介绍

营养和繁殖通常是相关的，因为动物的繁殖成功取决于其营养状况。多年来人们一直在研究这种关联的影响，通常通过以各种方式改变饮食来观察动物生殖参数的变化（Yeste et al ., 2011）。最显着的变化之一是在饮食中添加多不饱和脂肪酸（通常用其缩写词 PUFA（多不饱和脂肪酸）来指代）。已经在哺乳动物的饮食中研究了不同来源的 PUFA，例如 omega-3 和 omega -6，据观察，食用它们会影响女性的一些生殖功能，例如卵巢中卵泡直径和数量的增加（Nurlatifah等人，2020）；以及第一次排卵时间较短（ Salehi等人， 2016）以及对生育能力的积极影响（ Rebollar等人，2014）。在男性中，它会增加性欲（ Castellano等人， 2010）、睾丸大小（Van Tran等人，2017；Mínguez-Alarcón等人， 2017）、精子浓度（Alizadhe等人， 2014； Fair等人） ……， 2014； Rodrigues等， 2017），运动性（ Alizadeh等， 2014；刘等人， 2015；Rodrigues等人， 2017）和精子活力（Alizadhe等人， 2014； Esmaeili等人， 2012 b）。同样，精子线粒体膜的组成和结构（ Gürler等，2015）负责产生鞭毛运动所需的能量，增加其流动性和可塑性，从而增强其功能（ Sullivan等，2018） 。

在大多数哺乳动物组织中，最主要的脂肪酸是亚油酸 (18:2 n-6)，其浓度反映了饮食摄入量（Guenet & Carlson，2015）。亚油酸是通过食用植物油获得的，例如向日葵油、大豆油、玉米油和菜籽油；以及坚果和种子（Sullivan等人，2018）。大豆油由多种物质组成，主要是多不饱和脂肪酸，特别是亚油酸 (LA, C18:2)，这是一种 omega-6 (ω6) 脂肪酸，约占大豆油的 55%（Deol等，2017）还有亚麻酸（ALA，C18：3），一种 omega-3 (ω3) 脂肪酸，约占 5-9%（Sullivan等人， 2018）。

另一方面，大多数哺乳动物精子膜中最丰富的 PUFA 是 omega-3，它通过提供流动性和渗透性在精子细胞功能中发挥重要作用。这与进行受精的能力有关（Esmaeili等人， 2012 b），并与抗冷冻能力的增加有关（Towhidi等人，2012 年；Fair等人， 2014 年）。

据描述，公羊精子在冷冻保存过程中比其他哺乳动物更容易受到冷休克的影响（Grötter et al ., 2019）。这些差异部分归因于脂质成分（Mandal等，2014；Chunrong等，2019）和精子膜中存在的 PUFA 含量（Mandal等， 2014）。此外，哺乳动物无法从头合成在 n-6（亚油酸系列）和 n-3（亚麻酸系列）位置具有双键的脂肪酸，因为它们缺乏去饱和酶（Byrne等，2017），因此 PUFA 必须是包括在饮食中。

本研究的目的是评估日粮中添加 3% 和 6% 的富含 n-6 和 n-3 PUFA 的大豆油对 Pelibuey 公羊精液冷冻保存的影响。

材料与方法

地点

该研究于 2018 年 9 月至 11 月在墨西哥尤卡坦州莫科查市国家林业、农业和畜牧研究所 (INIFAP) 的佩利布伊和黑腹公羊种质库进行。该州位于北纬 21° 05' 和 21° 10' 纬线以及西经 89° 27' 和 89° 30' 子午线之间，海拔 9 m。该地区主要气候为温暖半湿润气候（Aw0），夏季降雨量大，雨量997至1132毫米，年平均气温26.5℃。

动物

使用27只Pelibuey品种的雄性公羊，平均年龄为2.0±0.5岁，平均活重为42.5±2.9kg，体况为3.5（1至5分制）。同样，经证实，这些动物没有表现出任何可以将它们排除在研究之外的身体异常。

喂养

将公羊随机分为三组（每组n = 9），在饮食中为每组提供不同百分比的大豆油（SO）：对照处理（T1）：（0％SO）；处理 2 (T2)：3% SO 和处理 3 (T3)：6% SO，补充 30% 的商业饲料（NUTRIMYN Borrego 14% PC、MYN Distribuidora de S. A de CV）和 70% CT-115 草（Pennisetum purpureum）（表1）。每天早上（11:30h）以 450 g-1/a-1/d-1 的速度免费提供饮食，持续 60 天（公羊精子发生：58 天；Díaz等人，2017 年），包括14 天的适应期，在饮食中逐渐添加大豆油（Bakers & Chefs®，埃莫西约，墨西哥），直到达到每次治疗中设定的水平。

获取精液样本

使用人造阴道并在作为假人的母羊的帮助下，选择了 162 次射精（6 次射精/ram-1；54 次/组-1），这些射精符合以下标准：体积 > 0.5，质量运动 > 4（等级 0-5），活力 >70%，精子浓度 >3,000 x 106 个精子/mL（Arando等人， 2019，2020）。精液采集频率为每周两次（每次射精/天/种马），采集时间为早上（8:00），并在补充期后持续 3 周。

精子稀释

将选定的精液用 Triladyl® + 双蒸水 + 20% 蛋黄稀释至终浓度为 400 x 106 个精子/mL，然后装入 0.25 mL 法式吸管（Minitüb®，Tiefenbach，德国）中。

冷冻精液

将吸管置于液氮 (LN2) 表面上方 4 cm 处，冷冻样品 10 分钟；之后立即将吸管浸入液氮中并储存直至评估。

精液解冻

解冻过程是将吸管浸入 37°C 水浴中 30 秒。

精子浓度

将 5 µL 精液样品稀释在 995 µL 蒸馏水中。随后，将 9 µL 稀释样品放置在 Bücker 室两侧，并使用 AI Station 计算机精子分析系统（SPERM.TECH®，巴伦西亚，西班牙）捕获每侧的 4 个视野。

精子活力

使用 AI Station 系统分析活力，将 5 µL 解冻精液稀释至约 30 x106/mL 精子，置于预热至 37°C 的 Makler® 计数室（Sefi Medical Instruments，以色列海法）上；至少捕获了 5 个视野，每个样本至少有 300 个精子。分析的运动参数为：总运动（TM，%）、渐进运动（PM，%）、曲线速度（VCL，μm/s）、直线速度（VSL，μm/s）、平均速度（VAP，μm/s） )、线性指数 (LIN= VSL/VCL x 100)、直线度指数 (STR= VSL/VAP x 100)、振动指数 (WOB= VAP/VCL x 100)、头部横向位移幅度 (ALH, μm) 和尾部拍频（BCF、Hz）。

精子活力

通过 SYBR-14 和碘化丙啶 (PI) 染色（Live/Dead® 试剂盒 L-7011，InvitrogenTM）对其进行评估。样品用 1 µL SYBR-14 (10 µM) 和 1 µL PI (12 µM) 染色，并在 37°C 避光条件下孵育 10 分钟。随后，将 5 µL 样品置于 37°C 预热的载玻片上，并使用落射荧光显微镜 (LWScientific i40-DNA) 进行评估。通过计算每个样本 200 个精子来确定活细胞的百分比。用 SYBR 14（绿色荧光）染色的细胞被认为是有活力的；而用 PI（红色荧光）染色的细胞则被认为是死亡的。

顶体完整性

通过 FITC-PSA 染色（100μg/mL，L-0770，Sigma-AldrichTM）进行评估。样品用 5 µL FITC-PSA 染色，并在 37°C 避光条件下孵育 30 分钟；立即将 5 µL 样品置于载玻片上并进行评估。通过计算每个样本 200 个精子来确定具有完整顶体的细胞百分比。FITC-PSA（绿色荧光）染色的精子被认为顶体受损；而那些没有荧光的则被认为是完整的。

线粒体活性

使用 JC-1 染色（153 µM，Molecular Probes® T-3168，InvitrogenTM）进行分析。样品用 1 µL JC-1 染色，并在 37°C 避光条件下孵育 10 分钟；然后将 5 µL 样品放在载玻片上进行分析。

通过对每个样本 200 个细胞进行计数来确定具有线粒体活性的精子百分比。鞭毛中部发出橙色荧光的精子被认为具有线粒体活性；而那些不显示荧光的则被认为没有线粒体活性。

尾部质膜完整性（HOST）。

将 5 µL 精子样本稀释在 50 µL 内渗溶液（0.735 g 二水柠檬酸钠和 1.351 g 果糖，溶解在 100 mOsm/L 的蒸馏水中）进行评估，并在 100 mOsm/L 下孵育 1 小时。 37°C。随后，将 5 µL 样品置于载玻片上并用相差显微镜进行分析。通过计算每个样本 200 个细胞来确定带有 HOST 的精子百分比。具有卷曲尾部的精子被认为具有完整的尾膜（正内渗）；而那些没有卷曲尾巴的则被认为是尾膜受损（负内渗）。

统计分析

以百分比表示的变量：总运动性、前进运动性、活力、线粒体活性、完整顶体和宿主，在分析前转换为反正弦√（变量）/100。随后，对它们进行了方差分析；为了发现治疗之间的统计差异，通过统计分析系统统计包（ SAS Inst. Inc.，2011 ）使用P≤0.05的Tukey检验。

结果与讨论

大量研究表明，在饮食中添加多不饱和脂肪酸可以通过影响精子细胞的功能（Sullivan等，2018）及其抗冷冻能力（Towhidi等，2012；Fair等， 2014）来改善精子细胞的功能（Sullivan 等，2018）。它们的膜的组成和结构。另一方面，其他研究提到，含有PUFA的饮食会增加精子质膜脂质中DHA的含量（Gholami等， 2010），导致胆固醇含量降低，从而提高精子的敏感性冷休克（Díaz等人，2017）。从这个意义上说，从治疗 T1 和 T3 获得的值与 T2 相似且优于 (P<0.05)，无论是总运动 (57.8±2.3;59.6±2.6% vs 46.8±3.3%) 和渐进运动 (27.0±0.3) ；分别为 30.2±1.2% 与 14.0±2.1%）。这些结果与Losano等人记录的结果相似。(2017)之前用 6% 棕榈油喂养 60 天的公牛的解冻精液中；以及Díaz等人的报告。(2017)在先前补充了 3% 鱼油的阿劳卡诺种公羊的解冻精子样本中，总活力下降，其他活力参数与对照处理相比没有差异。

就Khoshvaght等人而言。(2016)，观察到先前补充 3.5% 鱼油 11 周的荷斯坦公牛解冻精液中的前向运动性更高，与补充 50 克共轭亚油酸 (Lutrell®) 的荷斯坦品种公牛解冻精液样本中报告的结果相似）持续 10 周（Karimi等人，2016）。在平均速度（VAP）方面，T1（71.4±4.7μm/s）的结果高于（P<0.05）T2和T3（分别为53.8±3.0和50.3±6.8μm/s）；而对于分析的其余其他运动参数（LIN、STR、WOB、ALH 和 BCF），治疗之间没有发现差异（P>0. 05）（表 2）；这与伯恩的发现相似等人。(2017 ) 在用红花油喂养的青春期荷斯坦公牛的解冻精子样本中；其中运动参数未受影响，但头部位移 (ALH) 的幅度相对于对照组更高。

众所周知，动物油（如鱼油）含有比植物油（Omega-6）更高浓度的 n-3 PUFA（Omega-3）；甚至有研究表明，在饮食中补充 n-3 PUFA 可以改变精子膜的脂肪酸组成，从而提高精液质量。这些影响已在公羊（Samadian等人，2010；Díaz等人，2017）、马（Brinsko等人， 2005）、猪（Rooke等人， 2001）、公牛（Khoshvaght等人， 2016；Byrne等人， 2017），狗（Alonge等人，2019）和人类（ Martínez-Soto等人，2012）精子。

关于顶体完整性，T1 (66.6±7.6%) 的结果较高 (P<0.05)，而 T2 和 T3 (分别为 41.3±3.8 和 29.2±5.2%)。这与Losano等人的报道类似。(2017)之前喂食 6% 脂肪酸 60 天的公牛的解冻精子样本；然而，它与Byrne等人报道的不同。(2017)在饲喂红花和鱼油 10 天的青春期荷斯坦-弗里西亚公牛的解冻精液中。与Díaz等人的描述相反。(2017)取自阿劳卡诺种公羊的解冻精子样本，这些公羊喂食鱼油 60 天。这一结果可能是由于样品冷冻和解冻过程引起的氧化应激增加，而PUFA对精子膜对脂质过氧化的敏感性增加的影响又加剧了这种氧化应激。

T1的存活率（43.3±6.5%）与T2（36.6±3.1%）和T3（53.0±4.6%）相似；尽管T2和T3不同(P<0.01)(表3 )。这些结果与Moallem等人获得的结果相似。（2015），洛萨诺等人。（2017）和伯恩等人。(2017)饲喂脂肪酸和 omega-3 13 周的公牛的解冻精子样本；以及与对照处理相比，分别饲喂脂肪酸 (Megalac®) 60 天的公牛和饲喂红花和鱼油 12 天的青春期荷斯坦-弗里西亚公牛的解冻精液样本。然而，这些结果与Díaz等人报道的不同。(2017)，相对于 60 天的鱼油膳食补充剂治疗，对照治疗中解冻的绵羊精子样本的活力更高。另一方面，Khoshvaght等人。(2016)报告称，荷斯坦公牛解冻精液样本中的精子活力较高，这些公牛之前补充了鱼油 11 周。

不同的研究表明，与基础饮食相比，增加牛精子长链 n-3 PUFA 的浓度并不会明显改善质膜流动性（Moallem等， 2015）；伯恩等人。(2017)，本研究的公羊精子中的大豆油中的 n-6 PUFA 可能会发生这种情况。

T3时的线粒体活性（65.3±6.5%）分别高于T1和T2（37.3±7.3和33.6±3.5）（P<0.05）。这些结果与Losano等人报告的结果不同。(2017)其中，对先前饲喂 6% 脂肪酸 60 天的公牛解冻的精子样本进行处理之间，线粒体活性没有表现出差异。研究表明，在饮食中添加 n-6 PUFA 可以使磷脂与质膜整合，取代线性和刚性更强的饱和脂肪酸，从而增加膜的流动性和可塑性，促进细胞膜的形成。与膜酶蛋白的相互作用及其功能（Sullivan等人，2018）。同样，这些磷脂（占线粒体磷脂的 10%）数量的减少会改变膜电位（Jiang等，2000）。在大多数哺乳动物组织中，最主要的脂肪酸是亚油酸 (18:2 n-6)（Guenet & Carlson，2015），它是通过膳食植物油获得的，例如

如向日葵油、大豆油、玉米油和菜籽油；以及坚果和种子。这种酸对于线粒体呼吸链的几个复合物的正确功能是必需的，因此它与 ATP 生成（ Mileykovskaya等人，2005）、通过细胞色素 bc1 的质子传导（Lange等人，2001）等重要过程有关。; 以及在呼吸速率高时防止渗透不稳定和链解偶联（Koshkin & Greenberg，2002）。

尾部质膜完整性（宿主测试）无显着性差异（P>0.05）；这与饲喂 50 克亚油酸的荷斯坦公牛解冻精液中报道的结果一致（Karimi等，2016）。然而，古拉米等人。(2010 )提到n-3 PUFA增加了精子头部和尾部头片中DHA的掺入，从而影响精子膜的生化成分，使其具有更好的可塑性和稳定性。

最后，本研究中获得的这些与其他作者的结果相矛盾的结果可能与许多因素有关，例如：物种和动物品种、补充时间、动物的繁殖状况、精子膜中存在的 PUFA 量、浓度和浓度。添加到饮食中的 PUFA 类型等（Esmaeili等人，2012 a；Liu等人， 2015；Martínez-Soto等人， 2012）。

在公羊中，膳食 n-3 PUFA 会导致精子脂肪酸谱发生改变，对精液质量及其冷休克耐受性发挥重要作用，这是由于 DHA 融入细胞膜磷脂中（Esmaeili等， 2012 b） ），因为已表明精子膜中 DHA 的含量与其耐冷冻性之间存在关系（Martínez-Soto等人，2012）。另一方面，有文献记载，膳食中的 n-3 PUFAS 会促进精子膜对脂质过氧化的敏感性，从而影响精子的受精能力。尽管如此，据报道，富含维生素 E、锌、硒、叶酸和 n-3 PUFA 的饮食至少两个月，摄入足够的量，可以改善精子数量和质量，特别是精子数量和活力，从而改变精子活力。精子细胞膜的物理和功能特性（Alonge等人，2019）。从这个意义上说，未来需要进行基于 PUFA n-6 脂肪酸的补充剂及其与抗氧化剂的关联的研究，以防止脂质过氧化作用可能造成的损害。

结论

在基于商业饲料和 CT-115 草的日粮中添加大豆油并不能改善 Pelibuey 公羊精液的冷冻保存，尽管添加 6% 会增强线粒体活性。