背景
阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）是植物细胞中广泛分布的成分，具有多种功能。一般来说，AGPs存在于各种组织中，主要存在于质膜（PM）、细胞壁、细胞间隙以及植物分泌的可溶性渗出液中。细胞水平的研究表明，AGP 的特异性定位有助于质膜和细胞壁之间连续体的形成 [ 1 , 2 ]。AGP 被归类为具有多种糖基化变异（糖型）组合的蛋白聚糖 [ 3 , 4]。AGP 多肽序列和 AG 多糖链的复杂性（不同数量的各种糖的存在）是导致 AGP 结构高度可变性的主要因素 [ 2 , 5 ]。蛋白多糖总分子质量的约 10% 由蛋白质部分组成 [ 2 ]。作为富含羟脯氨酸的糖蛋白家族（ HRGP）的一部分，AGP 含有大量羟脯氨酸残基[ 2,6,7,8 ]。脯氨酸/羟脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸在其N端结构域中也很常见[ 9 , 10 , 11]。在 AGP 的生物合成和翻译后修饰过程中，脯氨酰 4-羟化酶 (P4H) 将脯氨酸 (Pro) 转化为羟脯氨酸 (Hyp)，这是分子糖基化过程所必需的。当脯氨酸羟基化不发生时，AGP 不会正确糖基化，脯氨酸羟基化过程的变化会导致它们分解或转变为较低分子量的多肽 [ 9 , 12 ]。反过来，大约 90% 的分子由碳水化合物链组成，富含阿拉伯糖、半乳糖，偶尔还含有 D-葡萄糖醛酸 (GlcA)、L-鼠李糖 ( L -Rha) 和糖醛酸 [ 13 ]。大多数 AGP 具有一个或多个已被O 修饰的羟脯氨酸残基。-被II型AG糖基化。它们主要由 (1 → 3)-β-半乳聚糖和 (1 → 6)-β-连接的半乳​​聚糖链组成，它们通过 (1 → 3, 1 → 6) 连接的分支点相互连接，末端阿拉伯糖基残基位于 O 中。 -3 和O -6 位置。II 型 AG 的大小因 AGP 的不同而不同，估计通常在 30 到 150 个糖残基之间。由于其结构中包含不同的糖残基，AGP 的侧链差异很大。L-阿拉伯糖 ( L -ARA) 残基与 GLCA、RHA、4- O-甲基-葡萄糖醛酸 (4-Me-GlcA)、D-木糖 (Xyl)、D-甘露糖 (Man)一起存在于侧链中), D-葡萄糖 (Glc),D-半乳糖醛酸 (GalA)、d-葡萄糖胺 (GlcN) 和L-岩藻糖 ( L -Fuc) [ 4,13,14 ]。两个部分都可以形成分子量范围为 60 至 300 kDa 的 AGP 分子 [ 15 ]。

此外，AGP 中存在结构-功能关系。AGP 的功能基于其聚糖的直接功能[ 15 ]。众所周知，AGPs与植物生长和发育的各个重要阶段有关，包括种子萌发、体细胞胚胎发生、花粉管形成、细胞分裂、细胞通讯和程序性细胞死亡[ 4 , 16 ]。据报道，AGP 已被证明是细胞生长和分化过程的调节剂、细胞表面信号的转导器以及环境响应的信号传导途径 [ 17 , 18 ]]。Leszczuk 及其同事对水果中 AGP 进行的原位和异位研究表明，AGP 在水果组织中始终存在，并且可能在发育和成熟过程中诱导水果发生变化 [ 12 , 19 ]。在分子水平上对水果中的 AGP 进行分析，即离子结合、细胞壁-质膜完整性的建立以及与其他细胞壁成分的交联 [ 20 ]，表明 AGP 对水果细胞壁溶解和随后的反应有影响。软化[ 14 ]。

因此，AGP 的表征，特别是其在水果代谢中的假设功能，需要采用多种技术，例如基于碳水化合物表位检测的免疫细胞化学方法。我们编写了一份实用指南，其中包括可应用于水果 AGP 研究的方法。本文的目的是为水果中 AGPs 研究中常见研究技术的使用和调整提供逐步说明，但在研究水果组织中 AGPs 的特异性之前，应正确调整和修改这些方法。发育和成熟过程。而且，

用于 AGP 定性和定量分析的免疫细胞化学方法
AGP 可以使用各种原位和异位技术来发现、测量和定位 [ 10 ]。然而，由于 AGP 的蛋白质和碳水化合物部分的结构和组成多样性，每种技术都有一些优点和缺点。此外，众所周知，水果组织是特定的，需要适当的处理和选择适当的方法 [ 21 , 22]。原位研究允许在实际植物/水果环境中研究生物过程，这对于理解 AGP 功能和各个细胞外基质成分之间的相互作用以及它们对所有应激因素的反应非常重要。然而，原位分析必须辅以同等的非原位研究。对孤立 AGP 的异位研究可能无法准确反映自然环境中发生的过程。提取过程始终与将 AGP 分子从基质中分离的需要以及降解过程（尤其是蛋白质部分）的进展相关。最重要的是，只有对孤立的 AGP 进行分析才能描述 AGP 的特征，这些特征是与细胞功能相关的持续过程的结果。现在，研究 AGP 最有效的方法之一是免疫细胞化学。免疫印迹、膜上免疫印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA 测试）等异位方法，包括分子表征和定量检测，可用于鉴定 AGP 表位。反过来，用于此目的的原位方法通常基于免疫荧光技术和免疫金标记，允许在细胞和亚细胞水平上可视化 AGP 分布。23 ]。两种技术都有助于全面描述水果中 AGP 的存在。

上述方法基于特异性识别感兴趣靶标的个体抗体。该抗体可检测并结合精确定义的抗原表位。通过使用与这些蛋白聚糖中存在的结构复杂基序结合的特定单克隆抗体 (mAb)，可以在植物组织中检测到 AGP [ 24 ]。此外，通过广泛使用抗 AGP 单克隆抗体（如 JIM8、JIM13、JIM14、LM2 等）获得的 AGP 聚糖结构知识表明，AGP 在果实生长和成熟过程中表达不同[13 ]。表1列出了 AGP 研究中常用的市售抗体的特性。

表1 特异性抗体识别的AGP表位表征
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所有免疫细胞化学技术均基于由连续步骤组成的一般模式：材料准备 (1)、使用一抗和二抗的免疫细胞化学反应 (2)，以及使用适合特定方法的适当工具进行信号检测和测量 (3)。首先，对适当制备的水果组织进行固定后膜透化。尽管抗原抗体结合具有高度特异性的特点，但也存在非特异性抗体相互作用的可能性。为了防止和减少非特异性背景染色，在免疫细胞化学反应之前需要进行封闭步骤，其中包括将材料与来自其他动物物种的免疫无活性（不含特异性抗体）血清（即 2-10% 牛血清白蛋白溶液）一起孵育。牛血清白蛋白）[ 37]。在下一步中，将检查的材料与识别特定抗原（一抗）的未标记抗体一起孵育。然后，洗掉未与抗原结合的过量抗体，并使用与标记分子缀合的所谓二抗进行第二个孵育步骤，这有助于使用成熟的方法进行检测[ 38 ]。在这里，详细描述了用共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 成像的免疫荧光标记、用透射电子显微镜 (TEM) 成像的免疫金标记、免疫印迹和 ELISA 测试的方案，重点是应修改的基本步骤。水果 AGP 分析。

原位研究——显微方法
现代生物成像方法有助于细胞和亚细胞水平上表位分布的可视化[ 39,40,41 ]。植物中AGP的存在可以使用两种免疫细胞化学方法来证明，即免疫荧光标记和免疫金标记（表2）。

表 2 基于抗体探针的显微技术在 AGPs 研究中的应用、优点和缺点
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显微方法组织制备方案
新鲜水果的组织非常脆弱，水分含量高，容易受损。因此，通过适当的制备步骤制备足够的薄片通常是有利的。材料应经过固定、树脂包埋和薄或/和超薄切片的程序 [ 42 , 43]。CLSM 和 TEM 样品制备的基本步骤相同：在固定液中固定、在梯度系列乙醇溶液中脱水、在树脂中包埋和聚合。化学固定剂和缓冲溶液的选择取决于 CLSM 和 TEM 研究的目的，并且需要优化水果组织的程序，以进行结构研究和 AGP 碳水化合物表位的标记。固定步骤中遇到的一个常见问题是戊二醛的使用。此外，嵌入阶段和适当树脂的使用对于样品块和切片的最终质量至关重要。与其他植物组织相比，环氧树脂不能用于水果组织的 CLSM 和 TEM 成像 [ 42 , 43]。这是由于其高粘度和破坏细胞结构的可能性。这种树脂的另一个缺点是染色能力差，而染色能力是水果组织显微分析的基本标准。LR White 树脂是一种低粘度、无毒的丙烯酸树脂，具有极少的非特异性染色，这使其成为渗透水果组织的理想工具。此外，LR White 树脂提供了在 CLSM 和 TEM 中使用一个模块的机会，这无疑推进了切片步骤。此外，LR White 树脂切片具有亲水性，因此免疫细胞化学试剂可以轻松渗透到切片中。该方法的流程如图1所示 。

图。1
图1
显微方法的制备顺序方案。(1)植物材料的制备、固定和封装。(2) 胶囊与固定植物材料的聚合。(3)将胶囊切成半薄片和超薄片。(4) 将切片安装在聚 L-赖氨酸涂层玻璃片（用于 CLSM）或镍网格（用于 TEM）上。(5) 免疫荧光标记——聚-L-赖氨酸包被切片上的方法。(6) CLSM 成像。(7) 免疫金标记 – 使用福尔玛薄膜在网格上进行的方法 (8) 使用 TEM 成像。使用 BioRender.com 创建

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程序
1.
将水果组织切成立方体形状。

2.
将 PBS（磷酸盐缓冲盐水）中的 2% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛添加到果实组织中。

3.
将含有固定液的组织置于真空 (0.7 bar) 中七次，每次真空后休息 10 分钟。接下来，将组织置于真空下过夜。

4.
在 RT（室温）下用 PBS 清洗样品 3 次，每次 15 分钟。

5.
除去溶液并在室温下用蒸馏水洗涤样品 3 次，每次 15 分钟。

6.
除去溶液并用分级的系列乙醇溶液开始脱水过程。添加 30%、50%、70%、90% 和 96% 乙醇，在 RT 下各 15 分钟。

7.
除去溶液并在室温下添加 99.8% 乙醇两次，每次 30 分钟。

8.
用 99.8% 乙醇和 LR White 树脂的 3:1、1:1 和 1:3 混合物代替乙醇，在室温下各 2 小时，并在 4°C 下用 100% LR White 树脂过夜。

9.
除去溶液并更换为 100% LR White 树脂（用 LR White 树脂渗透样品）。将样品在 RT 下放置 8 小时。

10.
将样品封装在明胶胶囊中，并在 55°C 下开始聚合 48 小时。

11.
在包含嵌入材料的块上准备适当尺寸的切割平面（修剪阶段）。

12.
切半细条。(1 µm) 使用配备玻璃刀的超薄切片机。将切片安装在聚-L-赖氨酸涂层玻璃载玻片上。

13.
切割超薄宗。(70 nm) 使用配备金刚石刀的超薄切片机。将切片安装在 Formvar 薄膜涂层镍方形网格上。

批判的
(1)
样品在室温下在 100% 树脂中的停留时间不应超过几天；否则，它们将开始聚合。

(2)
使用 LR White 放置水果组织需要一系列分级的乙醇，而不是丙酮，因为丙酮残留物可能会阻碍聚合。

(3)
不能加快用树脂饱和组织的步骤，因为该步骤时间不足会导致组织固定不良，从而无法切片。里面的块会太软。

(4)
应使用带有聚甲醛的镍方网而不是更常见的铜网来放置电子显微镜切片，因为它们不发生反应且不与抗体发生反应。

使用基于抗体的探针进行免疫荧光标记和细胞水平的 CLSM 成像
了解 AGP 在果实组织中的精确分布至关重要，因为它们在果实生长、发育和成熟中发挥着关键作用。免疫荧光使研究人员能够观察水果组织内的 AGP，从而深入了解它们的数量、定位、动态以及与其他细胞成分的相互作用 [ 44 , 45 ]。在免疫荧光技术中，将水果切片放置在聚-L-赖氨酸包被的切片上，将其与识别 AGP 碳水化合物部分的一抗单克隆抗体一起孵育（表1 ））。为了标记水果组织，我们使用了比其他研究中通常使用的抗体更稀释的抗体，并且按照生产商的建议。事实证明，1:10 的浓度太高，导致非特异性结合和 AGP 表位分布的可视化效果不佳 [ 34 ]。随后，为了可视化 AGP表位，将切片与缀合有荧光标记的二抗一起孵育[ 6,44,46 ] 。荧光信号的强度由 CLSM 图像确定，这揭示了样品中 AGP 表位的数量[ 44,47,48 ]]。由于 AGP 分布在细胞壁和膜区室的边界，因此需要使用 Calcoflor White 染色剂以更好地观察 AGP 表位。这种荧光蓝色染料染色纤维素可以标记细胞壁的整个表面。对于来自不同成熟阶段的样品，在过程的最后阶段可以观察到免疫荧光的快速消失，这与AGP含量较低和表位数量较少有关。Dako 荧光封片剂可延缓荧光信号的衰减，从而在封片后允许更长的成像时间，可用于增强荧光的可视化。该方法的示意图如图 2所示。

图2
图2
CLSM 图像，放大了成熟第一阶段 (1) 和成熟最后阶段 (2) 的水果细胞壁。使用免疫荧光方法获得的结果 - 标记细胞壁的灰度值分布图（用白线标记）

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程序
1.
使用超薄切片机和玻璃刀准备半薄 (1 µm) 切片。

2.
将切片放在聚-L-赖氨酸涂层的载玻片上，并在 45°C 下干燥。

3.
使用液体阻滞剂 Dako-Pen 在玻璃上的部分周围绘制疏水屏障 [ 49 ]。

4.
用 PBS 清洗切片两次，每次 15 分钟。

5.
添加封闭缓冲液（PBS 中的 2% BSA 溶液）并在 RT 下孵育 30 分钟。

6.
除去封闭缓冲液并用 PBS 在 RT 下清洗切片 15 分钟。

7.
添加在 PBS 中的 0.1% BSA 溶液中以 1:50 稀释的一抗，并在 4°C 下孵育过夜。第二天，室温孵育 15 分钟。

8.
除去溶液并用 PBS 在 RT 下清洗切片四次，每次 20 分钟。

9.
添加与荧光标记缀合的二抗，在 PBS 中的 0.1% BSA 溶液中以 1:200 稀释，并在 4°C 下孵育过夜。第二天，室温孵育 15 分钟。

10.
除去溶液并在 RT 下用 PBS 清洗切片两次，每次 15 分钟。

11.
在 RT 下用蒸馏水清洗切片五次，每次 10 分钟。

12.
用 Calcoflor White 染色切片以对比图像。

13.
使用 CLSM 可视化这些部分。

14.
无需与一抗孵育即可进行对照反应。

批判的
(1)
将切片放置在聚 L-赖氨酸包被的玻璃载玻片上非常重要，以防止其在接下来的免疫标记步骤中流失。

(2)
将温度提高到 45 °C 以上无法加速带有切片的载玻片的干燥。这会导致聚合组织产生波纹，从而降低免疫荧光标记和 CLSM 成像的质量。

(3)
整个贴标过程必须在潮湿的封闭空间内进行。

(4)
一些额外的解决方案可以减少非特异性结合：将去污剂吐温添加到洗涤缓冲液中，使用过量的洗涤缓冲液，并尝试通过用吸水纸轻敲玻璃来去除所有洗涤缓冲液。

(5)
使用二抗（即 Alexa-Fluor 488）的步骤应在黑暗中进行。

使用 TEM 在亚细胞水平进行免疫金标记和成像
免疫金标记方法将电子显微镜的分辨率与免疫标记的特异性相结合，可以在水果组织的亚细胞水​​平上精确可视化 AGP。通过使用与金纳米粒子缀合的二抗，可以识别 AGP 并揭示它们在细胞壁组装、信号传导和细胞间通讯中的参与 [ 40 , 43 ]。与其他免疫细胞化学方法一样，用于 AGP 研究的免疫金标记需要对组织制备方案进行技术修改 [ 50 ]。使用针对特定 AGP 表位的一抗单克隆抗体，将水果切片放置在由 formvar 层覆盖的网格上 [ 51]。应使用与一抗特异性的胶体金颗粒缀合的抗体作为二抗。由于其高电子密度和点状形状，耦合胶体金颗粒很容易被识别为黑点并进行计数。与标准植物样品制备方案相比[ 50 ]，四氧化锇处理被排除在外。省略此步骤是为了避免样品质量恶化，因为使用 OsO4 处理通常会导致水果组织 TEM 成像期间标记点的强度降低。尽管如此，在没有这种解决方案的情况下，细胞内的细节仍然保存完好。该方法的示意图如图 3所示。

图3
图3
带有标记的 AGP 的 TEM 图像。表位以黑点形式可见（红色圆圈）。放大图，带下划线的 AGP 在特定细胞区室中的定位。缩写：CW – 细胞壁（黄色）、PM – 质膜（绿色）、ML – 中层（蓝色）、C – 细胞质（粉色）

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程序
1.
使用超薄切片机和 45° 角的金刚石刀制备超薄 (70 nm) 切片。

2.
将切片放在 Formvar 薄膜涂层的镍网上。

3.
将封口膜放在培养皿上，这是进行免疫金标记所必需的。

4.
用蒸馏水清洗网格3次，每次10分钟。

5.
添加封闭缓冲液（PBS 中的 1% BSA 溶液）并在 RT 下孵育 30 分钟。

6.
添加在 PBS 中的 0.1% BSA 溶液中按 1:10 稀释的一抗，并在 37°C 下孵育 3 小时。

7.
除去溶液，用 1% BSA 的 PBS 溶液清洗网格 3 次，每次 10 分钟。

8.
添加与金颗粒缀合的二抗，以 1:50 稀释在 PBS 中的 0.1% BSA 溶液中，并在 37°C 下孵育 1 小时。

9.
除去溶液并用 PBS 清洗网格两次，每次 10 分钟。

10.
用蒸馏水清洗网格五次，每次 10 分钟。

11.
让网格在干净的滤纸上干燥，然后将它们放入 TEM 网格存储盒中。

12.
添加过滤的 1% UA 水溶液（乙酸双氧铀）并在 RT 下孵育 10 分钟。

13.
用蒸馏水清洗网格三次，每次几秒钟，然后晾干。

14.
添加过滤的雷诺试剂（柠檬酸三铅）并在室温下孵育 7 分钟。

15.
用蒸馏水清洗网格3次，每次几秒钟，让其干燥，然后将其转移到网格盒中储存。

16.
使用 TEM 可视化切片并检查图像。

17.
无需与一抗孵育即可进行对照反应。

批判的
(1)
使用 0.2 µm 过滤器过滤两种染色溶液，因为此步骤将防止网格污染。

(2)
网格必须是漂浮的，而不是浸没的。

(3)
为了防止网格污染，将 NaOH 颗粒放置在染色容器周围以吸收 CO 2和湿气。

异位研究——分子方法
分子分析的异位方法是分析从水果组织中分离的 AGP 的理想方法。这些方法基于对提取过程中获得的材料的研究，可以进行定性和定量分析。现代分子方法不仅可以检测 AGP 的存在，还可以确定其浓度和结构特征[ 52,53,54 ]。使用两种分子技术可以证明样品中 AGP 的存在和含量，即蛋白质印迹和 ELISA 测试 [ 55 ]（表3）。

表 3 基于抗体探针的分子技术在 AGPs 研究中的应用、优点和缺点
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组织制备—提取方案
一般来说，从植物组织中提取 AGP 很复杂，因为 AGP 的糖残基与其他细胞壁成分相连，这另外有助于细胞壁的稳定性和对化学、物理和生物因素的抵抗力。因此，提取过程必须足够积极，以获取 AGP，而不会对蛋白质部分造成不可逆的改变。与茎或叶等更坚硬的植物结构相比，果实组织含水量更高，并且在整个生理过程中改变其生化成分。这些因素使得提取过程更加复杂，AGPs提取时应考虑提取缓冲液的浓度。在提取过程之前，将水果组织切片并冷冻在 − 80 °C 下。为了从植物组织中提取蛋白质，42 , 56]。改良的 Laemmli 缓冲液由 65 mM Tris–HCl pH 6.8（三（羟甲基）氨基甲烷）、2% SDS（十二烷基硫酸钠）、2 mM EDTA（乙二胺四乙酸）、1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）、700 mM 组成β-巯基乙醇和1:10蛋白酶抑制剂。该提取缓冲液用于在提取过程中维持 AGP 的 pH 值、离子强度和稳定性。对于水分较少的水果组织，应使用 1:1 的比例（即每 1 g 组织使用 1 mL 提取缓冲液）。如果果实组织在成熟的最后阶段高度水合，则应修改该比例（即每 1 g 组织使用 0.5 mL 的提取缓冲液）。为了防止蛋白质降解，样品在提取过程中应保持在冰上，并使用预冷的设备快速提取。通常将匀浆在 95 °C 下煮沸 5 分钟，并通过在 4 °C 下以 14 000 rpm 离心 20 分钟进行澄清。提取过程的最后一步是收集上清液，其可供使用或/和可以冷冻在-80°C。

使用免疫印迹法表征 AGP 的分子质量
免疫印迹可以对水果组织中的 AGP 进行特异性检测和分子质量表征，从而展示其结构变异和功能多样性。蛋白质印迹是分子生物学中用于检测和表征特定抗原决定簇的分析技术[ 54,57,58 ]。该技术包括适当的样品制备、电泳分离（即 SDS-PAGE – 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）[ 7,59,60 ] ，将分离的蛋白质从凝胶转移到膜（硝化纤维、聚偏二氟乙烯 (PVDF)）[ 61 , 62]，与适当的抗体一起孵育并检测[ 63 ]。这些标记物的可视化可以通过比色法或化学发光法进行[ 53 , 57 ]。为了优化用于研究 AGP 的蛋白质印迹技术，应该对所用试剂的浓度进行一些改变 [ 64 ]。首先，水果组织的AGP表位分析需要抗体的最佳浓度，这是通过在生产商建议的浓度附近测试各种抗体稀释度来确定的。为了改善膜上 AGP 表位的成像，使用的抗体浓度低于通常用于免疫印迹植物样品（例如来自植物样品）的 1:10 稀释度甘蓝型油菜（专家型）和豌豆（Pisum sativum var. Normand）的根[ 63 ]。此外，为了改善成像并最大程度地减少高背景，由于需要更有效地封闭非特异性位点，因此应修改封闭缓冲液的浓度。此外，在 AGP 分离中，应在 4 °C 下进行湿膜转移，以尽量减少产生热量的不良影响，例如凝胶变形。该方法的示意图如图 4所示。

图4
图4
使用蛋白质印迹法测量 AGP 的方案。(1)液氮中植物材料的均质化。(2)提取步骤。(3)收集上清液。(4) 将样品和蛋白质前导序列应用到电泳凝胶上。(5)SDS-PAGE电泳分离。(6)三明治的制备。膜转移。(7) 用 BSA 进行膜封闭并用一抗孵育。(8)二抗膜孵育。(9)信号检测和频带测量。(10)用扫描机成像。使用 BioRender.com 创建

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程序
1.
要在蛋白质变性条件下构建聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE 凝胶），请准备分离凝胶：混合 6 mL 12.5% 分离凝胶（原液：混合 33.28 mL 丙烯酰胺、25.12 mL 蒸馏水、20 mL 1.5 M Tris） pH 8.8、800 µL SDS）、60 µL 10% APS（过硫酸铵钠）和 20 µL TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺），将其浇注在两个玻璃板之间，倒在3/4体积，等待聚合约30分钟。聚合后，加入 2 mL 异丙醇，使分离凝胶表面平坦。

2.
用薄纸边缘触摸去除酒精。准备浓缩胶：混合 3 mL 浓缩胶（库存：混合 5.44 mL 丙烯酰胺、21.76 mL 蒸馏水、4 mL 1 M Tris pH 6.8、320 µL SDS、溴酚蓝）、30 µL 10% APS 和 15 µL TEMED，将其浇注在两块玻璃板之间，插入塑料电泳梳以创建孔，然后等待聚合 30 分钟。

3.
制备样品：将3×SDS样品缓冲液添加至总蛋白量（根据Bradford的测量），混合样品，并将混合物加热至95℃5分钟。

4.
安装电泳仪并添加 1 × 电泳缓冲液（混合 14.4 g 甘氨酸、3 g Tris Base、1 g SDS 和 1 L 蒸馏水）。

5.
将适当的蛋白梯和样品加载到凝胶上（每孔约 20 µL）。

6.
打开电泳电源组，将其设置为低电压（80 V，20 分钟），随后增加至较高电压（120 V，1 小时）。当蛋白质前导序列迁移到适当的位置时，停止凝胶运行。

7.
转移前，将 PVDF 膜（硝基纤维素膜）在甲醇中清洗 1 分钟。

8.
将海绵和 Whatman 滤纸浸泡在 1 × 转移缓冲液中（将 14.41 g 甘氨酸、15.14 g Tris Base 和 4 mL 10% SDS 在 100 mL 蒸馏水中混合，并添加 200 mL 甲醇和 700 mL 蒸馏水） 。

9.
组装转移成分“三明治”，依次排列海绵、2-3 张湿滤纸、膜、凝胶、2-3 张湿滤纸，最后是第二块海绵，开始在转移盒面向上构建阳极（+）。

10.
打开电源组，将电压设置为低，然后使用湿转印技术（90 V，80 分钟）。

11.
在实验室摇床上用 TBST（Tris 缓冲盐水）清洗膜 15 分钟。

12.
添加封闭缓冲液（PBS 中的 5% BSA 溶液）并在实验室摇床上室温孵育 1 小时。

13.
除去封闭缓冲液，并在实验室摇床上用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 分钟。

14.
预孵育步骤后，添加在 PBS 中的 2.5% BSA 溶液中以 1:500 稀释的一抗，并在实验室摇床上室温孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜。

15.
除去溶液，在实验室摇床上用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 分钟。

16.
添加二抗以及以 1:1000 稀释在 PBS 中的 2.5% BSA 溶液中的 AP 特异性（碱性磷酸酶）酶缀合物，并将混合物在实验室摇床上室温孵育 2 小时。

17.
除去溶液，在实验室摇床上用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 分钟。

18.
用 AP 缓冲液清洗膜 10 分钟（混合 12.11 g Tris Base、5.84 g NaCl、1.01 g MgCl2 和 1 L 蒸馏水，pH 9.5）。

19.
将新制备的用于比色检测的底物溶液（20 mL AP 缓冲液、1 mL BCiP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐）和 1 mL NBT（硝基四唑蓝氯化物）添加到膜中。

20.
将膜在室温下在实验室摇床上黑暗中孵育，直至达到条带（平均时间为 15 分钟）。

21.
用蒸馏水洗膜两次，每次 10 分钟。

22.
使用带有无紫外线托盘的成像系统进行膜成像。

批判的
(1)
为了防止 AGP 降解，样品在制备和应用于凝胶期间应保持在冰上。

(2)
在黑暗中制备并储存 BCiP 和 NBT 试剂。

(3)
如果膜上发现背景过高，则需要缩短与一抗的孵育时间。

(4)
如果观察到“微笑”条带，则说明 SDS-PAGE 电泳过热或运行过快；在这种情况下，要么应降低电压，要么应在较冷的条件下进行电泳。

(5)
膜上出现的任何白点表明，在折叠“三明治”过程中，凝胶和膜之间可能留下了气泡；要解决此问题，请用转移缓冲液润湿塑料，然后用它将气泡从膜中滚出。

(6)
膜上出现的任何黑点表明抗体可能与封闭试剂结合；要解决此问题，请使用不同的封闭试剂并在检测前更精确地清洗膜。

(7)
AGP（与典型蛋白质相比）不会分离为单个条带，而是分离为弥散条带。这是糖基化异质性的结果。

使用酶联免疫吸附测定法对 AGP 进行选择性糖组分析 — ELISA 测试
ELISA 是科学研究中常用的免疫酶测试。其优点包括高灵敏度 [ 65 ] 和同时评估多个样本的能力，提供高度可重复的结果 [ 52 , 66 ]。ELISA 是根据形成的抗原抗体键的数量定性和定量测定特定表位的基本测试。通过将这些债券与标准进行比较，可以估计它们的数量 [ 67 , 68]。还可以使用 ELISA 定性和定量分析 AGP。然而，由于AGP的特殊结构，需要对协议进行修改。对于高度水合的水果组织，覆盖过程延长至 72 小时，而不是传统 ELISA 中的几个小时。此外，它在 37 °C 下运行，而对于大米和胡萝卜根则在 4 °C 下过夜包被 [ 33 ]。这些修改使得优化样品覆盖成为可能。此外，还对一抗浓度进行了优化，因为生产商使用的推荐浓度 1:10 给出了太强的背景信号 [ 25 , 34 ]。该方法的说明如图5所示 。

图5
图5
使用 ELISA 测量 AGP 的方案。(1) 涂层——样品固定。(2)用BSA封闭。(3)一抗孵育。(4)二抗孵育。(5)使用酶标仪进行信号检测。(6)样品中AGP浓度的测定和定量分析。使用 BioRender.com 创建

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程序
1.
准备一个 96 孔微孔板，并在每孔中添加特定的样品。

2.
在 37°C 下振荡 (350 rpm) 孵育 72 小时。

3.
在实验室摇床上用 100 μL PBS 清洗板 3 次，每次 5 分钟。

4.
每孔添加 200 μL 的封闭缓冲液（PBS 中的 0.1% BSA 溶液），并在 37°C 下摇动（350 rpm）孵育 1 小时。

5.
除去封闭缓冲液，并在实验室摇床上用 100 μL PBS 清洗板 3 次，每次 5 分钟。

6.
预孵育步骤后，每孔添加 100 μL 在 PBS 中按 1:20 稀释的一抗。

7.
盖上板并在 37°C 下摇动 (350 rpm) 孵育 1 小时。

8.
除去溶液，并在实验室摇床上用 100 μL PBS 清洗板 3 次，每次 5 分钟。

9.
每孔添加 100 μL 二抗以及 AP 特异性酶缀合物，在 PBS 中按 1:500 稀释。

10.
盖上板并在 37°C 下摇动 (350 rpm) 孵育 1 小时。

11.
除去溶液，并在实验室摇床上用 100 μL PBS 清洗板 3 次，每次 5 分钟。

12.
每孔添加 100 μL 新鲜制备的 PNPP（对硝基苯酚磷酸盐）底物溶液。

13.
将板在黑暗中在 RT 下孵育，直至达到所需的颜色强度（平均为 15 分钟）。

14.
添加 50 µL 2 M NaOH 以停止反应。

15.
测量 405 nm 处的吸光度。

批判的
(1)
使用前将 PNPP 平衡至室温并避光保存。

(2)
信号太强（板上没有分化）很可能表明抗体浓度错误或使用了太多底物，或者在步骤之间未正确冲洗板。

简而言之，表4总结了 AGP 免疫细胞化学分析所需的所有特定试剂、缓冲液和设备类型。此外，一抗和二抗的优化浓度被显示为所有描述方法的组成部分。

表4 免疫细胞化学技术所需的试剂和设备
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讨论
AGP 被归类为存在于细胞壁结构中的蛋白质家族 [ 72 , 73 , 15 , 69 ]。考虑到它们的异构结构，应该区分几种类型的 AGP [ 15 ]。根据组成、大小和不同结构域的存在，从拟南芥基因组中鉴定出的AGP分为四个不同的类别，如经典 AGP、富含赖氨酸的 AGP、AG 肽、嵌合成束蛋白样 AGP (FLA)、嵌合质体蓝素 (PAG)和其他嵌合 AGP [ 70 ]。尽管它们由 90% 的碳水化合物组成，但 AGP 绝对不同于其他细胞壁多糖，后者占细胞壁质量的 90-95% [ 71]]。细胞壁多糖包括果胶、纤维素、半纤维素和不同的糖蛋白[ 34 ]。纤维素微纤维与半纤维素如木葡聚糖、木聚糖和其他葡聚糖形成承载基质。在该基质中，纤维素骨架之间的空间充满非晶凝胶，主要由果胶成分组成，如最常见的同型半乳糖醛酸（HG）、鼠李糖半乳糖醛酸I型（RGI）、鼠李糖半乳糖醛酸II型（RGII）和木糖半乳糖醛酸（XG）[ 69，71]。本文列出的方法具有单克隆抗体的精致特异性，建立了细胞代谢过程中细胞壁结构修饰和细胞壁成分分布的一些方面和细节。细胞壁成分的结构、存在和数量差异很大，从细胞外基质中的可变定位、分布变化以及植物生理过程中观察到的显着结构变异开始。其他碳水化合物成分与 AGP 的另一个区别特征是它们的分子变化模式。就 AGP 可以被视为果实发育和成熟特定阶段的标志物而言，果胶更为持久，并且它们的变化不能与细胞中的各个过程联系起来。 ]。Posé 及其同事使用 ELISA 分析对未成熟和成熟阶段的番茄和草莓果实进行了主要果胶表位的糖分析，在成熟过程中表位数量的定义不同 [ 75 ]。上述信息得出这样的结论：AGP 虽然由碳水化合物部分组成，但表现出独特的特征，表明新的细胞壁属性。

考虑到 AGP 在所检查的植物器官中的含量和分布的变化，还应强调分子特征检查的必要性，以进一步了解糖基化过程的变化。与其他细胞壁成分的特征相比，AGP 的所有上述特性可以得出 AGP 可能参与植物分子机制的结论。众所周知，AGP 既作为信号分子游离存在于质外体中，又在细胞壁和质膜附近区域与细胞外基质严格连接。在文献中，AGP 作为信号分子在细胞间信号传导的分子相互作用中的作用与其 Ca 2+有关结合能力和推测参与细胞表面质外体钙的释放 [ 1 , 18 ]。AGP 的另一个重要功能是通过与其他细胞壁糖聚合物交联和分子间钙桥的形成来共同创建细胞壁组装 [ 20 , 76 ]。经典的 AGP 被认为与果胶和半纤维素形成复合物，通过与 AG 多糖中的 Rha 残基连接的 RG-I 和 HG 以及与 RG-I 中的 Rha 残基连接的阿拉伯木聚糖共价连接[20 ]。上述从拟南芥中分离的缀合物悬浮培养基的特点是大量的 RG-I – AGP 组分，其确实在 RG-I 和 AGP 之间共价连接，形成功能性壁结构 [ ]。76 ]。最新的报告证实了 AGP 通过与果胶结构域 RG-I 和同型半乳糖醛酸的物理相互作用，在创建细胞壁连续性方面的作用 [ 77 ]。最新结果表明，阳离子 AGP 结构域通过催化硼桥联和 RG-II 二聚化发挥陪伴作用。作者假设 RG-II 和特定的 AGP 参与指导细胞壁组装 [ 77

植物细胞壁聚糖的框架以及它们之间相互作用的维持也应该在水果中进行研究。使用上述方法获得的结果是兼容的，并且可以对水果中存在的 AGP 进行全面分析。目前，识别碳水化合物链的抗体是唯一对 AGP 具有最大特异性的市售工具[ 24,26,33,34 ] 。这些抗体用于识别表位，这些表位是水果发育和成熟过程特定阶段组织修饰的有用标记[ 13]]。尽管重点强调 AGP 参与植物生理过程，但大多数研究仅关注其结构特征而不是功能特征。迄今为止，AGP仅在少数几种水果中进行了研究，例如草莓- Fragaria x ananassa [ 78 ]、葡萄- Vitis vinifera [ 79 ]、番茄- Solanum lycopersicum [ 80 ]、橄榄- Olea europaea L. [ 81 ] 、苹果 — Malus Domestica [ 5 , 23 , 82 ] 和梨 — Pyrus communis [ 4 ]]。因此，本文的目的是收集优化的协议、故障排除以及从水果 AGP 实验工作中获得的经验。到目前为止，大多数关于水果中 AGP 的报道都是基于所提出的方案的使用，即分布的时空模式、组织特异性、水果组织中的浓度、聚糖结构的表征以及碳水化合物部分结构的差异。使用这些协议，可以确定 AGP 对水果生理过程的影响，例如采后储存期间的发育、成熟和衰老[ 12、14、83 ]]。通过 CLSM 和 TEM 成像进行的原位免疫细胞化学分析证实了成熟过程中 AGP 分布的改变，这是一种典型的时空模式。在该过程的开始，AGP表位主要存在于质膜中，它们沿着细胞壁边界积累。例如，JIM13 免疫标记显示细胞壁-质膜连续体中存在 β-GlcA-(1 → 3)-α-GalA-(1 → 2)-α-Rha 表位，而它们的组装在成熟细胞中。绿色和储存的果实组织受到干扰[ 5]。JIM13 免疫金标记证实了 AGP 在果实细胞壁中的特定排列。此外，使用 TEM 在亚细胞水平获得的结果表明其他细胞区室中也存在 AGP，强调碳水化合物链和蛋白质部分的合成发生在内质网中 [ 82 , 84 ]。

此外，原位和异位免疫细胞化学技术证明了 AGP 糖基化水平和 AGP 分子改变与细胞过程进展之间的相关性。AGP 的选择性糖组分析揭示了 AGP 的分子量和浓度随着成熟过程的进展而降低[ 85 ]。Moore 和他的同事在葡萄成熟过程中观察到了类似的变化[ 79 ]。AGP 表位（JIM8、JIM13 和 LM14）的数量在成熟过程中逐渐增加，随后 AGP 减少并释放到质外体中[ 79]]。我们对番茄果实作为成熟分析的模式生物的研究表明，破粒期的果实含有最高分子量的 AGP 和各种碳水化合物链，而低分子量 (~ 30 kDa) 的 AGP 主要出现在成熟期的果实中。红熟阶段。这些低分子 AGP 可能被视为番茄果实成熟过程结束的标志。此外，JIM13 抗体可检测分子量范围为 120-20 kDa 的最常见 AGP 表位，可用作确定植物组织中是否存在 AGP 的工具[ 85 ]。

另一方面，文献提供了有关频繁使用 Yariv 试剂分离 AGP 的信息，但迄今为止还没有明确描述它与哪个 AGP 结构部分结合 [ 86 , 87 ]。人们公认，一种称为 β-葡萄糖基 Yariv 试剂（1,3,5-三（对糖基氧基苯基偶氮）-2,4,6-三羟基苯，β-GlcY）的化合物经常用作细胞化学试剂进行检测AGP 的、定量和纯化以及 AGP 分子活性的修饰[ 80 , 87]。此外，之前的一项研究表明，Yariv 反应性不依赖于 AGP 的肽成分。β-GlcY 与长度超过 5 个残基的 β-1,3-半乳聚糖链结合。最有可能的是，这与使用一组特定糖苷水解酶对 AGP 的 AG 部分进行连续修剪有关 [ 88 ]。在我们之前对苹果果实的研究中，红色果实薄壁组织中 AGP 的浓度估计为 2 080 µg/g。与番茄果实中 AGP 的存在相比，浓度相似，表明果实组织是所检测蛋白多糖的丰富来源 [ 42]。例如，在成熟过程的转折阶段，AGP浓度测定为3 110 µg/g新鲜组织，这表明AGP的存在与AGP碳水化合物长链的持续合成相关[85 ]。为了进行比较，Kaur 及其同事进行的研究确定了拟南芥 ]。Lamport 进行的其他研究证实，每片烟叶鲜重中存在 30–300 µg AGPs [ 90在不同的器官中。AGP 的含量为鲜重莲座叶的 150 µg/g，茎的 450 µg/g，根的 610 µg/g，花的 1000 µg/g [ 89]。排除了阐明AGP在果实代谢中的作用的必要性，并考虑到其他植物器官中AGP的含量，对果实中AGP的研究更有助于获得研究材料。先前对水果中 AGP 的研究得出结论，水果组织是一种很好的研究材料，可用于分离 AGP 作为关键细胞壁成分以及结构和分子表征。

结论
原位和异位免疫细胞化学技术提供了精确确定发育和成熟过程中果实组织中发生的分子和结构修饰的机会。基于抗体的方法是研究 AGP 的主要工具。所有技术，即糖组分析、膜上的免疫印迹、ELISA 筛选和/或表位作图，都可以对 AGP 的碳水化合物部分进行表征。使用抗体来识别和可视化特定 AGP 表位的免疫细胞化学研究有其优点和缺点。免疫细胞化学的优点包括与定性和定量分析相关的高特异性。另一方面，免疫细胞化学的缺点是样品制备步骤与定量分析困难和结果解释具有很大的主观性相关。简而言之，使用抗体标记的显微方法是强大的工具，可以实现 AGP 的可视化和对组织结构的理解。免疫荧光和免疫金方法可以对 AGP 定位进行高特异性的精确成像，然后进行定性和定量分析。蛋白质印迹还具有高特异性，可以进行定量测量，但也需要几个步骤，包括凝胶电泳、将蛋白质转移到膜上以及用抗体进行检测，这些步骤可能非常耗时且费力。因此，同时值得进行额外的分析，例如 ELISA、这是一种具有高灵敏度和特异性的方法。ELISA 可以检测样品中低水平的测试分子，这对于水合水果组织来说极其重要。此外，ELISA 技术具有可扩展性，可同时检测多个样品并进行数量定量分析。