背景
肠脑轴 (GBA) 描述了胃肠道 (GI) 系统和中枢神经系统 (CNS) 之间的双向通讯（Pavlov 和 Tracey 2012；Sahasrabudhe 等人2023；Breit 等人2018）。迷走神经是肠脑轴的主要神经元分支，包含传入和传出纤维。迷走神经传入神经元 (VAN) 将化学感应信号从外周传递到中枢神经系统 (Raybould 和 Zumpano 2021）。VAN 的神经元细胞体位于邻近颈动脉的结状神经节中。VAN 支配胃肠道内壁，表达多种能够感知化学信号（例如细菌代谢物和激素）以及内脏感觉信号（例如机械拉伸）的受体（Li 2007；Egerod 等人2018；Bai 等）2019年）。许多关于 GBA 的知识都是通过体内模型产生的，研究人员的目标是解耦从外周到中枢神经系统的信号通路。虽然体内研究提供了最高的生物学相关性，但控制大量实验变量的困难使科学过程变得混乱。在这种情况下，体外模型更适合分离 VAN 在感知和向 CNS 传递感觉信息方面的作用。

基于微流体的方法，广泛地称为“芯片上的器官”或微生理系统，越来越多地用于重现神经元的解剖布局，其中神经元过程和体细胞可能位于远端位置，因此暴露于不同的线索（Taylor等人，2003）。这些平台通常使用软光刻技术制造，涉及将模制聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘合到载玻片上，其中两个或多个细胞培养室通过微通道阵列互连。在这些平台中，神经元被播种到其中一个室中，神经元突起通过通道生长到相邻的室中。调整微通道尺寸以将细胞体限制在一个室中，并允许神经元投射延伸到另一室中（Goshi et al. 2022）。这些平台已用于模拟各种生理现象，包括神经网络的培养、研究在神经变性中发挥作用的异常蛋白的运输、研究谷氨酸诱导的兴奋性毒性的传播以及非神经元细胞的神经支配（Virlogeux 等人， 2018 年；Peyrin 等人，2011 年；Iannielli 等人，2019 年；Polanco 等人，2018 年；Urrea 等人，2018 年；Brahic 等人，2016 年；Takeda 等人，2015 年；Song 等人，2014年； Samson 等人，2016 年；Southam 等人，2013 年；Bellmann 等人，2019 年）。

在这里，我们结合了微流体方法和迷走神经传入神经元培养（Goshi et al. 2022；Girardi et al. 2023 ）），创建一种工具来研究 GBA 中迷走神经传入神经元的作用，同时排除体内存在的循环和内分泌系统的混杂信号。具体来说，我们报告了一种微流体装置，该装置在物理上分离 VAN 胞体和神经突末端，使它们独立地暴露于各种刺激，使我们能够独立地探测两者。在研究了微通道几何形状对神经突生长的影响后，我们证明了 VAN 能够摄取并定向运输经过验证的逆行示踪剂霍乱毒素 B (CTB)，从远端神经突到体细胞。我们展示了将体细胞和神经突末端分别暴露于机械和生化刺激下 VAN 的电生理反应。最后，

方法
微流控装置制造
制造微流体装置来分离 VAN 胞体和神经突末端。这是通过使用通过微通道连接的两室装置来实现的。腔室高 70 μm，微通道尺寸为 10 μm × 7 μm（宽x高），长度为 500 μm。两个同心室（内室为细胞体；外室为神经突末端）由32个径向微通道连接。

微流体装置是用标准软光刻技术制造的。简而言之，母模是通过在硅片上光刻图案化两层 SU-8（Kayaku Advanced Materials，马萨诸塞州，美国）来制造的。第一层定义了微通道，并使用 SU-8 6005 制造，厚度为 7 μm。第二层定义了腔室，并使用 SU-8 2050 制造，最终厚度为 70 μm。腔室成型后，母模在 250 °C 下硬烘烤 1 小时。使用 Dektak XT 轮廓仪 (Bruker) 确认微流体装置母模的所有尺寸。

将母模放入直径 100 mm 的培养皿中，并将预混合的（固化剂与基质的重量比为 1:10）聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184，Dow Corning）倒在模具上，然后放入真空室中以除去任何气泡。然后将 PDMS 置于 90°C 热板上 3 小时以固化。将微流体装置从主模具上剥离，并用1.5毫米和3毫米直径的活检冲头打开用于细胞接种和培养基交换的流体端口。制造了几种微通道设计（直的、开放的、有角度的）以评估微通道几何形状对从内室延伸到外室的神经突的影响。

在细胞粘附的表面准备之前，微流体装置经过灭菌和不可逆粘合。具体而言，将PDMS装置和载玻片（Premium Cover Glass，Fisher Scientific，12548B）浸入70％乙醇中，用N 2空气干燥，并放入10W的空气等离子清洁器中1分钟（两侧）。然后将微流体装置粘合到无菌生物安全柜内的玻璃上，并通过无菌真空油脂将玻璃克隆圆柱体（直径 8 毫米，Sigma-Aldrich）固定在两个 3 毫米端口上以容纳培养基。

细胞培养表面准备
微流体装置封闭的载玻片表面涂有聚-D-赖氨酸（PDL，Gibco，A38904-01，0.1 mg/ml）和基质胶（Corning，354230，0.2 mg/ml，H 2 O）以促进细胞粘附。将装置与 PDL 一起孵育 15 分钟，用无菌去离子水洗涤 5 次，然后与 Matrigel 一起孵育 30 分钟，然后冲洗并保存在含有钙和镁的无菌 DPBS（DPBS +，Gibco，14040133）的培养箱中直至细胞接种。所有溶液添加均按照内室、外室(3mm直径端口)的顺序依次进行，然后通过1.5mm直径端口从外室排出。微流体装置粘合和表面准备在细胞收获前几个小时内进行。

结节神经节收获和培养
使用从Envigo购买的雄性Wistar大鼠（5周龄）来获得迷走神经传入神经元。所有组织采集程序均得到加州大学戴维斯分校动物护理和使用机构委员会的批准。将动物安置在12小时光照/12小时黑暗条件下并随意饲喂标准颗粒饲料。按照先前建立的方案收获迷走神经传入神经元（Simasko 等人，2002）。简而言之，在异氟烷（具有主动清除功能的 VetEquip V-1 Tabletop）麻醉下从大鼠中分离出双侧结状神经节。在颈部中线切口后，将肌肉组织缩回，并使用钝性解剖技术将迷走神经与颈动脉分开。在放大镜下 (AmScope LED-144A)，取出每个结状神经节，并将其置于含有钙和镁的 Hank 平衡盐溶液中 (HBSS + 1X，Thermo Fisher，14025092)，同时分离第二个神经节。收获后，将结状神经节脱鞘并在 HBSS [-]（Gibco，14185-052，H 2 O，1x）中消化，不含钙或镁，含有 1 mg/ml 1A 型胶原酶（Worthington Biochemical，LS004188）和分散酶 II (Roche, 04942078001) 在 37°C、95% 空气/5% CO 中持续 90 分钟2 . 通过温和研磨将细胞分散，然后在细胞培养基中洗涤（如下所述）。在 200 g 2 分钟的两个旋转周期后，将沉淀重悬于 50 µl 细胞培养基中。然后从两个室中取出微流体装置中的 DPBS，并将 150 µl 新鲜细胞培养基添加到内部室中。然后将 25 µl 细胞悬浮液添加至内室底部用于接种。将装置在培养箱中放置 1.5 小时以允许细胞粘附，之后更换内室一半的培养基，同时将外室充满 150 µl 新鲜细胞培养基。然后将设备放回培养箱（37°C，95% 空气/5% CO 2）。每 24 小时进行大约一半的培养基更换（去除 75 µl，添加 125 µl）以补充培养基并考虑蒸发，直至实验。神经元在接种后需要三天才能通过微通道生长并到达外部室。

细胞培养基由 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM，Thermo Fisher，11885084，46% v/v）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich，A8806，DMEM，0.5 mg/ml）、GlutaMAX（Thermo Fisher）组成, 35050061, 1.4 mM)、硒/胰岛素/转铁蛋白 (ITS-G, Thermo Fisher, 41400045, 30 nM)、神经生长因子 (2.5S NGF, Envigo, B.5017, 125 ng/ml) 和 Ham's F- 12 营养混合物（Thermo Fisher，11765054，49% v/v）（Ghogha 等人，2012）。适当时，培养基内容以以下格式显示：名称（缩写、供应商、目录号、溶剂、工作浓度）。

免疫细胞化学和成像
将培养物用 37°C DPBS + 洗涤 3 次，并用 DPBS + 中的 4% w/v 多聚甲醛（PFA，Affymetrix）在室温下固定 1 小时。固定后，用 DPBS + 洗涤细胞 3 次，用 0.05% v/v Tween 20（Sigma，DPBS +）洗涤细胞两次，然后用 0.1% v/v Triton X-100（Thermo Fisher， DPBS +) 并用 Tween 20 溶液另外洗涤两次。然后用 DPBS +（封闭缓冲液）中的 0.5% v/v 热灭活山羊血清（Thermo Fisher）和 0.3 M 甘氨酸（Sigma-Aldrich）封闭培养物 1 小时。封闭步骤后，将样品与封闭缓冲液（不含甘氨酸）中含有小鼠抗 βIII 微管蛋白（βT-III；Thermo Fisher，1:500）的一抗溶液一起孵育 1 小时。对于抗瞬时受体电位阳离子通道亚家族 V (TRPV1) 染色的培养物，一抗溶液含有封闭缓冲液（不含甘氨酸）中的小鼠抗 βIII 微管蛋白（βT-III；Thermo Fisher，1:500）和兔抗 TRPV1（Alomone Labs，1:200）。然后用 Tween 20 溶液洗涤样品 3 次，然后与含有与 AlexaFluor 555 缀合的山羊抗小鼠（Thermo Fisher，1:500）或与 AlexaFluor 555 缀合的山羊抗小鼠（ Thermo Fisher, 1:500) 和与 AlexaFluor 488 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗兔抗体在 DPBS + 中。与二抗溶液孵育后，用 DPBS + 洗涤样品 3 次，然后用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液（Sigma，1:20,000，H 200）在封闭缓冲液中（不含甘氨酸）。然后用 Tween 20 溶液洗涤样品 3 次，然后与含有与 AlexaFluor 555 缀合的山羊抗小鼠（Thermo Fisher，1:500）或与 AlexaFluor 555 缀合的山羊抗小鼠（ Thermo Fisher, 1:500) 和与 AlexaFluor 488 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗兔抗体在 DPBS + 中。与二抗溶液孵育后，用 DPBS + 洗涤样品 3 次，然后用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液（Sigma，1:20,000，H 200）在封闭缓冲液中（不含甘氨酸）。然后用 Tween 20 溶液洗涤样品 3 次，然后与含有与 AlexaFluor 555 缀合的山羊抗小鼠（Thermo Fisher，1:500）或与 AlexaFluor 555 缀合的山羊抗小鼠（ Thermo Fisher, 1:500) 和与 AlexaFluor 488 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗兔抗体在 DPBS + 中。与二抗溶液孵育后，用 DPBS + 洗涤样品 3 次，然后用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液（Sigma，1:20,000，H 500) 或在 DPBS + 中与 AlexaFluor 555 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗小鼠和与 AlexaFluor 488 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗兔抗体。与二抗溶液孵育后，用 DPBS + 洗涤样品 3 次，然后用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液（Sigma，1:20,000，H 500) 或在 DPBS + 中与 AlexaFluor 555 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗小鼠和与 AlexaFluor 488 (Thermo Fisher, 1:500) 缀合的山羊抗兔抗体。与二抗溶液孵育后，用 DPBS + 洗涤样品 3 次，然后用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液（Sigma，1:20,000，H2 0）。最后一次用 Tween 20 洗涤样品。使用 ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher) 将盖玻片上的培养物封片到载玻片 (Globe Scientific, 1324B) 上，同时装置培养物充满 DPBS + 并立即成像。使用 Leica TCA SP8 STED 3X 显微镜和 100x/1.4 油浸物镜对盖玻片培养物进行成像，以可视化 TRPV1 受体的存在。使用具有 10 × 和 20 × 物镜的 Zeiss AX10 Observer.D1 对设备进行成像，以可视化退出通道的投影。

为了量化通道退出角度对神经突轨迹的影响（即跟踪与投射），我们汇集了四个完全退出外室微通道的神经突设备的数据。如果神经突在离开通道时仍然邻近通道壁，则被视为“跟踪”。相反，如果神经突脱离通道壁并扩散到外室，则被视为“突出”。每个案例的总数根据出口通道角度进行分类。

霍乱毒素B亚基
在体外 (DIV) 第 3 天将霍乱毒素亚基 B​​（CTB，Thermo Fisher，C34778，HBSS +，10 µg/ml）引入室外室，然后将装置在 95% 空气/5 中于 37°C 下孵育 15 分钟% CO 2（Self 等人，2005 年））。孵育后，吸出外室中的液体，用新鲜细胞培养基洗涤，并用等体积的培养基替换。使用外室周围的落射荧光显微镜（Zeiss AX10 Observer.D1）对设备进行成像，以可视化 CTB 的摄取并获得 CTB 在投影中的位置。然后在 2 小时和 24 小时的时间点对设备上的相同位置进行重新成像，以评估 CTB 的传播。图像要么在所有时间点以相同的曝光时间收集，要么根据所需的数据在每个时间点自动曝光（参见结果部分）。为了量化传输的距离，在不同时间点测量了从通道入口到 CTB 信号前沿的距离。然后将这些量相互减去，以计算给定时间窗口内的距离变化。然后将这些值除以分配的时间并取平均值以计算平均传输速度。

效应分子
辣椒素（Cap，Tocris，0462，乙醇，1 μM）用于通过 TRPV1 激活（Sasamura 和 Kuraishi 1999 ）使神经元去极化（Newberry 等人， 2016；Riley 等人，2013）。使用升高的细胞外氯化钾（KCl，20 mM）和等摩尔减少的 NaCl 作为阳性对照（Rienecker 等人，2020）。使用乙醇（与辣椒素相同的工作浓度）作为载体，因为其他稀释剂（例如 DPBS +）通常不会影响细胞活力和功能（Girardi 等人，2023）。

细胞内钙通量测量
所有钙成像均在室温 (22 °C) 和 DIV 4 下进行。使用荧光钙指示剂 Fluo-4 AM（Thermo Fisher，F14201）监测钙瞬变。使用 HBSS + 预清洗细胞，然后在室温 (22°C) 下在 HBSS + 中与 3 µM Fluo-4 AM 一起孵育 60 分钟，然后按照供应商的方案在 HBSS + 中再次清洗。最后一次清洗后，装置的两个腔室均充满 75 µl HBSS + 并放置在显微镜载物台上 (Zeiss AX10 Observer.D1)。按以下顺序将刺激物引入外室：媒介物、辣椒素和 KCl。每次刺激后，样品在内室壁周围成像，曝光时间设定为 400 毫秒。2012）。纳入标准用于从分析中去除死细胞，要求神经元在暴露于 Cap 或 KCl 时需要表现出比基线荧光增加 10% 的能力（Riley 等人，2013）。然后汇集来自每个刺激的活神经元的所有数据，并比较各组之间的相对荧光单位（RFU）变化。

统计分析
使用带有韦尔奇校正的未配对学生 t 检验来评估直通道和开放通道之间投影长度的差异。使用 Tukey 多重比较检验的单向方差分析来比较不同刺激组之间神经元胞体的 RFU，以及比较 CTB 加载投影随时间的暴露时间。对于所有统计比较，p值 < 0.05 被认为是显着的。所有统计分析均在 GraphPad Prism（版本 10.0.2）中进行。

结果
微流体装置制造和 VAN 划分
使用光刻技术，制造了微流体装置的负母模。主模包含 14 个微流控装置的副本，由 32 个微通道组成，尺寸为 10 μm × 7 μm（宽x高），长度为 500 μm，连接两个同心室，高度为 70 μm。使用软光刻技术创建 PDMS 器件，然后将其等离子粘合到玻璃上以完成微流体器件（图 1a）。一个装置充满了食用色素，以可视化两个室和互连的微通道（图 1 b）。详细的装置尺寸如图S 1所示。

成年大鼠的每个结状神经节包含 6,000 个神经元，单个大鼠就有 12,000 个神经元 (Cooper 1984 )。我们研究了这些神经元的不同铺板密度，并观察了密度、细胞迁移和投射生长之间的关系。以每毫米2 10 个神经元铺板的神经元导致稀疏培养物，在培养 1 天后具有较大的突出和最小的迁移。以 700 个神经元/mm 2铺板的神经元导致神经元开始相互迁移，并在培养 1 天后形成具有最小投影的团块（图 S 2 a）。我们对这些团块进行了成像，发现它们是神经元的聚集体，最终（〜DIV 4）生长出投影网络（图S 2）b). 根据所需的实验，可以改变铺板密度以优化细胞行为。为了将结节培养物引入微流体装置，我们以大约 350 个神经元/mm 2进行铺板。

将分离的结状神经节细胞（包括 VAN）接种到内部室中，并允许 3 天通过微通道生长神经突（图 2 ）a) 用于进行实验（例如，钙成像或转运研究）或免疫染色以进行可视化。对于免疫染色，对神经元进行抗 βIII 微管蛋白（以红色显示）和 DAPI（以蓝色显示）染色。PDMS 装置不可逆地粘合到玻璃上，因此所有染色都发生在装置内，这使得微通道内的投影可视化具有挑战性。然而，人们可以想象进入和退出微通道的投影。由于这些器件是用软光刻技术制造的，因此可以通过使用定制光掩模布局来图案化更多数量的微通道，以增加神经突穿过微通道的概率。2009）。

微通道出口几何形状引导神经突投射
我们观察到，微通道出口几何形状对神经突是否投射到外部室或沿着室壁追踪有显着影响。笔直的微通道开口导致神经突离开通道并沿着室壁行进，而开放的微通道几何形状导致神经突离开通道并突出到外部室中（图 2b）。对外部室的投影距离的量化表明，与直微通道相比，开放微通道导致显着（* p  < 0.05，未配对 t 检验）更多的投影（图 2c）。

我们通过改变微通道开口角度系统地研究了微通道出口几何形状对神经突引导的影响。角度从 60° 到 150° 变化，步长为 30°。这是通过制造新模具来实现的，其中 32 个微通道被分为 4 组，每组 8 个通道，每组具有这些开口角度之一（图 S 3）。再次，将分离的神经元接种到微流体装置的内室中，并在 3 天后进行免疫染色，以可视化和评估神经突投射行为（图 3a）。锐角（例如，60°）导致大部分神经突沿着室壁行进，而对于钝角（例如，150°），大量神经突投射到外部室中（图3b  ）。

霍乱毒素B亚基的摄取和逆行转运
当仅将荧光标记的 CTB 引入包含离开通道的神经突的外部室时，神经突似乎吸收了 CTB 蛋白（图 4a）。在 2 小时内监测相同的视野表明，荧光信号沿着微通道内的一些神经突传播（图 4 ）b). 为了确保观察到的 CTB 逆行传输不是由于其通过微通道潜在被动扩散到内部室，我们使用荧光素进行了对照实验，荧光素的分子量比 CTB 小两个数量级，即它是比 CTB 更快的扩散器。简而言之，将荧光素溶液引入外部室，并平衡液体高度以防止对流传输。通过延时荧光显微镜评估，在 30 分钟的持续时间内（CTB 孵育时间的两倍），向内部腔室的扩散荧光素传输可忽略不计（图 S 4）。

通过对从 7 个独立设备汇集的免疫染色样本进行评估，我们发现 39 个通道（7 个设备的 224 个通道中）有一个突出到外部室的神经突。在这 39 个通道中，16 个显示 CTB 逆行转运，而其余 23 个仅显示蛋白质摄取。我们进一步分析了这 16 个案例，并通过使用 ImageJ 测量信号在单位时间内移动的距离来计算传输速度。最终的传输速度为 36.6 µm/hr 或 0.6 µm/min。对于一个神经突，24小时后荧光信号一直延伸回相应的胞体（图 5）。最初，添加 CTB 后信号仅定位于神经末梢（图 5 ）a) 但 24 小时后，它出现在位于内室的体细胞中（图 5 b）。此外，我们在不同时间点（0、2和24小时）使用自动曝光对神经突末梢进行成像，其中自动曝光持续时间在24小时后显着增加（图S 5 ））。

机械和生化刺激增加细胞内钙活性
VAN 细胞体和神经突末端的区室化还允许独立地将任一细胞区域暴露于外部刺激。在这里，我们依次将辣椒素 (1 µM) 和 KCl (20 mM) 引入外室，同时对内室的神经元胞体进行成像。通过连续添加刺激，位于内室的神经元（与 Fluo-4 AM 钙指示剂一起孵育）的细胞内钙引起的荧光强度增加（图 6a）。汇集来自活神经元的数据并比较它们的平均强度（RFU）表明，在将载体溶液​​添加到外部室后，体细胞的荧光强度显着增加，而与载体相比，对辣椒素或 KCl 的反应没有显着增加（图 1）。  6b). 然而，作为对照，当胞体（而不是神经突末端）直接暴露于内室的相同刺激时，与基线相比，载体没有显着增加；然而，与载体相比，辣椒素暴露的荧光强度显着增加。用“O”表示的组代表在外室的刺激（n  = 17 个神经元），用“I”表示的组代表在内室的刺激（n  = 11 个神经元）。

VAN 体细胞和神经突上的辣椒素受体表达
我们对整个神经元的 DIV 3 处的辣椒素受体 TRPV1 的 VAN 进行免疫染色，并通过共聚焦显微镜对它们进行成像，以确认受体在体细胞（黄色框）和沿着突起（紫色框）的存在（图 7）。作为阴性对照，我们重复染色，同时省略一抗TRPV1抗体，其中没有荧光信号（图S 6）。

讨论
VAN 的微流控分区
我们之前已经证明，当暴露于生理相关胃肠道效应分子（包括辣椒素、血清素和胆囊收缩素）时，急性原代 VAN 培养物表现出升高的电生理活性（通过细胞内钙活性和细胞外记录证实）（Girardi 等人，2023 ））。在这里，我们扩展了这项工作，以证明 VAN 培养在微流体装置中的实施，其中可以测试解剖相关的病例（例如逆行运输或神经突末端激活）。混杂的生理过程对研究迷走神经在体内肠脑轴中的直接作用提出了重大挑战。这里的体外模型旨在通过解耦循环或内分泌系统中的信号以及迷走神经信号传导途径对中枢神经系统的贡献来应对这一挑战。这是通过利用微流体装置模拟迷走传入神经元的解剖布局来实现的。具体来说，我们使用微加工技术（即光刻和软光刻）来生产有利于解离VAN培养的微流体装置（图1）。 1）。该装置由两个通过微通道连接的室组成。一旦解离的 VAN 被播种到内部室中，神经突突就会在三天内穿过微通道并投射到相邻的外部室中。在该装置中，微通道将 VAN 胞体限制在一个室中，但允许神经突渗透微通道并进入相邻的室（图 2）。有趣的是，微通道的几何形状强烈影响退出微通道的神经突的行为。传统上，用于划分细胞的微流体装置包含具有矩形出口的互连微通道，其中中枢神经系统神经元投射很容易从通道发芽到相邻的室中（Taylor et al. 2003 ））。然而，VAN 投影在退出通道时倾向于沿着室壁追踪。如果通道开口具有钝角，则神经突从沿着壁追踪过渡到突出到外部室中。我们通过制造具有不同通道出口角度（60°、90°、120°、150°）的用于培养 VAN 的装置来系统地探索这一现象（图 3 ））。与较高出口角的对应物（120°和150°）相比，具有小出口角（60°）的神经突沿壁跟踪的百分比更高，其中这些角度导致更高的突出百分比。这种现象似乎是由于神经元（至少是外周感觉神经元）倾向于通过最大化与表面或另一个细胞的接触来最小化其过程的自由表面（Francisco et al. 2007）。后者得到了对 VAN 形成聚集体趋势的观察的支持（图 S 2）。为了实现这一目标，VAN 的生长锥应该在其再生过程中不断对其路径进行机械和生化线索采样。在微通道出口呈锐角的情况下，生长锥更有可能遇到通道壁，因此沿着它行进（图 3）。相反，对于钝角，通道壁的突然不连续性降低了生长锥接触壁的可能性，因此，神经突突出到外部室中。通过调节退出角度来控制神经突生长方向的能力也可广泛用于控制神经元网络形成。

我们已经证明了培养 VAN 多天（4 天）的能力，而之前的研究主要集中于持续时间为 1 天或更短的急性培养（Simasko 等人，2002 年；Riley 等人，2013 年；Ragozzino 等人，2021 年；Ragozzino 等人，2021 年）。特洛伊等人，2016）。延长的培养时间使 VAN 能够发育出足够长的神经突，这些神经突可以合并到微流体平台中，以区分体细胞和神经突末端，模仿迷走神经的解剖布局。这反过来又创造了将体细胞和神经突末端独立暴露于不同刺激的能力。换句话说，刺激神经突末端模仿来自肠道的直接信号传导，而刺激胞体则模仿循环系统信号对细胞体的影响。

分子运输和远端刺激
霍乱毒素 (CT) 是由霍乱弧菌 分泌的多聚体蛋白 (AB5) （Vanden Broeck 等人，2007）。CT 与通常富集在大脑脂筏上的 GM1 神经节苷脂结合，随后被内吞 (Wands 2015 )。CT的B亚基由于其低毒性而被常规用作神经元示踪剂。当外室的神经突末端暴露于CTB时，它很容易被VAN吸收（图 4），其中41％的VAN表现出CTB的逆行运输（图 5）。定位在神经突处的荧光随着一天的推移而减少，并且需要更长的暴露时间来记录神经突处的荧光信号（图S）5 )，表明内化的CTB扩散到整个细胞。VAN 表现出显着的细胞异质性，这被观察为不同的细胞功能，例如对不同效应分子的差异电生理反应（Girardi 等人，2023；Simasko 等人，2002）。似乎异质性也表现在蛋白质（包括 CTB）的摄取和运输中，从而导致一小部分细胞表现出 CTB 的运输，这也在体内追踪研究中观察到（Wang 等人，1998 年；Cailotto等人，2017 年）。2012；崔等人，2022）。总体而言，这里证明的 CTB 逆行转运表明，区室化的 VAN 可以用作研究其他分子转运的模型，例如 α-突触核蛋白，一种假设从肠道迁移到 CNS 导致神经退行性变的分子。 Kim 等人，2019 年；Bindas 等人，2021 年）。

除了运输研究之外，微流体 VAN 区室化还可以研究由于体细胞和神经突末端的独立刺激而产生的电生理反应。正如之前报道的那样，VAN 很容易表现出细胞内钙的增加（通过荧光显微镜捕获），以响应辣椒素和细胞外氯化钾的升高（Girardi 等人，2023 年；Riley 等人，2013 年；Rienecker 等人，2020 年）。在这里，我们研究了神经突末端单独暴露于这些分子是否会导致体细胞内钙活性的增加。在神经突末端将培养基从基线切换为媒介物会增加胞体的细胞内钙（图 6 ））。我们之前报道过（Girardi et al. 2023），由于载体导致细胞内钙增加，可以通过机械扰动（向外部室移除/添加溶液）来解释，VAN 上表达的机械敏感受体将机械信号转导为作用传播到躯体的电位（Blackshaw 等人，2007）。另一方面，接触 KCl 并没有进一步增加体细胞内的钙水平。KCl 会导致神经元非特异性去极化，尽管其浓度和暴露持续时间已被证明会导致矛盾的神经元反应（Rienecker et al. 2020），这可能是由于神经突末端暴露于 KCl 导致细胞内钙不再进一步增加的原因。

将神经突末端暴露于辣椒素仅导致细胞体中的荧光信号小幅增加，但未达到统计学显着性。另一方面，与神经突末端暴露的反应相比，将胞体（位于内室）暴露于辣椒素会导致细胞内钙显着升高。Cap 与 TRPV1 结合，TRPV1 是一种非选择性阳离子通道，可导致 Na +和 Ca 2+流入（Sasamura 和 Kuraishi 1999），并引发强烈去极化，其作用机制已被充分了解（Riley 等人，2013）。我们对载玻片上培养的 VAN 进行 TRPV1 免疫染色，以评估体细胞上的 TRPV1 表达，尤其是再生神经突上的表达（图 1）。 7）。体细胞上有高水平的 TRPV1 表达，并且沿神经突呈点状存在。首先，TRPV1 的表达是一个有希望的指标，表明解离的细胞（在体体周围剪下用于组织收获的神经突）可以在体外成功地从头合成 TRPV1 并沿着神经突运输受体蛋白。尽管这里没有明确研究机械敏感受体的空间分布，但在神经突末端机械扰动时观察到的胞体细胞内钙升高表明这些受体（可能还有其他受体）也可能沿着神经突合成和运输。第二，神经突末端 TRPV1 表达密度较低可能不会导致足够的阳离子流入来引发动作电位，而动作电位是增加体细胞内钙水平所必需的。更成熟的培养物（> 4 天）可能会增加 TRPV1 表达，并且可以使用膜片钳方法研究 VAN 以揭示亚阈值电流。综上所述，这里的研究表明，VAN 在这些非急性培养条件下仍然可行，并将神经突末端（室外）的刺激（最有效的是由于机械扰动）转变成物理分离的体细胞（室内）的细胞内钙升高。室）。并且可以使用膜片钳方法研究 VAN 以揭示亚阈值电流。综上所述，这里的研究表明，VAN 在这些非急性培养条件下仍然可行，并将神经突末端（室外）的刺激（最有效的是由于机械扰动）转变成物理分离的体细胞（室内）的细胞内钙升高。室）。并且可以使用膜片钳方法研究 VAN 以揭示亚阈值电流。综上所述，这里的研究表明，VAN 在这些非急性培养条件下仍然可行，并将神经突末端（室外）的刺激（最有效的是由于机械扰动）转变成物理分离的体细胞（室内）的细胞内钙升高。室）。

结论
我们已经展示了一种微流体装置，可以将 VAN 体细胞与其神经突末端物理分离，从而更准确地概括迷走神经传入神经元的解剖布局，其中体细胞位于结状神经节中，而神经突末端分布在周围器官中。对微通道尺寸的系统研究表明，钝角通道出口角会导致更多的神经突投射到微流体室中，而不是沿着室壁追踪。我们在两个生理相关案例中展示了微流体平台的概念验证实用性。对于第一个例子，我们证明 CTB 可以被神经突末端吸收并逆行运输到细胞体。这一观察结果可以扩展到研究其他分子的运输，包括源自肠道的异常蛋白质，这些蛋白质会导致中枢神经系统神经变性或摄入环境毒素。对于第二个例子，我们表明，神经突末端暴露于各种刺激，由于机械扰动，导致体细胞内钙的升高最显着。为了研究神经突末端对辣椒素暴露的相对较小的反应，我们研究了 TRPV1 在 VAN 上的分布。虽然 TRPV1 在新生长的神经突上表达，但它们的表达水平不足以引起体细胞内钙的显着增加。未来的研究应该调查更长的培养时间以获得更高密度的受体蛋白（包括TRPV1以外的蛋白）以及使用多个电极阵列和膜片钳技术的电生理记录。总体而言，这项工作为肠-脑轴研究界引入了一种新工具，该工具应该允许对各种肠-脑信号传导模式（迷走神经与循环或内分泌）解耦和筛选治疗方法进行对照研究。