介绍

鸟类具有与哺乳动物不同的特定形态生理生殖特征。在公鸡的生殖道中，这些问题包括缺乏为射精提供液体的辅助腺体（Álvarez et al ., 2020），以及缺乏像哺乳动物附睾这样参与精子成熟和储存的结构（Asano & Tajima, 2017））。有报道称，公鸡精液“不需要精子获能”来实现受精能力（Lemoine等人，2011），但另一项单独的研究确定了精子获能的必要时期，持续时间为 40 分钟，可以使用培养基在体外诱导富含钙2+。

已在母鸡输卵管的子宫阴道交界处 (JUV) 中发现了精子储存小管 (SST)，该小管通过精子代谢脂肪酸或其他脂质来导致精子失能以进行储存（Long & Conn, 2012；Sasanami, 2013）；最近的研究证明了输卵管蛋白的体外断能作用，但尚未描述精子代谢的任何特征参数（Camarillo等人，2019）。除了细胞间 pH 值变化、Ca 2+渗透性增加之外，精子获能过程中还会发生生化变化和细胞膜流动性改变离子，蛋白质磷酸化模式和脂质组成的修饰。精子细胞获能是顶体反应以获得受精能力的先决条件。在鸟类的生殖道中，SST已经被描述，在JUV中，这些结构的细胞分泌物可以诱导精子去能以进行储存( Sasanami, 2013 ; Camarillo et al ., 2019 ; González et al ., 2019 )。

这些脂肪酸可以从鸟类的饮食中获得（Olubowale等人，2014 年；Ashraf等人，2020 年）有助于维持精子活力并保证交配后长达 7 天的卵母细胞受精（Bakst，2010 年））。

研究尚未揭示精子通过公鸡生殖道时的形态及其形态有任何差异，但相反，对母鸡输卵管中的腺体分泌物有广泛的描述，这些腺体分泌物主要与卵子的形成有关（Zhong等人，2014）。 ，2020）。然而，精子必须完成通过该通道的运输才能到达受精部位（Álvarez et al ., 2017）。关于母鸡生殖道状况与精子储存、成熟和激活相关的研究很少。

高达 50% 的生殖障碍与男性有关；众所周知，精液中丙二醛 (MDA) 增加所引起的氧化应激可能与轴丝损伤有关，导致中段形态发生变化并降低精子活力（Kurkowska等，2020）；糖酵解和线粒体氧化有助于通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷 (ATP)，从而维持精子库中鞭毛的运动性（Setiawan等人，2021），并且谷胱甘肽 (GSH) 的积极作用也已被证明可以保护精子免受氧化压力（Masoudi等人，2019）。

虽然公鸡的繁殖功效因其足够的生育率而闻名（Nakamura，2017），但在生产农场实施人工授精可以通过减少所需公鸡的数量来降低生产成本。此外，精液可以在更高的生物安全条件下运输到各个站点或地点，以确保原始祖父和曾祖父种质系的保存（Nakamura，2017））。迄今为止，人工授精已使用两种精液保存方法，称为贝尔茨维尔和湖家禽精液延长器，它们是 40 多年前开发的，主要用于火鸡。使用这两种方法进行的唯一后续工作旨在改变其成分的浓度，从而反映了我们对该物种的生殖生物学知识的适度进步以及该知识在生物技术开发中的稀缺利用（Asano＆Tajima， 2017）。

在此背景下，本研究的目的是确定母鸡输卵管蛋白对公鸡精子的去能作用的体外参数。这项研究将有助于开发精液保存的新方法，从而提高精子在体外处理和储存过程中的活力。

材料和方法

实验

新鲜精液，在各代谢状态下，进行基础评价和丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）测定，确认其膜功能和ATP水平，验证能量活性；由此评估精子的活力以及精子成熟度和断能的参数。

使用动物

该研究完全符合动物的营养需求，提供了含有 17% 粗蛋白的商业饲料，为畜牧业饲养鸟类提供所需的营养；动物随意饮水。它们被单独饲养在 90 X 90X 120 厘米的笼子里，栖息高度为 90 厘米（Applegate & Angel，2014）。在整个研究过程中提供了足够的住房条件。研究对象是五只罗曼品种的公鸡。为了从输卵管获取液体，使用了 10 只处于第二个三分之一姿势的母鸡，它们分别饲养在类似的条件下。

获取精液

通过每周对每只公鸡进行 3 次背腹按摩来获得射精（Camarillo等人，2019）。精液合并形成总共 25 份池精液，将五只公鸡的精液存放在同一个小瓶中。使用 SL10-1000 微量移液器（RANIN™，美国）从泄殖腔抽吸收集精液。然后将每个精液池与含有 0.6% 果糖、1.92% 谷氨酸钠、0.08% 醋酸镁、0.51% 醋酸钠和 0.128% 柠檬酸钾、pH 7.2 和 330 mOms 的 Lake 培养基混合。仅使用满足正常精液标准的精液：5% 活力、90% 活精子和 < 5% 异常精子（Fattah等，2017）。

输卵管液蛋白质部分的收集和定量

翻转泄殖腔，将 12 口径探针插入输卵管 3 cm 深度，将 3 ml Lake 培养基沉积在子宫阴道联合 (UVU) 中，然后从输卵管收集约 1.54 ml 液体，形成一个水池。从 10 只母鸡中提取的液体保持在 2°C 进行处理（Ito等， 2011）。将其通过 70 μm 细胞滤网过滤，然后以 1500 x g 离心 30 分钟。上清液储存在 -20°C 直至使用（Sedaghat等人，2021）。使用 4 倍体积的丙酮在 2°C 下沉淀来自 UVU 的蛋白质级分 30 分钟，然后以 14000 xg 离心 10 分钟。通过在液氮中蒸发上清液来回收沉积物（Sedaghat等人，2021）。利用分光光度法技术在 595 nm 波长处量化蛋白质浓度（ Ku等人， 2013）。

为了通过一维电泳描述蛋白质级分，将 20 μg 获得的蛋白质放入样品缓冲液中（Tris 0.5 M，pH 6.8，SDS 10%，甘油，0.5% 溴酚蓝和 5% β-巯基乙醇）并100℃维持3分钟。电泳需要用 30% 丙烯酰胺/双酚 37.5:1 (2.6% C) 制备 10% 的分离凝胶和 4% 的压缩凝胶。分离在200伏电泳室中进行45分钟。电极的缓冲溶液由 0.025 M Tris、0.192 M 甘氨酸和 0.1% (p/v) SDS 配制至 pH 8.3 ( Sajjadi et al ., 2019 )。

精子代谢状态的诱导

在每种代谢条件下使用1ml Lake培养基中的200X10 6 个精子的等分试样；在射精后 10 分钟内对新鲜精液进行评估（Camarillo等人，2019）。将精液以 1:1 的比例在 Lake 培养基中于 38°C 孵育 40 分钟，诱导精子获能。

为了诱导断能，将精子在 37.5°C 下孵育 40 分钟，然后在黑暗条件下在补充有 200 µg/ml UVU 蛋白质组分的 Lake 培养基中按 1:1 稀释（Camarillo等人，2019）。顶体反应是在与 20 μg PVL 共同孵育的精子中测定的，以诱导顶体反应（Lemoine等，2011；Camarillo等，2019）。

基本精子评估

通过显微镜（OLYMPUS BX51）在 37.5°C 下使用 40X 物镜估算 15 μl 精液中具有直线前进运动能力的精子百分比。此外，用伊红-苯胺黑（QCA，996518，美国）对 10 μL 精液进行染色，并分析每个样本中的 100 个精子，以在光学显微镜（OLYMPUS BX51）下评估活力和形态（Jabbar等，2015；Fischer）等人，2015）。

精子的代谢参数

丙二醛（MDA）。对每毫升 MDA 的 nMol 浓度进行定量（Najafi等人，2021）。在这种情况下，将1ml 20%三氯乙酸添加到含有100X10 6 个精子的精液等份中，并以1500xg离心15分钟。除去上清液，加入1ml 0.67％硫代巴比妥酸(TBA)，在100℃下孵育10分钟。在低 pH 和高温条件下，MDA 与 TBA 反应生成 MDA-TBA 加合物，可在分光光度计中以丁醇为目标，在 532 nm 处读取该加合物。

还原型谷胱甘肽（GSH）。为了确定 GSH 浓度，采用了荧光反应和荧光分光光度法（Najafi等人，2021）。250 µl 射精精液等分，含有 200X10 6在涡旋中匀浆 3 分钟以裂解精子。接下来，添加 3.70 ml pH 8 的磷酸盐缓冲液，然后添加 1 ml 25% 的偏磷酸。将其以 1500 x g 离心。4°C 30 分钟以释放 GSH。这样回收了 0.5 ml 上清液，用 4.5 ml 磷酸盐缓冲液将其调节至 pH 8。之后，回收 100 µL 之前的混合物，并添加 1.8 mL pH 8 的磷酸盐缓冲液。将其在涡旋中混合，并添加 100 µL 0.1% 的 OPT，以在黑暗条件下均化并稳定混合物 15 分钟。测定在荧光分光光度计中进行，发射速率为420 nm，激发波长为350 nm，5 SLIT 5秒。

三磷酸腺苷（ATP）。确定精子中 ATP 的浓度需要使用腺苷 5´-三磷酸生物发光检测试剂盒 (ATP)（SIGMA Life Science），该试剂盒确定发光发射与存在的 ATP 量成正比（Nguyen等人，2016） 。这是在 Perkin Elmer LS 荧光分光光度计中使用浓度应用程序进行量化的。一份 200X10 6的精液裂解精子以回收 50 µl 裂解液，将其放入装有 50 µL ATP 生物发光检测试剂盒试剂的分光光度计池中。分光光度计测定每个样品中 ATP 的浓度，并将其与试剂盒中包含的 100 微摩尔 ATP 标准溶液发射的强度进行比较。

统计分析

对结果进行优度检验和Jaque-Bera拟合，验证数据的正态性；应用方差分析 (ANOVA) 来确定变量之间的差异 (P<0.05)。Tukey 检验用于确定不同代谢状态下变量的平均值和值之间的差异。所有统计分析均使用免费的 PAST 软件进行（Hammer等，2001）。

结果与讨论

基本评价参数。新鲜精液和获能精子的精子活力百分比（表1 ）相似（P>0.05），分别为96.8%和91.5%。这些百分比高于（P<0.05）对有顶体反应的精子（61%）和去能力精子（40%）测定的百分比。后两者的结果相似（P>0.05）。

对于断能精子和顶体反应精子，虽然活力明显且相似，但低于其他代谢状态。然而，活精子的百分比显示了在所有评估条件下的精子活力。

由于缺乏哺乳动物的动情周期特征（交配与排卵同步），鸟类的繁殖依赖于雌性输卵管中的精子储存（Bakst，2010），以确保当卵母细胞存在受精时，具有受精能力的精子可用。在漏斗部。在存在小管精子储存的情况下，沉积在雌性生殖器中的精子可以在家禽（例如鸡和火鸡母鸡）中存活2-15周（Sasanami，2013）。活精子百分比（表1新鲜精液（97.6%）和获能精子（91.6%）之间相似（P>0.05），并且显着高于（P<0.05）顶体反应精子（72.9%）和去能样本（P<0.05）。 64.4%）。后两种情况的百分比相似（P>0.05）。

一般来说，本研究中测定的活力和活精子的百分比很高，并且在射精和获能精子中相似。这一发现与其他作者的报告一致（Restrepo等，2016），他们观察到精液获能过度活跃的高运动性，这是这种代谢状态的特征。精子过度活跃的特征还在于强烈的、非进行性的运动和低频率的摇尾。

氧化应激指标。研究表明，膜的流动性可以通过胆固醇和磷脂等分子的修饰来改变，这些分子与参与配子识别和膜融合的蛋白质有关。这些分子的作用也已在位于母鸡生殖器官 UVU 中的精管储存精子的过程中得到证实。目前，这被理解为表明它们作为断能因子维持体内精子活力的作用（Sasanami，2013；Matsuzaki & Sasanami，2022）。

新鲜精液中的MDA浓度（表2）为1.59 nmol/ml，显着高于获能精子（1.05 nmol/ml）、顶体反应精子（1.07 nmol/ml）和有顶体反应精子（1.07 nmol/ml）（P<0.05）。去产能的精子（1.05 nmol/ml）。值得注意的是，后三个测定的浓度相似（P>0.05）。

新鲜精液和获能精子中的GSH浓度相似（表2 ），分别为72.6和62.04 nmol GSH/ml（P>0.05）。发生顶体反应的精子中的浓度为 99.09 nmol GSH/ml，与去容量精子中的浓度（86.07 nmol GSH/ml）相似（P>0.05）。然而，这些精子维持了氧化应激、MDA 和 GSH 的水平，证明了膜的稳定性（Setiawan等人，2021）。

在获能和顶体反应期间，精子膜发生变化；我们的研究表明，MDA 和 GSH 的浓度通过将其活力与在获能和去能精子中测定的 ATP 浓度相关联来维持膜的完整性。

另一个重要发现是，获能精子和发生顶体反应的精子中由 ATP 浓度决定的能量水平相似，这说明了UVU 分泌物的蛋白质部分在体外具有去能效应。

新鲜精液、获能精子、顶体反应精子、去能精子中ATP浓度（表2 ）为59.41，

分别为 69.9、66.49 和 51.79 μmol ATP/ml。这些浓度在统计上相似（P>0.05）。在公鸡精子中，已证实通过糖酵解产生 ATP（Dávila等人，2015），因此在我们的研究中，在评估的不同代谢条件下发现相似的 ATP 浓度证明了精子的活力。

在这些研究条件下，通过确定精子在受精过程中所需的能量水平相似，无论其活动或代谢状态、获能、顶体反应和/或断能，证明了断能精子的体外精子活力。阮等人， 2015）。除了维持其活力以及活精子和活动精子的百分比之外，该研究还证明了在 PLV 存在的情况下，顶体反应的体外能力，作为断能精子中顶体反应的天然诱导剂。这证明了精子活力，已知这在体外是有用的预测精子体内受精能力的参数（Lemoine et al ., 2011）。这代表着通过在鸟类中实施辅助生殖技术来拯救具有动物技术意义的遗传系的机会（Romo等人，2022）。

据报道，在精子获能过程后，由于精子能量有限，活力下降（Ferramosca，2014）。相比之下，我们的研究表明，获能精子、去获能精子和顶体反应精子中的 ATP 浓度相似。这表明显然需要开发限制或减少精子代谢能量消耗的精子保护方法。这项研究的重要发现表明，精子活力降低，从而诱导了去能的代谢状态。

结论

这项研究的结果表明，精子的代谢参数与UVU 液体的蛋白质部分诱导的体外精索断能有关。该蛋白质部分可以作为体外精子保存介质的成分，以减少新陈代谢并维持精子活力。