一、简介
心律失常是心电活动起源或传导障碍引起的心脏脉搏频率或节律异常的临床综合征，是心源性猝死的重要原因。据统计，我国每年约有60万人死于心源性猝死，其中约90%是由恶性心律失常引起的。引文1 ]。心肌缺血是心律失常的常见原因[引文2 ]，缺血性心律失常的潜在机制相当复杂多样，仍需充分阐明。目前，在动物实验中，通常采用结扎冠状动脉前降支的方法来建立急性缺血性心律失常模型。但由于该模型存在创伤大、重复性差等问题，限制了人们对心律失常机制的研究，也不利于抗心律失常药物的研发。因此，迫切需要寻找一种稳定、有效、可重复的心律失常模型。异丙肾上腺素 (ISO) 作为一种非选择性 β-肾上腺素能受体激动剂，通过与心肌细胞上的 β 受体结合，可诱导心率、心肌收缩力和心脏传导增加。引文3-5 ]。由此，心肌血液中的氧供需平衡被打破，表现为心肌血液耗氧量增加，冠脉血有效灌注减少，这种平衡被广泛用于刺激心肌肥大和心肌损伤。引文6 ]。心肌损伤的发生可以调节体内交感神经系统，促进儿茶酚胺的释放，进一步改变心肌的电生理，导致室性心律失常（VA）的发生和发展。引文7、引文8 ]。此外，心肌损伤还可引起心肌疤痕和纤维化，从而改变心肌电生理传导，增加VA敏感性。引文9 ,引文10 ]。查阅大量ISO诱发心律失常相关文献可知，ISO作为实验动物心脏重构诱导剂，在动物实验中常用剂量为3mg/kg或5mg/kg，给药方式有两种：腹腔注射或皮下注射。引文11、引文12 ]。本实验将通过不同剂量、不同给药方式建立简单、可重复、稳定的SD大鼠心律失常模型，为进一步研究心律失常发病机制提供有力的动物模型。

2. 材料
2.1. 动物
将 50 只体重为 200 ± 20 g 的 SPF 雄性 Sprague Dawley 大鼠饲养在 12 小时光照/12 小时黑暗昼夜节律周期、温度 21–23 °C 和 55% 湿度下。所有大鼠均随意提供食物和水。大鼠由辽宁长生生物科技有限公司提供，实验动物质量证书编号：210726200100192861，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。本研究经河北中医学院伦理委员会批准，所有方法均按照相关指南和规定进行。本研究按照河北中医学院指南进行，并遵守ARRIVE指南。

2.2. 试剂和药物
盐酸异丙肾上腺素(上海禾丰药业有限公司，批号：5E20012)；肌酸激酶（CK；长春惠利生物科技有限公司，批号：A026）；心肌肌钙蛋白 I (cTnI) 试剂盒（Abcam，ab246529）；乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A020-2、A003-1、A012-1、A001- 3）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）试剂盒（新博生生物科技有限公司，批号：ERC102a、ERC003、ERC007）被使用。

2.3. 主要仪器
本研究使用的主要仪器为：生物功能实验系统BL-420F（成都泰盟软件有限公司）；电子天平一台（湖南仪器仪表总厂天平厂）；恒温水浴锅（常州华电有限公司）、AU-2700全自动生化分析仪、IX51型倒置显微镜（日本奥林巴斯）。

3. 方法
3.1. ISO准备
将 ISO 以 5 或 3 mg/kg 的浓度溶解在 0.9% NaCl 中，制备溶剂，并在 -20 °C 避光保存以备后用。

3.2. 动物模型与给药
在对实验动物进行治疗之前，建立动物的纳入和排除标准。具体而言，根据已发表的文献，基础心电图正常的大鼠可纳入本实验。心律失常是由于心脏电脉冲的频率、节律、起源、传导速度和激发顺序异常所致。排除心电图P波、QRS波、T波异常、PR间期延长、ST段改变或各类心律失常的大鼠。所有大鼠均用2%戊巴比妥钠（40 mg•kg −1，IP），固定仰卧位，连接BL-420F生物功能实验系统，连续测试30 min。对55只大鼠的心电图数据进行保存和分析后，3只大鼠出现偶发室性早搏，1只大鼠出现ST段异常，1只大鼠出现疑似右束支传导阻滞；这些老鼠因此被排除在外。其余50只正常大鼠被纳入进一步实验。

适应性饲养7 d后，将50只大鼠按随机数字表分为CON组和以下4个实验组（每组10只）： SC组（皮下注射5 mg/kg ISO，连续2 d ）、IP组（腹腔注射5 mg/kg ISO，连续2天），2+1组（皮下注射5 mg/kg ISO，连续2天，然后腹腔注射3 mg/kg ISO，连续1天） 、6+1组（5mg/kg ISO皮下注射连续6天，然后3mg/kg ISO腹腔注射1天）。ISO干预最后一天，各实验组大鼠均采用2%戊巴比妥钠（40 mg·kg −1，IP），固定仰卧位，连接BL-420F生物功能实验系统，注射ISO，60min内通过标准II导联心电图观察记录。心电图记录后，实验人员因皮肤捏捏反应消失、头颈及四肢肌肉松弛、呼吸深慢而平稳、角膜反射消失，确定大鼠仍处于麻醉状态。如果没有观察到这些症状，则给大鼠注射戊巴比妥钠（40 mg/kg，IP）。然后从大鼠的股动脉收集大约5ml的血液。在研究方案终止之前，根据AVMA 动物安乐死指南，用 2% 戊巴比妥钠（150 mg/kg，IP）对所有大鼠实施安乐死[引文13 ]。处死动物后，快速、细致地采集心脏标本用于组织病理学和生化分析。

3.3. 主要观察指标
3.3.1. 大鼠心律失常的观察和评分
连续记录诱导前后大鼠心电图，按照兰贝斯公约标准测定室性早搏（VP）、室性心动过速（VT）和心室颤动（VF）。QRS 波群的早期出现可用于识别 VP；非持续性VT（NSVT）表示VP连续发生次数少于15次；持续性室性心动过速（SVT）是指VP连续发生次数至少15次；心房与心室之间出现房室传导阻滞（AVB），冲动减慢或受阻。心律失常评分（严重程度）在基本评分系统下分为5级，如下：0=无心律失常，1=单VP，2=双VP，3=三VP或NSVT，4=SVT或AVB，5=死亡[引文14-16 ]。

3.3.2. 大鼠血清指标含量的检测
麻醉大鼠股动脉采血，4000r/min、-4℃离心10min，分离血清并保存。采用酶联免疫吸附法检测cTnI、TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，采用自动生化分析仪检测CK、LDH、SOD、MDA、NO的含量。

3.3.3. 大鼠心脏重量指数的计算
心电图记录60 min后处死大鼠，收集心脏，用冰冷生理盐水反复冲洗，滤纸吸干，电子天平称重。心脏重量指数（HWI）计算为心脏质量/体重。

3.3.4. 组织学分析
大鼠心肌组织常规脱水、固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）和Masson染色。光学显微镜下观察心肌组织形态变化。大鼠心室心肌Masson染色后，用Image Pro Plus 6.0软件计算组织胶原总面积和图像总面积，计算胶原体积分数(CVF)。CVF = 胶原蛋白总面积/图像总面积。

3.4. 统计分析
使用SPSS统计软件进行统计分析。计数资料以百分比（%）表示，两组间比较采用卡方检验。测量数据表示为平均值±标准差(x±s)。如果满足正态性，则使用 Levene 检验来检验两组之间的方差齐性。若方差齐性则两组间比较采用Tukey检验，多组间比较采用单因素方差分析。非正态分布的测量数据用中位数和四分位数[M (P 25, P 75 )]表示，并采用Kruskal-Wallis H检验。p  < 0.05 被认为表明存在显着差异。

4. 结果
4.1. 各组大鼠心律失常发生情况比较
4.1.1. ISO对SD大鼠的一般影响
与CON组相比，所有模型大鼠均出现呼吸加快、心率加快、心尖搏动增强、疲乏、食欲不振、不同程度口渴等症状。实验中无大鼠死亡，模型大鼠存活率为100%（n  =50）。

4.1.2. 各组大鼠心电图波形变化
与对照组心电图相比，4个实验组大鼠心电图均表现出不同程度的心律失常。SC组和IP组大鼠心电图仅显示VP和ST段压低，而2+1和6+1组大鼠心电图显示VP和NSVT。6+1组大鼠出现SVT，且该组心律失常程度明显加重（图1）。

4.1.3. 各组大鼠心律失常的发生情况
 与 CON 组相比，SC 组的 VP 和/或 VT 发生率显着增加（p  < 0.01），且 VP 发生率显着不同（p < 0.01）。此外，IP 组和 CON 组之间无显着性差异（p  > 0.05），且 2+1 组和 6+1 组 VP 和/或 VT 发生率显着高于 CON 组（p > 0.05）。  < 0.01）。SC 组和 2 + 1 组之间 VP 和/或 VT 的发生率无显着差异（p  > 0.05），但 6 + 1 组的 VP 和/或 VT 发生率显着高于 SC 组（p > 0.05）。 < 0.01）。2 + 1 组和 6 + 1 组 VP 和/或 VT 发生率显着高于 IP 组（p  < 0.01），6 + 1 组 VP 和/或 VT 发生率显着高于 IP 组（p < 0.01）。  < 0.01) 显着高于 2 + 1 组 (表格1）。

4.2. 各组大鼠心律失常严重程度比较
4.2.1. 心律失常评分
CON组心律失常评分与SC、IP、2+1组无显着性差异（p  >0.05），但显着低于6+1组（p  <0.01）。SC组心律失常评分与IP组和2+1组无显着差异（p  >0.05），但显着低于6+1组（p  <0.01）。IP组心律失常评分与2+1组无显着差异（p  >0.05），但显着低于6+1组（p  <0.01）。6+1组心律失常评分未显着高于2+1组( p  >0.05)(图2）。

4.2.2. SVT和NSVT的比例
对照组和SC组大鼠均未出现VT。IP、2+1、6+1组大鼠VT程度明显高于CON组大鼠，且IP、2+1、6+1组大鼠VT程度逐渐降低与 SC 组大鼠相比有所增加。2+1组和6+1组大鼠SVT和NSVT比例显着高于IP组。6 + 1 组获得的 SVT 和 NSVT 比例显着高于 2 + 1 组（图3）。

4.3. 各组大鼠HWI比较
四个实验组大鼠的 HWI 均显着高于 CON 组大鼠（p  < 0.01）。IP组和2+1组大鼠的HWI与SC组大鼠的HWI差异无统计学意义（p  >0.05），且6+1组大鼠的HWI显着高于SC组大鼠。 SC 组（p  < 0.01）。IP组大鼠的HWI与2+1组大鼠的HWI差异无统计学意义（p  >0.05），但显着低于6+1组大鼠（p  <0.01）。6+1组大鼠的HWI显着高于2+1组大鼠( p  <0.01)(图4）。

4.4. 心肌组织形态学
CON组心肌纤维边界清晰、排列规则、轮廓清晰、染色均匀、无渗出物及炎性细胞浸润。4个实验组大鼠心肌均出现不同程度的纤维排列紊乱、边界不清、断裂、染色深浅不均、局部溶解性坏死。对实验组的分析显示，属于6+1组的大鼠表现出明显的心肌纤维排列紊乱和溶解性坏死增加（图5）。

图5 HE和Masson三色染色观察大鼠心脏组织病理变化(×200)( n  =10/组)。A–E：分别为 CON、SC、IP、2 + 1 和 6 + 1 组（HE 染色）。白色箭头代表炎症细胞浸润、心肌细胞溶解和坏死。F–J：分别为 CON、SC、IP、2 + 1 和 6 + 1 组（Masson 染色）。黑色箭头代表胶原纤维组织增生，纤维排列紊乱。通过 Image J 测量 Masson 染色中胶原蛋白的面积（%）。 注：数据以平均值±SEM（ n  = 10）表示。使用单向方差分析进行分析： 与 CON 组相比， * p  < 0.05 和 ** p < 0.01， # p  < 0.05 和## 与SC组相比p <0.01， 与IP组相比△△ p <0.01， 与2+1组相比□ p <0.01。

图5. HE和Masson三色染色观察大鼠心脏组织病理变化(×200)(n = 10/组)。 A–E：分别为 CON、SC、IP、2 + 1 和 6 + 1 组（HE 染色）。 白色箭头代表炎症细胞浸润、心肌细胞溶解和坏死。 F–J：分别为 CON、SC、IP、2 + 1 和 6 + 1 组（Masson 染色）。 黑色箭头代表胶原纤维组织增生，纤维排列紊乱。 通过 Image J 测量 Masson 染色中胶原蛋白的面积 (%)。 注：数据以平均值±SEM (n = 10) 表示。 使用单因素方差分析进行分析：与 CON 组相比，*p < 0.05 和 **p < 0.01，与 SC 组相比，#p < 0.05 和 ##p < 0.01，与 SC 组相比，△△p < 0.01 IP组，与2+1组相比，□p<0.01。
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4.5. 各组心肌损伤情况比较
4.5.1. 心肌酶的变化
与 CON 组大鼠相比，4 个实验组大鼠血清 CK 和 LDH 水平均有不同程度升高（p  < 0.01 或p  < 0.05），且各组大鼠血清 CK 和 LDH 水平无显着性差异。 SC 组和 IP、2 + 1 和 6 + 1 组 ( p  > 0.05)。2+1组和6+1组大鼠血清CK和LDH水平高于IP组大鼠（p  <0.01或p  <0.05），且各组之间无显着性差异。 2 + 1 和 6 + 1 组 ( p  > 0.05) (图6）。

4.5.2. cTnl 的变化
4 个实验组血清 cTnl 水平均高于 CON 组（p  < 0.01），且 4 个实验组之间无显着性差异（p  > 0.05）。图6）。

4.6. 各组大鼠氧化应激比较
 与CON组大鼠相比，6+1组大鼠血清SOD水平显着降低（p  <0.01），MDA和NO水平显着升高（p <0.05）。其余各组均呈现变化趋势（p  >0.05）；与 2+1 组相比，6+1 组 SOD 水平较低，MDA、NO 水平较高，但差异不显着（p  > 0.05）（图7）。

4.7. 血清炎症因子水平比较
SC、IP、2+1 组血清 TNF-α、IL-6 水平与 CON 组差异无统计学意义（p  > 0.05），且 6+1 组明显高于 CON 组。 CON组中的那些（p  <0.05）。SC 组 TNF-α 和 IL-6 水平与 IP 组和 2+1 组差异无统计学意义（p  > 0.05），但 6+1 组 TNF-α 水平显着高于 IP 组和 2+1 组。 SC 组（p  < 0.05）。2+1 组 TNF-α、IL-6 水平与 IP 组差异无统计学意义（p  > 0.05），且 6+1 组 TNF-α 水平显着高于 IP 组。 IP 组 ( p < 0.05）。此外，6+1组IL-6水平显着高于2+1组（p  <0.05）。6+1组TNF-α水平均有所升高，但与2+1组比较差异无统计学意义（p  >0.05）。实验组大鼠 IL-1β 水平高于 CON 组大鼠，但差异不显着（p  > 0.05）（图8）。

5. 讨论
心律失常被认为是常见的心血管疾病之一，影响着全球数百万人的生命和健康。目前，在动物实验中，可以通过多种方法构建心律失常模型，包括通过颈静脉注射氯化钡诱发大鼠心律失常。引文17 ]、结扎左冠状动脉诱发心律失常[引文18 ]，并在Langendorff灌注条件下进行体外突发快速电刺激诱发心律失常[引文19 ]。但这些方法大多科研成本高、技术难度大、操作复杂、实验动物成活率低、重复性差，给推广应用带来了困难。因此，构建简单、可靠、重复性高的心律失常模型就显得尤为必要。ISO是一种儿茶酚胺类药物，主要作用于心脏β受体，可引起比较强烈的心血管反应。近年来，ISO已成功构建心肌肥厚等多种心血管疾病大鼠模型。引文20–22 ]，心肌损伤[引文23、引文24 ]、心肌梗塞[引文4 ,引文25 ,引文26 ]、心肌纤维化[引文27-29 ]，和心力衰竭[引文30 ]。然而，很少有报道描述使用 ISO 直接构建心律失常模型。本实验建立了相对稳定的心律失常模型，并进一步探讨了其潜在机制。

皮下注射ISO 6 d，腹腔注射ISO 1 d（“6+1”模式）可以产生理想的SD大鼠心律失常模型。ISO是一种β受体激动剂，可刺激心肌细胞的β1受体，诱发心率加快、传导加速、耗氧量增加以及慢性缺血缺氧。查阅相关文献可知，ISO可引起动物心律失常，其给药方式包括SC[引文4 ,引文11、引文23、引文31-33 ]，和IP [引文12、引文20 ,引文30 ,引文34 ]。由于腹膜面积大，肠系膜血供丰富，ISO腹腔注射后可迅速吸收，短时间内在体内达到较高的血药浓度，能迅速刺激大鼠心肌。但药物代谢也快，因此药物作用持续时间短。相比之下，SC具有吸收慢、作用时间长、作用持久的优点，对大鼠心肌有相对慢性的刺激作用。因此，根据不同部位注射药物的生物利用度不同[引文35]，我们的研究小组决定在本次实验中采用两种给药方式。即反复皮下注射ISO对心肌细胞造成慢性损伤和单次腹腔注射ISO造成急性心肌刺激，探讨两种给药方式能否构建稳定、可持续的心律失常模型。心电图和心律失常发生率显示，SC联合IP给药的效果优于单一给药途径，且“6+1”模式优于“2+1”模式。单独给药方式与CON组心律失常评分及VT比例无显着差异，但联合给药效果明显；尤其，“6+1”模式与心律失常评分显着升高以及SVT和NSVT比例显着增加相关。“6+1”模式心律失常评分显着提高，SVT和NSVT比例增加，心律失常发生率100%，VT和AVB现象明显，表明该模式优于“2+1”模式模式和“6+1”模式可以建立稳定的心律失常模型。

异丙肾上腺素引起SD大鼠心律失常的机制可能与心肌细胞损伤有关。ISO可使血压升高，心脏压力负荷增加，引起心肌细胞代偿性肥大，这些作用使细胞结构发生改变，心肌体积和质量增加，HWI增加。与文献报道类似[引文28]，本研究实验组尤其是6+1组大鼠的HWI显着高于CON组大鼠，这表明ISO“6+1”模式引起更严重的肥厚对心肌细胞的损害。HE和Masson染色结果证实2+1组和6+1组大鼠心肌细胞体积增大、排列紊乱、空泡化、出现间质水肿和中性粒细胞浸润，且这种影响在组中更为明显。 6+1组。心肌细胞损伤导致心肌酶溢出至血液中，导致血清CK、LDH水平升高，且升高程度与损伤程度呈正相关。本实验中，各组大鼠血清CK、LDH水平，尤其是2+1组和6+1组明显高于CON组大鼠，提示反复ISO刺激对心肌细胞造成更严重的损伤。Thangayan R的研究证明了这个结论[引文31 ]。cTnI是反映心肌细胞损伤最敏感和特异的金指标。本研究中观察到的各组大鼠cTnI的升高进一步证明6+1组表现出更严重的心肌细胞损伤，这与刘B的研究结果一致[引文32 ]。形态学指标、酶学指标、心肌蛋白指标均证实“6+1”方法造成的心肌细胞损伤更严重，更容易诱发心律失常。

氧化应激（OS）和炎症引起的心肌细胞损伤可能是心律失常发生的重要机制。ISO刺激心肌细胞引起缺血、缺氧。缺氧破坏了细胞中自由基产生和清除系统之间的平衡。在此过程中，SOD、CAT、GPX等抗氧化酶的数量和活性下降，MDA等过氧化物逐渐积累。引文36 ]。自由基的过量产生导致OS和心肌细胞损伤。缺氧可诱导中性粒细胞浸润并释放大量炎症因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α。与文献报道类似[引文37、引文[38 ]，本研究结果显示，6+1组呈现SOD水平显着降低，MDA和NO水平显着升高，TNF-α和IL-6水平显着升高，但IL-1β的升高并未增加。显着，可能与样本量和采样地点有关。SOD反映了机体清除自由基的能力，而MDA和NO则反映了自由基对细胞的攻击程度。TNF-α和IL-6是体内炎症标志物，我们的研究结果表明“6+1”组大鼠的心肌细胞处于更严重的OS和炎症状态。OS刺激机体的防御性炎症反应并产生更多的炎症因子，炎症因子促进活性氧的产生。引文39 ]。因此，OS与炎症相互作用形成正反馈环，二者与细胞损伤相互作用形成正反馈环，逐渐加重心肌细胞损伤。

综上所述，ISO皮下和腹腔注射相结合比单一注射途径更容易诱发心律失常，且ISO“6+1”模式可以产生理想的大鼠心律失常模型。具体而言，“6+1”模式诱发心肌细胞OS和炎症反应，这些作用导致心肌细胞氧化损伤和炎症损伤，从而诱发心肌组织的病理改变，导致心肌酶和肌钙蛋白升高，诱发更严重的心肌损伤。心律失常。但本研究的局限性在于对ISO“6+1”模式致SD大鼠心律失常的机制研究不够深入。未来，我们团队将进一步优化实验方案，利用PCR深化氧化应激或炎症机制的研究。