在发育过程中，AC 中的Fmr1 KO中 ERP 刺激期间的非基线标准化 STP 发生改变。其格式类似于图 1 和 2 。 4 – 6，除了这些是在 ERP 刺激期间获得的。轮廓区域表示 WT 和 KO 之间显着不同的簇。年轻的Fmr1 KO 小鼠在 p21 时的 STP 没有表现出差异。B KO 小鼠在 p30 时伽玛范围内的背景活性增加。C与 WT 相比，成年 KO 小鼠在 β 和 γ 频率范围内显示出 STP 降低

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图10
图10
在发育过程中，FC 中的Fmr1 KO中 ERP 刺激期间的非基线归一化 STP 发生改变。图形格式与图4-6相同 。年轻的Fmr1 KO 小鼠在 p21 时的 STP 没有表现出差异。B KO 小鼠在 p30 时伽马频率的背景活性增加。C成年Fmr1 KO 小鼠在 p60 时的 STP 无显着差异

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讨论
这项研究的主要和新颖的贡献是确定了 WT 和Fmr1 KO 小鼠两个皮质区域听觉时间处理的发育轨迹。我们记录了三个不同年龄的 AC 和 FC 的 40 Hz 噪声间隙 ASSR，作为时间处理的衡量标准。我们还量化了 ERP 幅度/延迟和声音诱发的单次试验功率，以确定异常升高的 EEG 功率是否与时间处理缺陷存在发育相关性。结果显示间隙 ASSR 反应和 ERP 中的基因型、皮质区域和年龄特异性异常。有趣的是， Fmr1的 FC 中的间隙 ASSR 反应出现显着的发育迟缓，而 AC 中则没有KO老鼠。KO 小鼠的 AC 和 FC 发育过程中 ERP N1 振幅均较大。非锁相STP表型表现出发育波动。在Fmr1 KO 小鼠中，在 p21 和 p30 之间，在间隙 ASSR 和 ERP 记录期间，STP 均有所增加，而在 p60 时，这种表型出现逆转。总而言之，这些数据为FXS 的Fmr1 KO 小鼠模型中额叶皮层时间处理的异常发育以及听觉和额叶皮层的过敏反应提供了新的证据。这些数据不支持这样的观点，即过度敏感的皮层反应是Fmr1发育过程中时间处理缺陷的基础KO 小鼠，因为两种测量之间没有发育相关性。这些表型可能源自独立的机制。KO 小鼠间隙 ASSR 脑电图反应的强烈发育延迟为评估潜在机制和确定治疗目标和窗口提供了生理工具。

WT小鼠在gap-ASSR EEG反应中显示出显着的发育改善，为其他自闭症谱系障碍和神经发育障碍的小鼠模型提供了参考。这与大鼠听觉皮层的研究结果一致，其中具有短神经间隙检测阈值的神经元的百分比从青少年到成年增加[ 76 ]。这些间隙处理中的神经改善可能是儿童间隙检测阈值感知改善的基础，这一因素与发展中语言的改善相关[ 6,77,78,79,80 ]。

FXS 中一致报道了表达性和接受性语言缺陷，但潜在机制尚不清楚[ 81 ]。患有FXS的儿童在语言成熟所需的多个认知类别中表现出发育迟缓，例如听觉短期记忆和注意力[ 82、83、84、85、86、87 ] 。除了这些认知因素外，时间处理延迟和听觉过敏可能是 FXS 言语和语言延迟的原因 [ 4 , 5 ]。在发育障碍和衰老中，间隙处理已被用于分析各组的听觉颞敏度[ 51、63、88、89 ] 。​​​ 患有 ASD 的儿童的间隙检测阈值增加，而儿童的间隙检测阈值受损与较低的语音分数相关 [ 8 ]。这里使用的 40 Hz 噪声间隙 ASSR 范式测试了 AC 和 FC 中 EEG 神经发生器在试验中一致锁相的能力，并且可以用于具有 FXS 的人类，以确定是否有类似的皮质区域特定时间处理患者存在缺陷。通过改变调制深度和间隙宽度，可以比较各组听觉系统的时间处理敏锐度[ 52 , 53 ]。间隙处理的皮质机制也开始被理解[90、91 ] 。​ 未来对 FXS 儿童的脑电图研究应该检查时间间隙处理缺陷是否存在于发育早期，以及它们是否与语言能力的发展有关。这可能为儿童在快速变化的刺激（包括间隙）中进行适应性训练提供基础，以提高语音识别和语言能力[ 92 ]。

出于多种原因，当前的研究重点关注 40 Hz ASSR。在人类不同品系和年龄的 FXS 和 Fmr1 KO小鼠中，一致观察到伽马带缺陷[ 31,44,45,47,48,49 ] 。表达小清蛋白的抑制性神经元及其周围神经元周围网的成熟也存在发育延迟[ 59 ]。由于这些神经元参与产生伽玛带振荡，我们预测 40 Hz ASSR 缺陷。关注 40 Hz ASSR 的另一个原因是听觉皮层在该频率下产生共振，因此在 40 Hz 时产生最大的脑电图响应功率。72、93、94 ]。​​​ 此外，还研究了 40 Hz ASSR 的机制，包括跨区域地形的描述和基底前脑神经元的作用 [ 71 , 95 ]。

与语音处理更相关的是，伽马波段振荡和音素处理之间存在紧密的联系，伽马振荡解析音素范围内的语音输入[ 96 ]。较慢的振荡（delta-theta）可能与语调和音节速率以及进化较慢的语音的其他方面更相关。基于这些观察，提出了语音处理的“时间不对称采样”假设，其中伽马振荡在音素处理中发挥着重要作用[ 96、97、98 ]]。伽马分辨率解析可以提供足够的线索来分离紧密间隔的输入（例如，语音开始时间、共振峰转换），从而促进语音识别。未来的研究将测量Fmr1 KO 和 WT 小鼠的 10 和 20 Hz ASSR，这将为了解 FXS 人类言语缺陷的机制提供见解。

Fmr1 KO 小鼠的 ERP 缺陷
P1-N1-P2 ERP 复合体标志着声音的预先注意检测，并且可以随刺激特征而变化。与对 FXS 人类的多项研究以及我们之前对成年和发育中小鼠的研究一致，与 WT 小鼠相比， Fmr1 KO 小鼠的 ERP 成分振幅更高[人类：86-91；人类：86-91；小鼠：47–48,92]。我们发现 KO 小鼠的 AC 和 FC 中的 N1 振幅较高，N1 振幅由额叶和颞叶产生 [ 99 ]，标志着皮质内的同步活动。这与钙成像研究一致，钙成像研究显示Fmr1 KO 小鼠皮质中异常高的同步活动，可能是由于小清蛋白阳性抑制性中间神经元的异常活动引起的 [ 59 , 100]，101 ]。小鼠[ 102 ]和人类[ 38 ]反应习惯的减少也可能导致更大的N1振幅，因为报告的振幅是多次试验反应的平均值。我们还观察到基因型和/或基因型 X 年龄相互作用对 P1 振幅的主要影响，KO 小鼠表现出更大的振幅。P1 振幅标志着丘脑皮质输入活动，表明 KO 小鼠皮质的输入驱动增强。这可能是由于 KO 皮质中快速尖峰（假定的小白蛋白阳性）抑制性中间神经元的输入层 4 丘脑皮质驱动减少所致，如 Gibson 等人所示。和帕特尔等人。[ 103 , 104]。P2 振幅被认为与唤醒有关，因为中脑网状激活系统的听觉输入有助于 P2 的生成 [ 105 ]。AC 中没有基因型差异。然而，在 FC 中，KO 小鼠的 P2 振幅有降低的趋势，这表明发育过程中唤醒和注意力可能会降低。Van der Molen 等人表明，FXS 中诱发反应的增强和习惯性的降低可能会导致听觉变化检测能力降低。[ 106 ]。这种感觉辨别缺陷可能会导致 FXS 的言语和语言异常。最近的一项人类研究表明，FXS 儿童的习惯和语言能力之间存在联系[ 107]。具体来说，研究表明，P1 对习惯化序列中后期刺激的反应较弱以及 P1 的习惯化较大与接受和表达语言能力的增强有关，这表明对重复音调的习惯会影响 FXS 儿童的语言能力。

Fmr1 KO 小鼠背景活动中伽马带功率增强
单一试验功率 (STP) 允许在刺激呈现期间识别持续的“背景活动”，因为它不能校正平均基线功率水平。有人建议，这种非锁相功率反映了相对较慢的整合过程，可能会影响刺激或响应处理[ 108 ]。这些过程包括自上而下和持续的注意力、决策和感知推理，并且被认为是由内在网络交互而不是外部刺激产生的[ 109、110 ]。我们的结果显示Fmr1中 STP 表型的发育波动与 WT 小鼠相比，KO 小鼠，其中青春期 KO 小鼠 (p30) 在 AC 和 FC 中的 ERP 和间隙 ASSR 刺激期间的 STP 增加。STP 的增加出现在伽玛波段（30-80 Hz），这与 Ethridge 等人的数据一致。患有 FXS 的人与通常发展控制的人相比 [ 45]。从青少年和年轻人记录的人类数据也显示，多种刺激类型的伽玛带 STP 升高。重要的是，伽玛能量的升高与智商和注意力分散有关。这些数据表明持续活动的增加可能是跨物种网络连接过度活跃的结果，并且对人类具有潜在的临床意义。表型在发育过程中波动的原因尚不清楚。目前尚不清楚 FXS 患者是否也会出现类似的年龄效应。对于神经发育障碍，有时很难区分突变的直接影响和活动水平的潜在补偿性（例如稳态）调整的影响。

之前的一项研究（Wen 等人，2019）报告称，成年Fmr1 KO 小鼠（FVB 品系，与此处使用的相同）的额叶皮层静息脑电图伽马功率增加[ 48 ]。在本研究中，我们没有观察到 STP 数据中伽马功率的增加。虽然静息脑电图和声音诱发的 STP 都可以被视为背景活动，但这两项研究之间的差异可以通过这些测量的计算方式来解释。静息脑电图是在没有任何声音刺激的情况下记录的，但计算出的 STP 是声音刺激期间的背景。与静息状态相比，动物在有声音的情况下可能处于不同的唤醒状态，导致观察到背景伽马活动的不同测量值之间存在差异。

Fmr1 KO 小鼠额叶皮层时间处理发育延迟
也许这项研究最令人惊讶的结果是，FC 中出现了时间处理的发育延迟，而 AC 中则没有。这些数据表明，FC 并非简单地从 AC 继承听觉响应，而是 FC 内的额外局部处理和/或绕过 AC 的听觉通路可能涉及在 FC 中产生锁相响应。关于 FC 听觉处理机制知之甚少。在人类 [ 75 ] 和小鼠脑电图记录 [ 72 ]中都可以看到强大的额叶皮层 ASSR 功率。事实上，ASSR 功率和精度的地形分布有利于这两个物种的更多额叶区域。金等人。[ 71 ]和黄等人。[ 72]表明，对小鼠基底核中 GABA 能小清蛋白神经元的光遗传学刺激优先增加额叶皮层 40 Hz ASSR 振荡。这表明 FC 中 ASSR 的独立调节在 FXS 的早期发育中可能是异常的。FC 可以稳健地安装 ASSR 并独立显示缺陷的想法得到了另外两条证据的支持。克拉克等人。在自身免疫性疾病小鼠模型中表明，FC 中的间隙处理受到影响，而 AC 中保持正常[ 57 ]。维泽扎克等人。据报道，在噪声引起的听力损失后，FC 而非 AC 中 ASSR 的恢复降低[ 55 ]。事实上，gap-ASSR 缺陷出现在 FC 的早期发育中，而不是Fmr1中的 ACKO 小鼠表明 FXS 中多种感觉模式的时间处理可能异常。如果在患有 FXS 的人类中观察到类似的时间处理发育区域差异，则这表明语音处理和语言功能可能会受到多种模式的影响 [ 111 ]。

FC 中异常时间处理的一个重要后果可能与 FC-AC 在发育过程中自上而下的相互作用如何发挥作用有关。FC 以任务和注意力依赖的方式诱导 AC 响应的自上而下的调节。弗里茨等人。假设 FC 根据任务和选择性注意力调节 AC 神经元感受野 [ 112]。FC-AC 连接及其语音调制也已在使用 FXS 的人体中进行了评估。语音产生取决于前馈控制以及 FC 和 AC 之间神经振荡的同步。具体来说，这两个区域的相互作用允许将从语音的输出副本生成的预期语音的推论放电与产生的实际语音声音进行比较，这是进行自适应调整以优化未来语音所必需的过程[ 113]。一项对人类利用说-听范式的研究发现，在言语产生之前的时间窗口中，与对照组相比，FXS 患者的言语前活动减少，包括额颞叶连接性，以及额叶伽马功率增加。这些差异导致言语难以理解，并与社交沟通缺陷增加相关[ 113 ]。张等人 (2021) 也提出了 FC 和 AC 之间的功能连接异常，他们发现Fmr1 KO 小鼠的远程连接减少[ 114]]。未来的研究将检查 FC 和 AC 在不同声音刺激范式（包括间隙 ASSR）下的相位连通性。总而言之，FC 和 AC 之间的连接对于塑造感觉反应至关重要，中断可能会导致言语和语言障碍。正如目前对小鼠的研究中所见，人类这两个区域之间的发育模式不匹配，可能会导致 FXS 的语言异常。

结论
我们发现 FXS 模型小鼠的听觉时间处理存在发育迟缓。p21-p30 窗口是Fmr1 KO 小鼠发育的关键时期，其特点是皮质过度兴奋和抑制性中间神经元功能降低 [ 48,59,115 ]。这种延迟发育与Fmr1 KO 小鼠的其他研究类似。例如，在体感皮层中，Fmr1 KO 小鼠表现出 GABA 能抑制成熟延迟和突触连接减少，最终正常化为成人的 WT 水平 [ 116 , 117]。大脑发育是一个精确的过程，由基因表达的精确提示阶段、分子引导提示和内在神经元活动决定[ 118 , 119 ]。这些发育阶段的时间安排（称为关键期）对于准确的神经元迁移、回路形成和突触细化至关重要[ 120]。关键时期时间线的破坏会导致行为表型的长期损害。尽管成人的反应可能正常化，但异常的关键期发展将对建立在正常反应发展基础上的行为产生长期影响。例如，FC 时间处理的发育迟缓可能会导致依赖于准确时间处理（例如语音、语言和双耳处理）的行为的长期异常。为了有效地治疗患有 FXS 的人类，必须了解可能用作临床结果指标的表型的发育轨迹，而不仅仅是成人比较。