背景
地球上美丽多样的生命形式源于三个维度的差异生长。叶子提供了一个研究该过程的细胞和遗传基础的系统，因为它们表
现出多种不同的形式并表现出动态异质生长[ 1,2,3,4,5,6 ] 。成像技术的进步现在使我们能够从启动器官的最初几个细
胞开始追踪这种发展[ 7,8,9,10 ]]。此外，相同植物的细胞分辨率允许模型的参数化和拟合，与不同植物的时间点采样相
比，可以更深入地了解发育过程[ 11,12,13 ]。

然而，复杂的形式，比如突变的jaw-D的波纹和波动的叶子，可能会通过创建棘手的成像系统来阻碍研究[ 14 ]。由于其弯
曲的性质，在保持植物存活的同时， jaw-D叶表面特别难以完整成像，因为叶表面会自行遮挡。类似的问题出现在许多其
他具有曲率突变的拟南芥突变体中，例如：豌豆、incurvata和卷曲叶[ 15、16、17 ]]。由于植物组织的密度、细胞之间
的空气空间以及叶绿素诱导的自发荧光，植物组织中的光学切片通常仅限于前一到两层，因此通过弯曲部分成像目前还不
可行[ 18 ]。此外，即使可以获取图像，增加 z 方向的成像也会带来时间成本，这可能会威胁样品的活力。因此，我们的
目标是创建一个成像管道，最大限度地减少由于 z 方向组织变形而丢失的信息，同时最大限度地减少每个样本的时间。

在这个管道中，我们综合了领先的实时和固定成像协议的策略，以获得一个强大的系统，用于测量形态复杂的整个植物叶
子的发育[ 7,10,19,20,21 ]。我们的方法还使形态简单（相对平坦）样本的成像变得更容易，并且允许在成像时间点之间
减少样本操作。我们相信这些策略可以应用于各种植物组织，以改善延时图像捕获。

结果与讨论
方法改进
为了研究叶原基的发育，我们对从芽尖分生组织中出现的叶子进行成像。我们将种子接种在基于植物琼脂的生长培养基上
，然后让它们在生长室中发芽 2-3 天（以下简称 DAS）。然后，我们将植物的子叶解剖下来，让它们恢复一天，然后开始
成像（图 1）。在成像之前，我们还在样品上方贴上盖玻片。这有助于将样品保持在理想的成像位置。贴上盖玻片后，我
们发现全氟萘烷是一种理想的封固剂，可以保持样品活性并保持图像质量。

我们以这种方式对相同的植物进行成像至少六天。我们的样品含有一种带有荧光蛋白标记的小型质膜定位蛋白，因此我们
能够获得这些图像中每个细胞边界的高分辨率图像。这使我们能够跟踪从最初不可识别的数十个细胞的小结中产生包含数
千个细胞的可识别叶组织的过程[ 22]。我们的样品面积从数百微米增长到毫米，因此它们很快就超过了质膜标记可分辨的
单个 20 × 成像窗口（~ 5 DAS）。因此，我们手动获取样本较小部分的图块，然后在 MorphoGraphX 软件中重新组装这
些单独的图块（有关图块详细信息，请参阅方法）。然后，我们使用 MorphoGraphX 将原始荧光信号转换为计算机可以识
别的对象。这涉及屏蔽原始共焦信号，然后将曲面拟合到该掩模上，将原始信号重新投影到该表面上，并将信号分割成计
算机识别的细胞轮廓（请参阅附加文件6）：注释_任务_列表.docx）。通过这种分段网格，我们可以直接测量和量化整个
成像期间相同细胞谱系的生长、分裂和形态变化。我们开发了脚本来加速处理和下游量化步骤。这些技术改进、计算资源
和我们详细的补充信息的结合使我们的管道成为对弯曲和折叠组织感兴趣的研究人员，特别是实时成像新手的理想选择。

盖玻片下生长的组织更适合成像
在琼脂中生长的植物随着时间的推移具有自然变化的趋势，因为根向重力生长并且随后的叶子从分生组织中长出。这些发
育事件会改变板中的样品。随着早期叶子发育的进行，叶子的三维度变得更加明显，并且对它们的整体进行成像变得更加
困难（图 2）。早期叶片发育包括几乎所有叶片的叶柄和叶片之间形成的弯曲以及突变株系之间的各种曲率和边缘图案差
异[ 14、15、16、23 ] （图 1F、2）A、C）。这可能是一个问题，因为它可能导致先前时间点的细胞变得模糊。这些细胞
无法在时间点之间进行跟踪，无法测量它们的生长和细胞分裂率，因此必须从数据集中删除。为了最大化可成像和跟踪的
组织表面，同时最小化遍历 z 步所损失的时间，我们尝试在盖玻片下生长植物（图 1  C -E、2 B、D）。在盖玻片下成像
和种植植物为管道带来了许多好处。盖玻片下生长的叶子在整个板中的移动要小得多，尤其是在 z 维度上移动更小（图 2
））。这最大限度地减少了成像过程之间的植物移动以及重新定位时样品损坏的风险。

它还通过减小 z 步长范围来缩短每个样本成像所需的时间。此外，细胞不再因组织翻转而丢失。

此外，在进行实时成像实验时，琼脂板的污染也是一个问题。板将暴露在露天 3 小时以上。一些研究人员使用真菌抑制剂
来防止污染[ 7 ]。这些治疗可以减缓生长（个人通讯，洪丽兰博士，浙江大学）。其他研究人员选择通过复杂的微流体装
置定期更换培养基，每天手动移植到新鲜平板上或使用营养最少的培养基[ 8,9,10 ]]。我们发现，在盖玻片下种植植物可
以从根本上减少植物生长一周或更长时间内发生的污染。在所有为期一周的实验中，只有一次在盖玻片下面发现了霉菌。
这是一个好处，因为它再次减少了由于不完美的重新定位而重新电镀或丢失细胞而损坏样品的威胁。

解剖子叶暴露更多细胞而不影响生长
放入生长室后 48 小时内，拟南芥的子叶将从种子中长出并开始张开。此时，第一片真叶已经长出（图 2）。然而，由于
子叶的存在，前两片真叶的最早发育被掩盖。以前的努力已经通过几种方式解决了这个问题。被子叶遮挡的区域已从潜在
数据集中删除[ 8 ]。一旦叶片再次出现，就会在叶片发育过程中拍摄图像[ 5 ]。或者，进行解剖以去除子叶或老叶 [ 7
, 10]。根据最后的策略，我们尝试解剖一个和两个子叶（图 1 B、C、2 B、D、3）。我们在同一平板中种植具有和不具有
子叶解剖的WT植物以控制条件变化（图 3、4 ）。我们测试了解剖在多大程度上改善了成像时的组织暴露，并检查了解剖
样本中的生长和细胞分裂没有受到损害。解剖后，沿早期原始边缘和基底的更多细胞显露出来并易于分割（ 图3、4广告）
。重要的是，解剖和未解剖样本之间的面积生长或细胞分裂没有显着差异（图 4 E-H）。

全氟萘烷可将样品保存多天
在我们的早期实验中，我们使用水基溶液来浸泡样品。叶子生长停滞，可能是因为这些溶液经常吸收到介质中并可以与盖
玻片形成真空（图 5，附加文件3：视频 S3）。这促使我们寻找其他具有高折射率的浸没解决方案，以保持良好的成像分
辨率，同时不会导致组织失速。我们尝试使用甘油、碘克沙醇和全氟萘烷 (PFD) 进行成像。我们发现 PFD 在保持图像质
量方面效果最好。众所周知，PFD 可以溶解氧气和二氧化碳等气体，这可能有助于防止组织停滞 [ 24]。值得注意的是，
PFD 也很滑，对介质的吸收要少得多，因此在成像过程中更容易去除。

MorphoGraphX脚本的开发提高了图像处理和分析效率
图像处理、细胞分割和谱系跟踪可能是一个费力且耗时的过程（参见“材料和方法”部分中的图像处理和附加文件6：
annotated_task_list.docx）。因此，我们的目标是使最终的图像数据分析尽可能高效。我们使用现有的 MorphoGraphX
基础设施来调用自定义分析脚本 [ 13 ]。我们开发了脚本来调用不同类型的网格测量和显示过程。我们的背景
与所有植物一样，小麦的发育需要营养素和大量营养素。这些因素的均衡贡献可以带来良好的粮食产量和优质的产品。磷
是一种营养物质，是小麦植株发生所有代谢过程所需的能量来源。它的缺乏使植物无法正常完成这些代谢过程。它的存在
至关重要的两个关键时刻是：（1）在发芽阶段，因为它有利于根的快速生长，（2）在开花前和生长阶段，因为它为谷物
合成和光合糖的运输提供了必要的能量。1 ]。小麦籽粒中的磷含量除了影响性能行为外，还代表了一种营养成分高的产品
。1 ]。使用传统方法测定磷含量既昂贵又耗时，因此需要新的方法来更有效地估算磷含量。

不同的植被指数被用来间接测量小麦籽粒中的磷含量，如简单比值[ 4 ]、归一化植被指数[ 4 ]、Green归一化植被指数[
11 ]、土壤调整植被指数[ 12 ]和然而，优化的土壤调整植被指数[ 19 ]，这些指数是为了监测植物中的氮而开发的。

监测小麦植株中磷的营养指数为P_1808_1460[ 13 ]，为此需要调整反射率数据以获得包括短波红外区域（SWIR）的完整光
谱值，我们的结果无法比较具有该植物指数，因为没有有关该光谱的信息。

我们还可以找到利用其他作物的反射率数据来估计磷的研究，例如[ 17 ]，他们使用神经网络来确定稀树草原草中磷预测
的关键波长；但没有具体的预测小麦籽粒中磷含量的方法，因此本研究提出了一种利用高光谱反射率来估算小麦籽粒中磷
含量的方法。

我们建议评估三个模型：模型 1 假设观测值是独立的，其他两个模型假设观测值在空间上相关，遵循指数相关图建模或使
用条件自回归模型 (CAR)。在所有模型中，为了满足正态性假设，因变量是小麦籽粒中磷浓度的自然对数；自变量是以纳
米为单位测量的波长带。

文章的组织如下。在材料和方法部分，我们描述了一个真实的数据集，用于研究 3 个不同模型的预测能力，并能够将结果
与不同的植被指数进行比较。我们描述了选定变量的方法和标准，以及我们如何在每个模型中进行交叉验证和预测。接下
来，我们描述一个模拟实验，以证明所提出的模型是有效的。最后，我们提出结果并进行讨论。我们提供了关于实现
Gibbs 采样器和 Metropolis-Hastings 算法所需的完整条件分布的推导的附录，并且补充材料包括实现所提出算法的 R
代码。

材料和方法
现场实验和数据采集
一项实验是在国际玉米和小麦改良中心（CIMMYT）进行的，该中心位于墨西哥西北部索诺拉州奥布雷贡附近的亚基山谷。
本试验旨在研究不同磷肥水平对小麦籽粒磷含量的影响。在试验的前四个小麦周期中，试验区未施磷肥，以避免残留效应
。亚基河谷气候半干旱，年平均降水量为 280 毫米，日平均气温为 24 °C。该地区的土壤为粘土粗砂质，混有蒙脱石粘
土。

在 2010 年、2011 年和 2012 年的 3 个周期中进行了裂区试验，以评估小麦籽粒中的磷含量。主区考虑了 0 千克/公顷
和 80 千克/公顷两个磷水平，子图中有 21 种不同的小麦基因型。重复进行 3 次。126 个地块中的每一个都有 4 个 0.8
m 的床，顶部有两行，长 5 m。

使用 JAZ 光谱辐射计 Z31 测量每个图中的高光谱反射率，该 JAZ 光谱辐射计 Z31 带有连接到光纤的 CC-3 余弦校正器
，FOV（视场）孔径为 25°（Ocean Optics，Dunedin，FL，EE.UU.）。该传感器的光谱范围为 339 至 1029 nm (nm)，带
宽为 0.38 nm，总共 2048 个波段。在测量之前进行暗读数以设置设备的较低反射点。漫反射白色反射目标 Spectralon（
Labsphere，North Sutton，NH，EE.UU.）不时用于现场测量，作为设备上反射点的参考。下载数据并随后使用
SpectraSuite 软件（Ocean Optics，Dunedin，FL，EE.UU.）进行校准。通常从上午 11:00 开始，在四张床的中央进行测
量。至下午 2:00，以恒定高度瞄准树冠。该程序在开花后两周进行。

最初进行该实验的目的是受精研究，但出于我们的目的，仅检索数据，因为 2010 年和 2011 年有 21 个小麦基因型，此
外还有 2021 年的另外 21 个小麦基因型，这将使??我们能够捕获变异性不仅在个体之间，而且在空间上，并且能够比较
3 种情景下的结果，因为可以观察到每年的变化（图 1），并且正是由于这种捕获预测可以变化的能力改善或恶化。

图。1
图1
3 年中每年 21 个基因型中小麦籽粒磷的箱线图

全尺寸图像
图 1显示了2010年、2011年和2012年各基因型小麦籽粒中磷含量的分布。2012年，与往年相比，纳入了21个不同基因型，
普遍观察到这些基因型的磷含量较低。粮食。

高光谱反射率数据的预处理
有关 2048 个光谱带的信息可用作模型中的自变量。然而，据观察，前 296 个波段和最后 592 个波段都有高达 65% 的数
据丢失，因此我们决定缩小光谱范围，仅考虑 450 至 850 nm 的范围。此外，从几项研究中可知，光谱波段之间存在多重
共线性，在我们的例子中，信息可在 0.38 nm 带宽的窄带中获得，利用该信息可以生成部分线性组合，以使用 Bsplines
进行重采样 [ 7 ] 并保持 4 nm 的带宽，从而产生用于数据分析的总共 101 个波长。

主脚本（附加文件6：iterative_growth_and_measures.py；
https://github.com/kateharline/roeder_lab_projects/tree/master/mgx_scripts）允许用户指定要测量的细胞特征，
并指定使用 MorphoGraphX 流程显示和生成热图（附加文件4：视频 S4）。该脚本会在需要用户输入的测量中暂停，例如
选择用于距离测量的单元格，以及在网格快照之前进行网格排列（附加文件4：视频 S4）。我们还开发了一个脚本（附加
文件6：multi_resize.py；https://github.com/kateharline/roeder_lab_projects/tree/master/mgx_scripts）来解决
从 ImageJ 导出的文件的问题（附加文件5：视频S5）。有时，文件头的写入方式使得 MorphoGraphX 无法读取步长。因此
，它不是加载图像体积，而是显示为一维平面。该脚本迭代地打开包含图像文件的任何文件夹，并重置堆栈 x、y、z 尺寸
以正确表示体积，然后保存调整后的堆栈文件。这非常有用，特别是如果这些导出问题是在长期实验过程中出现的，此时
需要每天组装堆栈以检查是否捕获了整个样本。

新的管道能够直接量化细胞发育机制
将我们的成像技术与定制的 MorphoGraphX 脚本相结合，使我们能够捕获包含 WT 和颌 D叶的早期发育的大型数据集（图6
）。从这个数据集中，我们可以分析不同组织区域（如叶柄和边缘）之间的细胞生长、分裂和形态特征（图7）。我们的其
他工作 [ 22 ]详细阐述了这一分析。

下颌-D 叶柄表现出更均匀的生长
通过脚本（附加文件6 ：iterative_growth_and_measures.py）标记叶柄细胞，我们能够比较这些细胞的平均生长率和生
长变异性。这表明，在 7 DAS 时，与 WT 相比， jaw-D叶中的细胞表现出更大的细胞间平均面积生长和更小的细胞间变异
性（图7 A-C）。在其他工作中，我们已经表明，完全生长的jaw-D叶柄比WT短，并且jaw-D错误调节了生长各向异性[ 22 ]
。在这种情况下，我们的方法对于区分 WT 中驱动叶柄伸长的定向扩张的效果与 WT 中更高但无组织的扩张的影响至关重
要。限制伸长的颚-D 。

下颌-D边缘被破坏
我们还使用细胞标记和定量流程来探索叶缘细胞的生长和形态。jaw -D叶卷曲表型归因于边缘细胞的过度增殖[
1,23,25,26 ]。使用脚本（附加文件6：iterative_growth_and_measures.py），我们沿着叶子边缘选择了一组单元格，并
将其定义为边距。然后，我们量化了距指定叶缘规定距离的细胞的生长、分裂和特征。当我们考虑随时间推移距离边缘 10
μm 或更小的细胞（3 到 7 DAS 的细胞平均宽度）时，我们发现 WT 和jam-D叶之间的平均生长速率和分裂通常没有不同
（图 1）。7 F-G）。仅 4 至 5 DAS 和 7-8 DAS 的平均面积生长有所不同，并且在 4-5 DAS 时，WT 中的平均面积实际
上高于颌骨 D中的平均面积生长（学生 t 检验 p < 0.01）。以前，细胞周期标记和细胞密度被用作增殖的代表[ 23、27
、28 ] 。? 然而，我们对叶 1 中细胞分裂和形态的直接测量表明，由于边缘细胞界定不太清楚，颚 D叶边缘可能出现更
多增殖（图7 D-E、H-I） 。在 WT 叶子中，边缘由围绕边缘的连续带中的细长细胞组成，这些细胞可以堆叠成多行（图7
D-E，顶部）。而在jaw-D中，叶缘表现出一些细长的细胞，它们可以是不连续的，有小细胞的间隙，并且通常只有一层厚
（图7 ）D–E，底部）。当我们量化距叶缘 25 μm 的细胞形态（5 至 7 DAS 的细胞平均宽度）时，我们发现 WT 细胞平
均更大、更长（图7 H-I，学生 t 检验） * = p < 0.05，** = p < 0.01）。这些结果表明需要实时成像和计算分析来确
认产生组织形态的细胞动力学。

结论
我们提供了一种优化方法来捕获多天时间尺度内细胞和组织形态变化之间的关系。我们在拟南芥WT和jaw-D突变体相对脆弱
且形态动态的早期叶子中进行了实验。通过我们的管道，我们能够在细胞水平上表征和量化整个叶器官的发育。我们演示
了对两个不同的叶子组织区域（叶柄和边缘）的分析。该分析表明，叶柄的生长同质性和边缘细胞分化的破坏可能导致
颌-D叶波纹表型。我们的工作强调直接测量活组织中的细胞分裂、生长和形态以验证和发现发育机制的重要性和可行性。
我们的实时成像流程能够以相对简单、简单和快速的方式捕获形态复杂的组织。我们相信我们的成像技术、处理细节和脚
本可以应用于具有形态复杂性的各种系统。