介绍

牛生殖器弯曲杆菌病（BGC）是一种影响牛的传染病。弯曲杆菌属是造成这种疾病的原因。它们是革兰氏阴性、螺旋形、能动的细菌。目前，已识别出 32 个弯曲杆菌属（Chukwu等人， 2019），其中胎儿弯曲杆菌亚种。胎儿( Cff ) 和胎儿弯曲杆菌亚种。性病菌( Cfv ) 影响牛的生殖系统（Chiapparrone等人， 2014）。根据世界动物卫生组织 (WOAH)（前身为世界动物卫生组织），该疾病被视为强制性报告疾病，被列入陆地动物疾病清单 B（Tshipamba等人，2020）。在反刍动物中，Cff已被证明会影响肠道系统，尤其是肠道 ( Li et al ., 2022 )，另一方面，携带Cfv的公牛是宿主，因为细菌在包皮囊中生存和适应，而在奶牛中则定植存在于阴道、子宫颈和子宫中（（Cagnoli et al., 2020和Lúcio et al., 2019）），诱导促炎过程（Campos-Múzquez等人，2021）由于子宫内膜上皮细胞内化（ Campos-Múzquez等人，2019）导致流产（ Clune等人，2022）；胎儿念珠菌也会影响人类，据报道会诱发全身感染（ Adhikari等人，2022）、心内膜炎（ Lynch等人，2022）和脑膜炎（ Fernández等人，2022）。细菌学分离和生化测试的使用对于胎儿梭菌的鉴定和区分Cff和Cfv被认为是金标准，但这些培养技术的实施很困难，因为弯曲杆菌比其他细菌属需要更苛刻的体外培养条件，此外，培养的可靠性和重现性较差（Iraola等人， 2016）。可以使用不同的方法进行Cfv鉴定，例如酶联免疫分析 (ELISA)、直接免疫荧光 (DI) 等抗原抗体反应 ( Dorsch et al ., 2022）以及脉冲场凝胶电泳 (PFGE)、扩增片段长度多态性 (AFLP)、多位点序列分型和聚合酶链反应 (PCR) 等分子方法。目前，PCR 是最有希望的替代方法，可有效检测现场样本中的Cfv （ Chaban等， 2012）。本研究的目的是通过 PCR 检测塔毛利帕斯州中部地区用作种牛的公牛的包皮垢中是否存在胎儿 C. fetus 。

材料与方法

采样

在位于墨西哥塔毛利帕斯州中部地区的养牛生产单位 (CPU) 中，对 2 岁以上不同品种的公牛（夏洛莱牛、Beefmaster、红布朗格斯、婆罗门）进行了方便取样。该研究于2020年8月至12月进行。为了获取包皮样本，使用无菌一次性注射器和插管将60 mL林格氏溶液（PISA®）注入每匹种马的包皮中；然后关闭包皮口，对整个包皮进行剧烈按摩5分钟，随后通过引流获得灌洗液（包皮垢），并将其存放在密封的无菌塑料袋中。精液样本是使用 minitube® 设备通过电射精获得的。每只动物射精的刺激电压不超过 20 伏。为了收集精液，使用了一个收集盒，其中装有一个乳胶漏斗，在漏斗的末端放置一个刻度管来接收精液；该管在使用前已被识别。样品在运输过程中一直冷藏（4°C）直至加工（西尔维拉等人， 2018）。

DNA分离

将收集的样品在无菌 50 ml 塑料管中以 604 xG 离心 5 分钟（Centurion Sc Limited，UK），然后弃去上清液，并用 0.2 ml 无菌 1X PBS 重新溶解沉淀物。对于基因组 DNA 分离，所有样品均按照制造商的说明使用商业 DNeasy 血液和组织试剂盒（QIAGEN® 德国）进行处理。DNA 收集过程完成后，基因组产品将被冷冻（-20 ℃）直至进一步使用。为了评估 DNA 纯化，在 260/280 纳米（JENWAY Genova，英国）进行分光光度研究，理想的纯度值被认为是 1.8 至 2.0；发现在该范围内的 DNA 样本通过 PCR 进行 DNA 扩增。

DNA 扩增和电泳

使用多重PCR；所用引物为nC1165g4F(AGGACACACAAATGGTAACTGG)和nC1165g4R(GATTGTATATAGCGACTTTGC)，检测Cfv cstA基因的一个区域，扩增产物为233个碱基对(bp)；引物 MG3F (GGTAGCCGCAGCTAAGAT) 和 MG4R (TAGCTACACAATAACGACAAC) 检测扩增至 764bp 的virB11 Cff基因区域（Iraola等人， 2012 y Hum等人， 1997）。作为 PCR 反应的阳性对照，使用来自Cff 27374的 ATCC 参考菌株的核酸，随后在进行 PCR 测定时，使用具有提示Cfv扩增的样本（样本 1）被识别出来。扩增结果由墨西哥国立自治大学生物技术研究所测序。使用 BLAST 在线工具在 GenBank 数据库中分析序列 ( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。PCR 反应在 50 µL 中进行，（含有 5 µL 10 X 缓冲液（Tris-HCl 100 mM pH 8.4、KCl 500 mM、明胶 10 µg/ml、BSA 1.5 mg/ml、1% Triton X 100（Biotecmol， BIOTECMOL®，CDMX 墨西哥），dNTPS 0. 2 mM（InvitrogenTM，Life Technologies；美国），每种引物 25 µM，MgCl2 3.0 mM（BIOTECMOL® CDMX，墨西哥），5 U Taq DNA 聚合酶（Amplificasa® BIOTECMOL，CDMX） ，墨西哥），加上 300 ng DNA，最后用无核酸酶水调整至 50 µL。使用的 PCR 循环条件是初始变性 7 分钟，95 °C，然后是 35 个循环，94 °C 变性 30 秒，在 53°C 下对齐 30 秒；在 72°C 下延伸 1 分钟，最后在 72°C 下延伸 2 分钟（Iraola等人， 2012 ））。最终产物通过3％琼脂糖凝胶电泳进行分析，然后用浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭(promega)染色30分钟。为了实现 PCR 产物的可视化和识别，使用了 UV 透照仪并在 E-gel 成像系统上进行了照片记录。PCR 产物使用商业 PureLink™ PCR 纯化试剂盒（Invitrogen，卡尔斯巴德，美国）进行纯化。一些 PCR 产物在墨西哥墨西哥城墨西哥国立自治大学生物技术研究所进行了测序。测序结果在 BLASTn 中进行分析。为了进行序列比较，使用 NCBI/GenBank 数据库（Altschul等， 2012）。

结果

对三十八头公牛进行了取样；从每个样品中获取一份样品；31 例来自包皮灌洗，7 例来自精液。18.4%为阳性样本（7/38）（图1），其中2例来自精液，5例来自包皮灌洗液。7个阳性样本中，有5个PCR产物进行了测序。考虑到 Genbank 中登录号为 JF901335.1 的细菌，对所有序列进行了比较。

通过 PCR 从现场样品中获得的扩增子的核苷酸序列与 GenBank 数据库中发现的扩增子的核苷酸序列相同。分析显示与其他Cfv 的一致性为 99.17% 至 97.87% （图 2）。这些结果表明，Cfv 存在于塔毛利帕斯州中部的牛群中，并且Cfv在牛的生殖健康中发挥着重要作用。

讨论

据记载，BGC 会影响牛群；由胎儿弯曲杆菌( C. fetus )性病亚种( Cfv）。BGC是牛、绵羊和山羊不孕和流产的主要原因之一；阿根廷、巴西、哥斯达黎加、牙买加和墨西哥等美洲大陆多个国家已证实其存在。然而，在墨西哥，这种病原体在畜牧业领域的研究很少。在用作公牛的公牛中检测这种致病亚种对于控制牛群中的这种疾病至关重要，因为它们是无症状的携带者；而且，除了用于直接交配外，精液还经常用于人工授精，包括新鲜的精液和保存在液氮中的吸管。除了不孕问题外，Cff被认为是精子改变的主要原因，因为这些细菌能够粘附在精子上，对顶体膜和精子染色质造成损害，从而降低精液质量，从而降低怀孕率，此外还会影响女性不孕。自然交配过程中细菌传播到生殖道（Cagnoli et al., 2020）。

该疾病的诊断可以通过多种方法进行，例如细菌学分离、血清学方法（例如ELISA和DI）以及分子测定（例如PCR）（Mshelia等， 2010；Clune等，2022）。Groff等人在 2010 年证明，细菌学分离是最不敏感的方法，他们将该方法与 PCR 进行了比较，结果发现这种分子方法比传统细菌学分离的灵敏度高 8.5 倍。在本研究中，根据其他研究人员的建议使用了 PCR；用于鉴定带有cstA基因的Cfv和Cff与virB11基因（Hum等， 1997；Iraola等，2012），考虑到为鉴定这些基因而生成的引物可以检测Cfv和Cff的特定DNA序列；随着 PCR 的发展，在研究区域检测到了 CGB 阳性病例。另一种已使用的方法是 DI；然而，Ferreira en 2002表明该技术无法区分C. fetus亚种。

在墨西哥，自 1994 年以来，肉牛一直出口到美国，塔毛利帕斯州是该国库存量最大的州之一。根据农业和农村发展秘书处（SADER）的数据，在2020-2021年周期中，向美国出口的活牛为30,896头。考虑到需要增加动物数量来满足需求，有必要对影响生殖参数的疾病进行动物健康诊断。诊断的成功很大程度上取决于采样；基于Silveira等人(2018)和Delpiazzo等人 ( 2021)先前报告的报告。

BGC 的患病率在世界不同地区各不相同，并且有多个因素有利于其传播（Hoque等， 2021）。在墨西哥，关于牛体内存在弯曲杆菌的报道很少；我国唯一发现的研究是Barajas 于 2013 年进行的墨西哥热带地区；通过ELISA检测，牛的血清阳性率为21.3%。检测方法不同，采样率较低；本研究中检测到的频率为 18.4%，表明塔毛利帕斯州牛群中存在 BGC。值得一提的是，巴拉哈斯的工作是用来自韦拉克鲁斯州北部养牛场扩展计划的潮湿热带地区的牛进行的，该州毗邻塔毛利帕斯州，气候条件与研究地区相似。

本研究的目的是检测塔毛利帕斯州中部地区的公牛体内是否存在胎儿念珠菌。从 PCR 提示Cfv的 7 个扩增中，通过测序评估了 5 个。生物信息学分析结果证实，扩增对应于virB11基因的一个区域，该区域是仅在Cfv中存在的233bp致病岛序列，而在Cff中不存在，这使得可以通过分子方法区分这两个亚种。本工作中获得的结果与Iraola等人先前发表的结果一致， 2016因此，由于使用带菌公牛进行繁殖而传播这种病原体，流行病学状况可能面临风险。

结论

在这项研究中，胎儿​​弯曲杆菌亚种的存在。通过 PCR 检测到性病菌，并通过测序证实，在塔毛利帕斯州中部地区分析的公牛中出现频率为 18.4%，这是墨西哥首次通过分子方法报告这种细菌。