介绍
早期炎症性关节炎 (EIA) 可描述为炎症特征持续时间超过 6 周但少于 1-2 年。1-3如果此类患者不符合类风湿关节炎 (RA)、银屑病关节炎 (PsA) 或中轴和外周脊柱关节炎 (SpA) 的诊断标准，则通常将其定义为血清阴性未分化关节炎。

人们越来越认识到，已确定的 RA 和 SpA/PsA 之间在临床表现、遗传学、血清学和细胞特征方面存在明显差异，4-6对未分化关节炎或血清阴性 RA 的研究要少得多。与 RA 不同，SpA/PsA 患者可能与关节外疾病有明显关联（牛皮癣、炎症性肠病、葡萄膜炎）。7此外，银屑病关节炎与许多伴有代谢综合征和心血管疾病的患者体重指数增加有关。8血清阳性 (ACPA+) RA 与吸烟和HLADRB1共享表位等位基因之间存在密切关联。3 9-12在血清阴性 RA 中未观察到这些关联。相反，有人认为HLADRB3和干扰素调节因子 5 ( IRF5 ) 可能易患血清阴性 RA。13-15 目前还不清楚血清阴性 RA 是一种还是多种疾病实体。3最后，我们最近报告了已确诊的 RA 与 PsA 患者之间滑膜组织驻留记忆 T 细胞组成的定量差异。5

具有广泛统一活性的关键细胞因子途径已被确定，其中 1 型途径以干扰素-γ (IFNγ) 为代表，17 型途径以 IL-17A 为代表。16已知这两种途径在炎症性关节炎患者的关节中表达。IFNγ 是骨髓细胞和 I/II 类 MHC 表达的有效激活剂，突出了其促炎作用，但应注意的是，其在炎性关节炎中致病作用的某些方面仍未完全阐明。17 18 IL-17A 是一种促炎细胞因子，对血管生成、中性粒细胞浸润和基质细胞活化具有广泛影响。19-21日在炎症性关节炎的情况下，IL-17A 可以与 TNFα 协同作用，促进破骨细胞活化22并诱导成纤维细胞和滑膜细胞产生促炎细胞因子和趋化因子。23–27矛盾的是，与 SpA 相关的是，IL-17A 也被证明可以促进 HLA-B27/hβ(2) m 转基因大鼠的新骨形成。28我们之前的工作表明，具有组织驻留特征的 IL-17A+CD8+ T 细胞在已确诊的 PsA/SpA 患者的滑液 (SF) 中富集，但在 RA 患者中却没有富集，这表明 IL-17 表达是一种影响因素。这两种疾病之间的重要鉴别途径。5 29 30

为了增强我们对可能在炎症性关节炎疾病过程早期发挥作用的淋巴细胞因子途径的理解，我们研究了 EIA 患者发炎关节中 IL-17、IFNγ 和 TNFα 的 T 细胞表达。

材料和方法
临床诊断
我们招募了患有早期炎症性关节炎的患者，我们将其定义为持续时间不超过 12 个月的关节炎症状，初步临床诊断为炎症性关节炎，包括 RA、SpA（包括 PsA、肠相关 IA 和反应性关节炎）且血清阴性未分化炎症性关节炎（UIA）。患者样本于 2014 年 2 月至 2021 年 5 月期间采集（在线补充表 1）。最终的临床诊断由两名研究人员（BWK 和 BM）独立应用，他们对彼此的诊断和研究实验室数据不知情，使用患者电子记录中的临床、影像和实验室数据，包括类风湿因子、ACPA 和 ANA 自身抗体。对诊断进行比较，并对诊断略有不同的两名患者进行讨论，以完成最终的共识诊断。从采集 SF 样本到最终诊断，诊断变化为：四名患者最初诊断为反应性关节炎，之前有轻微的感染性关节炎病史，发展为未分化炎症性关节炎 (UIA) 疾病模式，一名患者诊断为反应性关节炎患有 UIA 且随后确认有先前感染并最终诊断为反应性关节炎，

样品和细胞分离
经盖伊医院风湿病科书面知情同意后，收集了 EIA 患者的 SF 样本（REC 参考号 06/Q0705/20 和 17/LO/1940）。患者人口统计和临床信息如表1所示。使用 Lymphoprep (Alere Technologies) 通过密度梯度离心分离 SF 单核细胞 (SFMC)，并冷冻保存在液氮中直至使用。

流式细胞仪分析
对于细胞内细胞因子染色，将 SFMC 解冻，休息 1 小时，然后在含有佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯 (PMA) (50 ng) 的培养基（RPMI 1640，含 1% 青霉素/链球菌/谷氨酰胺和 10% 胎牛血清 (FCS)）中刺激/mL) 和离子霉素 (750 ng/mL，均为 Sigma-Aldrich)，在 GolgiStop（莫能菌素，根据制造商的推荐，BD Biosciences）存在下于 37°C 处理 3 小时。洗涤细胞并用可固定活力染料（LIVE/DEAD eFluor780，eBioscience）标记，同时用小鼠抗人抗体进行细胞外染色（见表2）了解详情），4°C 下 20 分钟。将细胞用 2% 多聚甲醛在 4°C 下固定 15 分钟，然后使用 0.5% 皂苷 (Sigma-Aldrich) 透化，并用小鼠抗人抗体在 4°C 下染色 30 分钟。对于荧光负 (FM) 对照染色，按上述方法合并小份样品并进行染色，但不添加抗细胞因子 mAb。使用 FACS CantoII 或 LSRFortessa (BD Biosciences) 采集样品。使用FlowJo软件（V.10.8.1，TreeStar）分析流式细胞术数据。绝大多数样本是在 2018 年 1 月至 2019 年 12 月期间进行染色和采集的。采集完所有样本后，将建立并应用分析流程，以确保所有样本均以相同的方式进行门控和分析（分析在 2020 年 7 月至 2020 年 7 月至2021 年 7 月）。为了这，在线补充图1）。

自身抗体分析
几乎所有患者 (90%) 在 SF 采样时在我们中心使用 Elia 测试（Thermo-Fisher，使用 Phadia250 仪器）进行了常规 ACPA 测试。为了扩展我们对血清阴性未分化关节炎患者的表征，我们还在保存血清的患者中测定了 ACPA 抗体和抗 CarP 抗体。这些 ACPA IgG 抗体水平是使用内部 ELISA 测定的，基本上如前所述。31简而言之，将链霉亲和素包被的板与生物素化的环瓜氨酸肽4或精氨酸对照肽一起孵育。在每个连续步骤之间，用 PBS/0.05% Tween 将板洗涤五次。将在 PBS/1% BSA/0.05% Tween 中按 1/50 稀释的血清样品添加到板中，并在 37°C 下孵育 1 小时。接下来，如上所述检测ACPA IgG。ACPA IgG 结合相对于标准曲线进行定量，并以每毫升任意单位表示。如上所述确定基于健康对照的截止值。如果 ACPA 水平高于截止值，并且比对照肽高 >2 倍，则患者样本被视为阳性。

如前所述，使用内部 ELISA 检测抗 CarP IgG 抗体水平。32简而言之，Nunc Maxisorp 板 (Thermofisher) 涂有氨甲酰化 FCS 或未修饰的 FCS。在每个连续步骤之间，使用 PBS/0.05% Tween (Sigma) 将板洗涤三次。将板在 4°C 下封闭 6 小时，然后与 1/50 稀释血清在 4°C 下孵育过夜。孵育后，使用兔抗人 IgG-HRP (Dako) 检测 IgG 水平。使用 2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)/0.015% H2O2（均来自 Merck）对板进行显色，并在 415 nm 处测量吸光度。抗体结合相对于标准线进行定量，并以每毫升任意单位表示。接下来，从与氨甲酰化蛋白质结合的抗体中减去与对照蛋白质结合的抗体。

统计分析
图表是用 GraphPad Prism V.9.5.1 构建的。使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较检验进行统计分析。如果 p<0.05，P 值被认为是显着的。

结果
我们招募了 45 名症状不超过 12 个月的早期炎症性关节炎患者，其临床治疗需要从膝关节抽吸 SF。5 名患者拒绝检测 SF 样本，9 名患者未产生足够的 SFMC 进行分析，1 名患者的诊断仍不确定。在分析的 30 名患者中，14 名最终诊断为 SpA（7 名 PsA、2 名肠病性 SpA、5 名反应性关节炎）、10 名血清阴性未分化炎症关节炎 (UIA) 和 6 名血清阳性 RA。30 名患者中有 16 名可以获得用于详细自身抗体分析的血清。30 个测试样本中 SF 采集时的患者人口统计学、血清学和临床参数如表 1所示。最终诊断是由两名对研究实验室数据不知情的临床医生在症状出现后至少 12 个月（范围 12-48 个月）独立做出的。在完成流式细胞仪采集和分析后，最终的临床诊断与实验室数据相关联。

最近的研究结果表明，一些血清阴性的未分化炎症性关节炎患者的抗体呈阳性，例如抗氨甲酰化蛋白（抗 CarP），但这些抗体尚未在临床上进行常规检测。33除了我们的常规实验室 ACPA 测试外，我们还使用内部检测评估了 30 名患者中 16 名患者的 ACPA 和抗 CarP 抗体的血清水平。在检测样本中，后来诊断为 SpA 的患者的血清均为 ACPA 和抗 CarP 阴性 (n=7)，而后来诊断为血清阴性 UIA 的患者 (n=5) 的血清均为 ACPA 阴性，其中 1 名患者检测呈阳性仅用于抗CarP。在后来诊断为血清阳性 RA 的患者中，四份血清样本中 ACPA 和抗 CarP 检测结果分别呈三分之三和两份。

为了研究表达特定细胞因子的 CD8+ 或 CD4+ T 淋巴细胞的存在，将 SFMC 解冻、休息并在 GolgiStop 存在下用 PMA 和离子霉素刺激 3 小时，然后对适当的标记进行染色。

总体而言，与后来诊断为血清阴性 UIA 的组相比，SpA 组中 IL-17A+CD8+ T 细胞的百分比显着富集 (p=0.0054)（图 1A 和 C）。滑膜 IL-17A+CD4+ T 细胞也观察到类似的模式 (p=0.0253)（图 1B 和 D）。后来诊断为血清阳性 RA 的一小群患者 (n=6) 的 IL-17A+CD8+ T 细胞水平均较低，而 IL-17A+CD4+ T 细胞的百分比与 SpA 相似。

EIA 患者滑液中存在 IL-17A+ CD8+ 或 CD4+ T 细胞。在 GolgiStop 存在下用 PMA 和离子霉素刺激 SFMC 3 小时，然后染色以确定是否存在产生 IL-17A 的 T 细胞。代表性点图（A、B）和累积数据（C、D）显示，EIA 患者滑液中的 CD8+（A、C）和 CD4+（B、D）T 细胞中存在 IL-17A+ 细胞。随后诊断为患有 SpA（n=14，蓝色圆圈）、血清阴性 UIA（n=10，红色方块）或血清阳性 RA（n=6，黄色三角形）。使用 Kruskal-Wallis 检验分析数据。EIA，早期炎症性关节炎；PMA、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯；RA，类风湿性关节炎；SFMC，滑液单核细胞；SpA，脊柱关节炎；UIA，未分化炎症性关节炎。*p<0.05；** p < 0.01。

在线补充图 2显示了三个患者亚组中滑膜 Tc17 或 Th17 细胞频率与年龄、药物、性别或 SpA 亚组相关的各个数据点。鉴于每组的异质性和相对较小的样本量，无法进行统计分析，但也无法辨别直接趋势。我们还分析了％Tc17细胞与首次症状出现的时间或C反应蛋白水平之间是否存在任何关系，但没有发现统计学意义（网上补充图3）。发现 %Th17 细胞与症状出现后的时间呈负相关。最后，我们分析了 EIA SF 样本中 Tc17 和 Th17 细胞之间是否存在相关性，并发现当我们比较所有样本 (n=30) 时存在显着相关性，但当我们仅包含 SpA 子集 (n=14) 时则没有发现显着相关性。可能是由于 n 数较低（在线补充图 4）。

后来诊断为血清阳性 RA 的 EIA 患者与 SpA (p=0.0138) 和血清阴性 UIA (p=0.0016) 组相比，滑膜 IFNγ+CD8+ T 细胞的百分比显着更高，与血清阴性组相比，IFNγ+CD4+ T 细胞的百分比显着更高UIA (p=0.0089)（图 2）。

EIA 患者滑液中存在 IFNγ+ CD8+ 或 CD4+ T 细胞。在 GolgiStop 存在下，用 PMA 和离子霉素刺激 SFMC 3 小时，然后对产生 IFNγ 的 T 细胞进行染色。代表性点图（A、B）和累积数据（C、D）显示，随后接受 EIA 治疗的患者滑液中的 CD8+（A、C）和 CD4+（B、D）T 细胞中存在 IFNγ+ 细胞诊断为 SpA（n=14，蓝色圆圈）、血清阴性 UIA（n=10，红色方块）或血清阳性 RA（n=6，黄色三角形）。使用 Kruskal-Wallis 检验分析数据。EIA，早期炎症性关节炎；PMA、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯；RA，类风湿性关节炎；SFMC，滑液单核细胞；SpA，脊柱关节炎。*p<0.05；** p < 0.01。

在后来诊断为 SpA、血清阴性 UIA 或血清阳性 RA 的 EIA 患者之间，滑膜 TNFα+CD8+ 或 CD4+ T 细胞的百分比没有差异（图 3）。

EIA 患者滑液中存在 TNFα+ CD8+ 或 CD4+ T 细胞。在 GolgiStop 存在下，用 PMA 和离子霉素刺激 SFMC 3 小时，然后对产生 TNFα 的 T 细胞进行染色。代表性点图（A、B）和累积数据（C、D）显示，随后接受 EIA 治疗的患者滑液中的 CD8+（A、C）和 CD4+（B、D）T 细胞中存在 TNFα+ 细胞诊断为 SpA（n=14，蓝色圆圈）、血清阴性 UIA（n=10，红色方块）或血清阳性 RA（n=6，黄色三角形）。使用 Kruskal-Wallis 检验分析数据。EIA，早期炎症性关节炎；PMA、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯；RA，类风湿性关节炎；SFMC，滑液单核细胞；SpA，脊柱关节炎；UIA，未分化炎症性关节炎。

讨论
目前，我们对驱动 SpA 和血清阴性 UIA 早期的免疫机制的理解还不完整。最近的证据表明，现在有更多的患者出现血清阴性 UIA 模式，这可能与吸烟减少和人群肥胖增加有关。34因此，更深入地了解不同形式的炎症性关节炎的潜在免疫病理学非常重要。在本报告中，我们重点关注了两种关键的功能性免疫途径，即 1 型（以 IFNγ 表达为特征）和 17 型（其中 IL-17A 是标志性细胞因子），并研究了这些途径是否存在于不同类型 EIA 疾病过程的早期。 。

我们的数据表明，早期 SpA（包括 PsA 和外周 SpA）患者中 SF IL-17A+CD8+ (Tc17) T 细胞的频率与血清阴性 UIA 组相比显着增加，并且与较小的血清阳性 RA 组相比数量增加。我们之前已经证明，与 RA 5 29 30相比，已建立的 SpA 中滑膜 Tc17 频率显着升高，但 Th17 细胞频率相似，29 30表明我们在 EIA 中显示的模式随着时间的推移持续存在，尽管已建立的关节炎组中的大多数患者接受 DMARD和生物疗法。

相比之下，我们发现，与血清阴性 UIA 和 SpA 组相比，早期血清阳性 RA 患者中 1 型 CD8+IFNγ+ SF T 细胞的百分比显着更高，并且与血清阴性 UIA 组相比，早期 RA 中 CD4+IFNγ+ SF T 细胞的百分比显着更高。我们对最终诊断为 RA 的 EIA 患者中 CD8+ 和 CD4+ IFNγ+ SF 细胞升高的发现支持了之前关于血清阳性 RA 中 1 型/IFNγ 特征增加的报道。35–37此外，最近的两项研究报告称，ACPA+RA 患者的血液和关节中存在克隆扩增的细胞毒性 CD8+ 和 CD4+ T 细胞。38 39细胞毒性 CD8+T 细胞被瓜氨酸抗原以 HLA I 类依赖性方式激活，导致促炎和细胞溶解介质（IFNγ 和/或 GZMB）的表达38而细胞毒性 CD4+T 细胞的特征是 GZMB+PRF1+、Hobit+、NKG7高和 GPR56+ 谱。39我们的研究重点是表达 1 型和 17 型细胞因子的 T 细胞，没有研究细胞毒性细胞亚群。

我们的研究是分析广泛的早期疾病患者滑膜免疫病理学的少数研究之一。先前的 EIA 研究经常比较血清阳性或血清阴性 RA 患者的结局和病理学，不包括 PsA 或外周 SpA。40 41

重要的是，我们的数据显示，与研究较少的 PsA/SpA 和血清阴性 UIA 组相比，经过充分研究的血清阳性 RA 组之间的早期疾病存在显着差异。由于没有明确的分类标准，后一组患者很难研究，但由于这些患者在 EIA 服务中越来越常见，所以研究起来很重要。34我们发现，血清阴性 UIA 组的特点是表达 IL-17A 和 IFNγ 的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞频率较低。所有组中 TNFα 表达细胞的水平没有统计学差异，但在血清阴性 UIA 组中再次出现在其他两组的较低范围内。

我们和其他人在早期和已建立的 IA 中显示的关键免疫途径的这些差异是否具有临床意义？最明显的临床关系是 SpA 对 IL-17A 抑制治疗的良好反应，而其他类型的炎症性关节炎的改善则不太明显。42 43我们发现 Tc17 通路在早期 SpA 中活跃，这可能部分有助于解释这些对 IL-17 抑制反应的差异。44相反，大多数关节炎类型对 TNF 的抑制有反应，45在此测试的所有关节炎类型中，TNF 的表达水平相似。

我们研究的一个局限性是它包含的人数相对较少，特别是在血清阳性 RA 组中，这使得一些比较变得困难。此外，我们没有获得有关患者 HLA-B27 状态的信息，而这可能有助于 SpA 患者的诊断。最后，在 SpA 中，人们还认识到许多先天淋巴细胞，如 NK、γ δ、ILC 和 MAIT 细胞表达 17 型反应的特征，而我们关注的是传统的适应性 T 细胞。这可能低估了 SpA 中 17 型反应的广度。

结论
总之，我们的数据表明，关键的 1 型和 Tc17 免疫激活途径（之前被证明分别存在于已建立的血清阳性 RA 和外周 SpA/PsA 中）在疾病过程的早期阶段也存在于这些类型的炎症性关节炎中。这些发现进一步证明 SpA、血清阴性 UIA 和血清阳性 RA 的免疫病理学存在明显差异。