介绍
过去一个世纪，不负责任的废物处理造成了严重的环境问题。现在公众对解决这些问题的兴趣日益浓厚。环境中废物的绝对数量超过了自然自净过程的能力（Miller 和 Spoolman，引文2018）。因此，修复污染地区并将其恢复到原始状态至关重要。然而，许多现有方法会产生额外的废物，突出表明需要进行受控处置实践（Mirsal引文2004）。

世界上越来越多地用于修复污染环境（主要是土壤）的技术之一是生物修复（Parus 等，2017）。引文2023）。通过应用生物修复工艺，净化程度高达98%（Chunyan等，2017）。引文2023）。生物修复对于修复被石油（石油）和石油衍生物（Patowary、Devi 和 Mukherjee）污染的环境特别有效引文2023），但它也用于处理尚未到达环境的废物，并且越来越多地用于受有毒元素污染的环境（Preetha等，2023）。引文2023）。重要的是要认识到石油碳氢化合物的累积影响可能对子孙后代产生严重的健康后果，包括潜在的癌症、突变和发育异常的风险。（侯赛因等人。引文2022）。

利用非病原微生物进行生物修复是一种有效的方法。这些自然存在于污染场地的微生物可以将有机污染物转化为无害物质，确保人类和环境的安全。通过这个过程，有机污染物转化为二氧化碳和水，而有毒元素则转化为无毒形式（Narayanan、Samir Ali 和 El-Sheekh）引文2023）。

使用来自污染地点的微生物是生物修复的理想选择，尽管也可以使用来自其他环境的微生物。多种微生物菌株之间的协作行动，形成一个联合体，通常是有效分解污染物所必需的。微生物作为“生物制剂”在净化、保护和保存环境方面发挥着至关重要的作用（Chunyan等，2015）。引文2023）。

本研究的目的是探讨使用特定的微生物菌株和生物修复条件修复被石油及其衍生物污染的土壤的可能性。该研究对贝尔格莱德附近高度污染的土壤进行了为期六个月的异地生物修复实验。

材料和方法
研究区特点
接受检查的土壤样本来自塞尔维亚的多个地点，这些地点已受到石油产品废油的污染。受污染的土壤被运至塞尔维亚多巴诺夫奇，并在位于多巴诺夫奇的工厂（坐标：北纬44°48′52.42”，东经20°13′13.08”）进行异位生物修复。多巴诺夫奇 (Dobanovci) 是位于贝尔格莱德苏尔钦市内的一个郊区。塞尔维亚首都贝尔格莱德位于萨瓦河与多瑙河的交汇处，潘诺尼亚平原与巴尔干半岛交汇处（坐标：北纬 44°49′4.13”，东经 20°27′24.83”），如图所示图1。

燃油污染土壤异位生物修复生物堆的制备
生物修复生物堆是根据 Beškoski 等人的方法制备的。（引文2011）进行了一些修改。生物修复生物桩建在防水沥青表面，尺寸为 1000 m 3和 1250 m 2，重约 15,000 吨（如图所示）图2(A)）。生物堆由被废油污染的土壤混合物组成，其中包括过期的油或之前在发动机中使用但随后被丢弃的油。因此，生物堆中含有石油碳氢化合物。为了提高孔隙率，生物堆中加入了 300 m 3河沙。

为了均匀起见，使用推土机将生物堆充分混合，然后使用拖拉机平整。生物堆的最终尺寸为 75 × 20 × 0.5–0.8 m（长 × 宽 × 高）。采用生物刺激来实现C:N:P:K（100:10:1:0.1）的最佳营养比。这涉及到在整个生物堆中均匀喷洒溶解的硝酸铵、磷酸铵和氯化钾（如图所示）图2(B)）。生物堆由1000 m 3的生物修复基质组成。

在为期 6 个月的整个生物修复过程中，生物堆每 15 天定期进行浸泡、旋转和混合，以保持必要的水分和通气水平。此外，每 30 天用精心准备的微生物群（假单胞菌属、芽孢杆菌属、红球菌属、短杆菌属）对生物堆进行接种。有关分离、鉴定和培养过程的详细信息可以在我们之前的作品中找到（Gojgic-Cvijovic 等，2017）。引文2012）。

混合后，生物堆用塑料聚乙烯箔覆盖，以避免天气条件的直接影响。BioSolve CLEAR（BioSolve TM公司，美国）也以每立方米70毫升原液的体积添加到支架中（其作用是使“非极性”污染物分子可供微生物利用）。生物修复的化学和微生物指标在生物堆准备好后和持续6个月的生物修复程序结束时立即进行监测。在实验开始时（添加微生物之前），分离出10 m 3生物堆的对照样品，并对其进行化学和微生物学分析。

土壤取样
使用土壤螺旋钻（Eijkelkamp，荷兰）对土壤样品进行取样，深度为 0-70 厘米。在生物修复/对照生物堆之前/之后从生物堆上的多个位置进行采样，然后将来自同一生物堆的样品混合并均质化（Beškoski 等，2017）。引文2011）。将如此获得的各个复合样品用于分析。所有样品在送到实验室后立即进行微生物分析，并在 12-24 小时内进行化学和物理化学分析（Paetz 和 Wilke，引文2005）。

分析方法
吸湿水分百分率的测定
水分百分比在湿度计（型号 MOC-120H；Shimadzu Co.，Japan）中测定，样品干燥程序为 105 °C，1.5 小时（ISO 11465引文1993）。

电位法测定pH值
根据标准方法（ISO 10390），在磁力搅拌器上搅拌 30 分钟后，在由匀浆样品和煮沸的软化水以 1:2.5 的比例制备的悬浮液中测量固体样品的 pH 值。引文2005）。测量是在带有来自同一制造商的组合电极的数字 pH 计（pH 300 型；WTW，Weilhem，德国）上进行的。

灰分含量的测定
灰分含量是在瓷坩埚中通过使用燃烧器燃烧样品的有机物质直至停止产生白色蒸气，然后在550°C和800°C的烘箱中加热2小时来测定的。在 550 °C 下测定灰分是为了确定有机物质的损失，而在 800 °C 下测定灰分则显示碳酸盐的损失（通过从 100% 中减去灰分含量 (%)）。

无机碳含量的测定
样品的无机碳含量通过标准容量法（ISO 10693引文1995）。

元素分析
通过自动分析仪(Vario EL III，CHNS-O，Elemental，德国)测定干燥粉末物质中的碳、氢、氮和硫的总含量。无机碳含量根据CO 2含量计算，而有机碳含量根据总碳含量和无机碳含量之差计算（Wilke、Margesin 和 Schinner）引文2005）。

总石油烃的重量测定
根据 ISO 16703 (ISO EN 16703引文2018）并根据 DIN EN 14354 (DIN EN 14345-12引文2004）和 Beškoski 等人。（贝斯科斯基等人。引文2011）。简而言之，用正庚烷和丙酮（2:1）的混合物萃取烃类，然后在分液漏斗中洗涤。丢弃含水部分以及溶解在丙酮中的所有物质。正庚烷级分通过预先加有弗罗里硅土和无水硫酸钠的柱（实际上充当特定的过滤器）来进一步纯化。硫酸钠去除了多余的水，弗罗里硅土保留了土壤色素。将庚烷层收集在称重瓶中，将物质在氮气流中干燥，然后测量质量。

气相色谱法测定石油烃
总石油烃 (TPH) 根据 ISO 16703 测定（ISO EN 16703引文2018）。本标准适用于C 10 -C 40烃类的测定，不适用于< C 10烃类的定量测定。气相色谱分析在配备氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪 – Agilent 7890 A（美国）上进行。使用薄膜色谱柱HP-5(长30m，直径0.32mm，固定相厚度0.25μm)。载气为氢气，速度为30cm/s。色谱条件为：起始温度60℃，进样器温度250℃，检测器温度300℃；温度以 4 °C/min 的速度升高。对于数据处理 ChemStation，使用了 Agilent Technologies 软件

正己烷可萃取物的测定
正己烷可萃取物质（HES）通过改良的 EPA 方法测定（美国 EPA引文1998）。简言之，接下来用正己烷萃取可溶于己烷的物质，将萃取物在蒸发器上蒸发，然后(用正己烷温和冲洗)通过预先加入弗洛里硅和无水硫酸钠的柱。测量正己烷级分的质量。

生物学参数
在所有微生物学程序中，都遵循微生物化学的工作规则，并使用分析纯度的物质来制备微生物介质。所有微生物培养基均通过将组分悬浮和/或溶解在蒸馏水中并高压灭菌至 0.10 MPa 20 分钟来制备。在所有介质中，通过添加H 2 SO 4或NaOH (1 M)来调节pH。

在营养琼脂上测定血液有机异养嗜温需氧和兼性厌氧细菌（TB）总数。根据制造商的说明通过溶解干培养基来制备营养琼脂。通过在厌氧条件下接种，在含有 0.5% 葡萄糖的营养琼脂上测定厌氧中温血液有机异养细菌 (AN) 总数。在麦芽琼脂上测定酵母和霉菌孢子（YM）的总数，麦芽琼脂是根据制造商的说明通过溶解干培养基制备的。碳氢化合物降解微生物 (HD) 在以柴油 D2 (UG) 作为唯一碳源的矿物碳氢化合物培养基上测定 (Milcic-Terzic 等人，2016)。引文2000）。

微生物数量通过连续稀释法测定（Qayyum 等人，2013）。引文2020）。48小时后，对血有机异养嗜温需氧和兼性厌氧细菌（TB）以及厌氧嗜温血有机异养细菌（AN）的总生长菌落进行计数。72 小时后对酵母和霉菌孢子 (YM) 进行计数，而分解碳氢化合物的微生物菌落 (HD) 在 7-8 天后进行计数。将接种的琼脂平板在 28°C 下孵育。

统计分析
数据表示为两次重复的平均值和标准差。 计算不同参数之间的Pearson 相关系数 ( p < .05) 以评估这些参数之间的关系。采用p < .05的单向方差分析 (ANOVA)  ，然后进行 Tukey 检验来评估生物修复的有效性。应用 Statistica 软件 8.0 版（StatSoft Co.，Tulsa，Oklahoma，USA）进行统计分析。

结果与讨论
生物修复过程前后土壤的化学分析
测试样品含水量为 28.8–30.3%（表格1）。文献数据表明，水分对受污染土壤的生化过程有很大影响（Myazin 等，2017）。引文2021）。生物修复过程中生物堆的含水量处于该技术的最佳限度内（Gupta 等人，2017）。引文2021）。

550℃焚烧后样品的灰分含量范围为65.2％至96.3％，而800℃焚烧后的灰分含量范围为63.5％至95.8％（表格1）。观察到焚烧后有机物和碳酸盐的损失。生物修复前的样品和对照样品在 550 °C 和 800 °C 下焚烧后，有机物和碳酸盐分别损失了约 34% 和 36%（表2）。相比之下，生物修复后的土壤样品在各自的温度下焚烧后，有机物质的损失量为 3.66%，碳酸盐的损失量为 4.21%（表2）。

在两种焚烧温度下，生物修复前的样品和对照样品之间的灰分含量没有显着差异（表格1）。样品中灰分含量增加了约 30%，这与经过生物修复的土壤在 550 °C 和 800 °C 下焚烧后有机物和碳酸盐分别显着减少有关。

在相应温度下焚烧后，有机物质（∼30%）和碳酸盐（∼30%）的显着损失表明生物修复过程的高成功率，凸显了微生物在去除有机污染物方面的高效活性。生物修复土壤中的有机质含量比对照样品低约 30%。然而，生物修复前样品中的灰分含量与对照样品相似，没有统计学差异。

根据焚烧温度的不同，未经生物修复的土壤样品和对照样品之间的灰分含量存在统计差异。灰分含量反映了有机和无机碳的燃烧，这是与其他含量测量一起评估生物修复成功的重要参数。相关分析表明，两种焚烧温度下的灰分含量之间存在很强的相关性，表明有机碳和无机碳损失的趋势一致。灰分含量还与样品中的水分含量呈强烈的负相关，表明较高的水分含量对应于较低的灰分含量。

样品的pH值范围为7.0至7.5（表格1）。土壤 pH 值通过影响微生物活性、酶功能和微生物群落多样性，在生物降解中发挥着至关重要的作用（Myazin 等，2017）。引文2021）。生物修复前土壤样品的pH值与对照样品相似，没有表现出显着差异。生物修复后，土壤碱度略有增加，这可能是由于微生物活性和某些阳离子物质（如钾、钙、镁等）的缓冲作用（Myazin等，2015）。引文2021）。然而，所有样品都保持了最适合微生物生长 (pH = 6–8) 和石油降解 (pH = 6.5–8) 的 pH 范围（Myazin 等，2017）。引文2021）。

统计分析显示土壤 pH 值与灰分含量 ( r  = 0.87) 以及水分含量 ( r = -0.87) 之间存在很强的相关性，尽管这些关系在p值为 0.05 时并未达到统计显着性(表3）。

生物修复前样品和对照样品中的正己烷可提取物（HES）含量约为 23-24%（表2）。经过生物修复后，土壤样品中HES含量下降至2%左右。HES 级分代表用正己烷溶剂洗脱的烷烃。与生物修复前土壤中最初的HES含量（24.0 g/kg）相比，被认为是100%，生物修复后土壤中的HES含量下降了90.3%。相比之下，与生物修复前的土壤样品相比，对照样品中的 HES 含量仅下降了 2.4%。这些发现与 Li 等人报道的结果一致。（李等人。引文2023）可以假设接种培养基中酵母的存在有助于成功去除 HES。也就是说，这些作者在用酵母进行生物刺激-生物强化后，在石油污染的土壤中实现了 71.5-100% 的正烷烃去除效果。HES 和 TPH 的含量有很强的相关性（ r  = 1.00；表3）。

生物修复前土壤样品和对照样品中的初始TPH含量约为22%（表2）。经过生物修复后，TPH含量下降至1.62%。生物修复过程使 TPH 含量显着降低了 92.9%，而对照样品仅降低了 3.02%。这些结果证明了所应用的微生物在生物修复中的有效性能。生物修复后土壤中 TPH 含量大幅下降与文献报道的结果一致。（隆登-阿法纳多等人。引文2023）。

GC 分析检测土壤中的石油碳氢化合物图3和4。气相色谱图显示生物修复前后碳原子范围为 14-40 的 TPH 峰。C14–C28 范围内的峰表示低分子量烃，而 C28–C40 范围内的峰表示高分子量烃。生物修复后，GC 色谱图上的轻 TPH 峰和重 TPH 峰的大小均显着减小（图5）。最初，土壤样品含有大量具有 17 和 18 个碳原子的碳氢化合物，特别是降植烷 (C17) 和植烷 (C18；图3）。然而，经过生物修复后，这些石油烃的含量大幅降低（图4）。这些结果表明，生物修复过程非常成功，具有良好的潜力，其特点是与总细菌种群相比，有大量细菌能够有效降解碳氢化合物。这些微生物利用碳氢化合物作为其生长的能源。（阿德通吉等人。引文2021）。

样品和对照的初始总碳含量约为 17%（表4）。然而，经过生物修复后，它显着下降至3.66%（表4）。所有样品的无机碳含量始终低于 1%（表4），而有机碳含量则由总碳与无机碳之差确定。生物修复后的土壤样品有机碳含量也低于1%（表4）。在生物修复之前，样品和对照的有机碳含量约为 17%（表4）。统计和元素分析发现生物修复前的土壤与对照土壤之间的总碳含量没有显着差异。然而，生物修复后，总碳含量与初始条件相比下降了 92.5%，与对照相比下降了 92.6%（表4）。有机碳含量也出现了类似的趋势，生物修复后土壤中的有机碳含量比初始状态下降了 96.88%，与对照相比下降了 96.85%（表4）。生物修复前后以及与对照相比，无机碳含量没有显着差异（表4）。 相关分析表明总碳含量、有机碳含量和无机碳含量之间存在很强的相关性（r = 1.00）（表3）。

生物修复过程中总氮和总硫含量没有显着变化。最初的土壤污染很明显，总氮含量很高，超过了土壤的平均含量。样品中总碳氮比存在显着差异。生物修复前的土壤与对照样品的比例较高，而生物修复后的土壤则表现出较低的比例（表4）。被有机污染物污染的土壤通常表现出较高的碳氮比。生物修复没有显着影响总氮含量。在总氮和总/有机/无机碳含量以及总氢之间观察到很强的相关性（表3）。生物修复前后的总硫含量实际上保持不变，表明所应用的联合体中不存在硫酸盐还原微生物。此类微生物通常用于减少采矿尾矿中的酸性废物（Ayangbenro、Olanrewaju 和 Babalola）引文2018）。

生物修复前样品和对照样品中的氢含量约为3%（表4）。然而，经过生物修复后，氢含量降至1%以下（表4）。与生物修复后的样品相比，生物修复前的土壤样品和对照样品之间的氢含量存在显着差异。这些样品之间的硫含量没有观察到统计差异（表4）。 相关分析显示，氢含量与元素有机分析中除硫含量外的所有检查参数之间存在很强的正相关关系（r = 1.00）。在土壤元素有机分析中发现硫含量与所有参数之间存在很强的负相关性（r  = -1.00；表3）。这些相关性是预期的，因为氢在微生物活动和全球元素循环中起着至关重要的作用。氢作为减少污染物的电子供体，影响微生物群落的结构和功能（Teng 等人，2017）。引文2019）。可能正是由于这个原因，生物修复后测试样品中的总氢含量显着下降（96.2%）。

对受检土壤的细菌计数进行分析
生物修复前土壤中有机异养需氧和兼性厌氧细菌总数为2×10 9 cfu /g，生物修复后为4×10 8 cfu/g。在对照样品中，这些微生物的存在量为 7 × 10 7 cfu/g（表5）。生物修复前土壤中酵母、孢子和霉菌的存在量为2×10 6 cfu/g，生物修复后为3×10 4 cfu/g。在对照样品中，这些微生物的存在量为 9 × 10 5 cfu/g（表5）。生物修复前土壤中降解碳氢化合物的细菌数量为7×10 7 cfu/g，生物修复后为2×10 6 cfu/g。在对照样品中，这些微生物的存在量为 2 × 10 5 cfu/g（表5）。生物修复前土壤中厌氧菌含量为4×10 3 cfu/g，生物修复后土壤中厌氧菌含量为9×10 3 cfu/g。在对照样品中，这些微生物的存在量为 1 × 10 5 cfu/g（表5）。

土壤样品中的大量微生物表明有氧和厌氧过程活跃。生物修复前后，血液有机异养需氧和兼性厌氧细菌总数始终保持较高水平（表5）。同样，生物修复前后的土壤样品中存在大量碳氢化合物降解细菌，而对照样品中的数量略低。

微生物的数量可以根据生物修复条件和持续时间而变化。添加剂和生物刺激程序的使用也会影响微生物种群。（卡赫拉曼等人。引文2017）。已发现添加营养物质可增加微生物数量。此外，维持高密度的细菌对于有效的生物修复至关重要（Balseiro-Romero 等人，2017）。引文2019）。

HD/TB 比率对于评估生物修复潜力至关重要，表明污染物分解的能力（Gojgić-Cvijović 等，2017）。引文2006）。用于生物修复的土壤在其初始状态下表现出很高的生物修复潜力，导致在此过程中发生显着的碳氢化合物分解。相反，未添加微生物的对照样品表现出最低的生物修复潜力（表5）。

结论
分析方法证实，生物修复有效减少了土壤中的有机质、总碳和有机碳含量。正己烷可提取物质和总石油烃的存在减少了约 90%，表明所应用的微生物的效率。最初的土壤样品中含有大量碳氢化合物，但经过生物修复后碳氢化合物含量有所减少。微生物的丰度表明土壤中有活跃的需氧和厌氧过程。这些结果证明了生物修复在清洁石油污染土壤中的成功应用。考虑到保持土壤质量的挑战以及无法自然清除的大量环境废物，土壤保护对于子孙后代至关重要。

所有作者都对研究构思和设计做出了贡献，所有作者都对原稿的先前版本发表了评论，所有作者都阅读并批准了最终原稿。