介绍
生命的多样性定义了生物世界。即使是同卵双胞胎也不尽相同。生物体在一种或多种性状上存在差异，这被称为导致遗传多样性的变异性。它可以通过特定基因库的基因计数来评估（Ahmad 等人，2022）。一般来说，遗传变异是正常细胞过程或不同生物体与环境相互作用的结果（Chauhan & Rajiv，2010）。虽然环境条件和人口密度的变化会导致相当大的变异，但遗传漂变、迁移、选择和人类干扰的影响更为显着（乔汉和拉吉夫，2010）。这些因素持续作用，导致群体等位基因频率以及遗传多样性发生变化。在驯化或人工选择中，一些等位基因的频率比其他等位基因更受青睐，从而增加了选定的等位基因（Yilmaz & Boydak，2006）。小规模种群的遗传多样性较低，也容易发生遗传漂变，从而随机减少遗传变异( Lu et al., 2014 )。

最近，水产养殖领域更加关注线粒体 DNA (mtDNA) 分析，以评估种群或物种之间的深度差异。这是可以理解的，因为它有很多好处，包括易于收集和遗传给后代。此外，由于分歧序列的积累，它没有重组，并且碱基取代率很高，这在水产养殖中对于识别种群或物种之间的深刻分歧变得越来越重要（Mandal et al., 2012））。许多研究人员报告说，利用特定线粒体片段（包含被识别为细胞色素氧化酶 I (COI) 的 600 个碱基对）的 DNA 条形码是一种快速、有效且廉价的方法，用于测量物种或种群之间的遗传多样性和亲缘关系（Hebert 等） .，2004 年；卡姆兰等人，2020 年）。然而，由于其唯一的母系遗传，许多研究人员对完全依赖线粒体DNA的研究表示保留( Zhang & Hewitt, 2003 )。

微卫星具有高度多态性、双亲遗传性，并且遍布于基因组的常染色质区域。它们具有高变异性、提高的基因组覆盖度、高再现性、自动化准备、中立性和缺乏环境波动等特征（Figueras et al., 2016）。在水产养殖遗传学中，它们广泛用于种群内和种群间比较、不同品系的鉴定以及个体之间的遗传变异（Wattanadilokchatkun 等人，2022）。然而，由于祖先信息的不确定性，不能用来推断家谱关系模式（张和休伊特，2003）。因此，使用这两种类型的标记可以帮助我们了解物种或种群之间的遗传多样性和相关性（Gariboldi et al., 2016）。

遗传多样性在提供自然选择所需的基础材料和促进生物体适应新的、具有挑战性的环境方面发挥着至关重要的作用（Gandra 等，2021）。在过去的20年里，有报告显示，由于各种因素，如补充量减少、滥用捕捞、过度捕捞、栖息地破坏、洄游路线堵塞和人为干扰等，野生鱼类的遗传多样性有所下降（Islam & Alam, 2004；Lu等，2014）。此外，许多研究人员报告说，近亲繁殖、种群规模小、遗传漂变和圈养中的基因流动受限，随后导致孵化场饲养的鱼类遗传变异减少（Shah，2004）。

为了水产养殖物种的可持续性和野生种群的保护，有关种群遗传结构的知识是先决条件（Sultana et al., 2015）。然而，有关巴基斯坦本土主要鲤鱼（包括Labeo rohita）遗传种群结构的信息/文献很少。罗希塔可以在巴基斯坦、印度、孟加拉国和缅甸的河流中找到（Dahanukar，2010；Froese 等人，2013）。它在世界范围内，特别是在亚洲，具有很高的水产养殖和商业重要性，并且在印度主要鲤鱼中占有最高的地位，因为它是一种美味的鱼，因而具有很高的市场价值（Rahman et al., 2005） 。然而，在过去的二十年中，来自孟加拉国、印度和巴基斯坦的许多研究人员报告称，野生和圈养的L. rohita种群的遗传多样性有所下降（Ahammad 等人，2022 年；Khan，2008 年；Qadeer 和 Abbas，2017 年））。因此，本研究旨在利用微卫星标记和线粒体标记（CO1）来评估本地可养殖物种L. rohita的野生和圈养种群的遗传变异。选择巴基斯坦各地的六个鱼类孵化场进行圈养品种，并选择两条河流（即喀布尔河和拉维河）进行野生品种的鱼类孵化场来评估其种群的遗传结构。

材料和方法
研究群体和菌株
在当前的研究中，从全国各地的孵化场和河流收集了六种不同品系的圈养南亚野鲮和两种野生南亚野鲮（ L. rohita ）。菌株的收集是在巴基斯坦八个地点的各个合作者的积极合作下进行的，而当地渔民则协助从拉维河和喀布尔河收集野生种群。图 1中给出了菌株和研究区域，为了方便起见，还在下面的缩写形式中提到了位置。

从所有地点，每个群体/品系收集了 20 条鱼，并去除了它们的尾鳍部分，用 75% 酒精清洗，并在 4°C 温度下储存在 90% 乙醇中，以便将来提取 DNA（Lutz 等人） .，2023）。

DNA的提取
Kumar 等人报道了一种改进的盐提取方法。(2007)用于从每个样本的尾鳍中分离 DNA。简而言之，将翅片切成小块并在滤纸上干燥。然后，将 20 mg 浸渍的鱼翅放入含有 1.5 mL 裂解缓冲液（200 mM Tris-HCl (pH 8.0)；250 mM NaCl、100 mM EDTA、60 µL 20% SDS、10 µL 蛋白酶 K（ 20 mg/mL)。将内容物充分混合，在48°C水浴中孵育3小时。然后，将800 µL苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1比例)添加到裂解的内容物中，手动摇动试管 5 分钟。然后将混合物以 10,000 rpm 离心 10 分钟，将上清液收集到含有 800 µL 氯仿-异戊醇（24:1 比例）的试管中。将混合物手动充分混合并再次离心，并将上清液收集在新管中。然后，使用乙酸钠（NaAc，pH 4.8）和异丙醇沉淀 DNA，并将其溶解在 35 µL 超纯水中。使用 NanoDrop（ND-1000 分光光度计，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA）评估获得的 DNA 的数量和质量。使用乙酸钠（NaAc，pH 4.8）和异丙醇沉淀 DNA，并将其溶解在 35 µL 超纯水中。使用 NanoDrop（ND-1000 分光光度计，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA）评估获得的 DNA 的数量和质量。使用乙酸钠（NaAc，pH 4.8）和异丙醇沉淀 DNA，并将其溶解在 35 µL 超纯水中。使用 NanoDrop（ND-1000 分光光度计，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA）评估获得的 DNA 的数量和质量。

DNA 扩增和 PCR 条件
Patel 等人使用的三种异源微卫星引物。(2010)用于Labeo bata和其他一些鲤鱼中 34 个南亚野鲮微卫星位点的跨物种扩增，以及Ward 等人设计和使用的 CO1 基因引物。(2005)选择了207 种鱼类的鉴定和不同养殖L. rohita种群的评估( Kamran et al., 2023 ) (表 1）。引物由 Macrogen（Macrogen，首尔，韩国）合成。30 µL 混合物，含有 14 µL Thermo Scientific PCR 主混合物（0.05 U/µL Taq DNA 聚合酶、反应缓冲液、4 mM MgCl 2、每种 dNTP 0.4 mM）、11 µL PCR 水、每种引物 1 µL（正向和引物）反向）（0.2 µM，1 µL 体积）（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）和 3 µL DNA 用于梯度热循环仪 PCR（BIO-RAD T100 TM热循环仪，Hercules，CA，美国）。COI PCR 使用的条件如下：1) 94°C 初始变性 1 分钟，2) 94°C 变性 60 秒，3) 54°C 退火 45 秒，iv) 72 ℃延伸°C 60 秒，72°C 7 分钟成功。变性、退火和延伸步骤有 35 个循环。此外，为了扩增微卫星引物，PCR 条件为：i) 5 分钟初始变性，ii) 95°C 变性 1 分钟，iii) Lr-28、Lr-29 和 Lr-58°C 退火37 60°C 45 秒，iv) 在 72°C 下伸长 1 分钟，然后在 72°C 下最终伸长 10 分钟。在此PCR过程中，总共进行了30个循环。最后，最终产品保存在4°C。

凝胶电泳
为了分析扩增产物，通过溶解 1.5 g 琼脂糖粉末、20 mL 5X TBE 缓冲液（45 mM Tris-硼酸盐、1 mM EDTA）制备 1.5% 琼脂糖凝胶（100 mL）溶液，并在一定温度下添加溴化乙锭。浓度为 0.5 µg/mL 时，DNA 条带可视化。随后，通过在每个梳子的一个孔中加载 DNA 梯子进行凝胶电泳，同时将含有 1 µL 溴酚蓝染料的样品加载到其余孔中。电泳后，一些质量优良的条带被送往Macrogen（Macrogen，首尔，韩国）进行测序。

微卫星数据分析
对微卫星基因座上表示为条带的等位基因进行手动评分，并按照Nash (1991)遵循的程序使用 DNA 片段程序（版本 3.03）计算条带大小。通过专门基因座的基因型评分来确定该基因座上的各种特定大小的等位基因。

生物信息学分析
序列通过 BioEdit 软件（版本 7.2.5）（Thompson 等人，1997）进行比对，随后利用 BLAST 算法在 NCBI 平台上进行鉴定。

分子方差分析 (AMOVA)
使用 DnaSP5.exe 进行 AMOVA 来检查菌株的空间结构。对于微卫星和线粒体标记，计算了群体成对 FST 统计数据。确定显着性水平（p < 0.05）。

统计分析
为了制作研究地点的地图，使用了 ArcGIS 10.8 版。GENEPOP 4.0 版（Rousset，2008）用于计算多个因素，包括等位基因/基因座 (NA)、Ho 和 He 的频率和数量，以及与 Hardy-Weinberg 平衡 (HWE) 的一致性。使用 FSTAT 版本 2.9.3.2 计算群体和其他位点内 FIS 的等位基因丰富度 (Ar) 和显着性（Goudet，1995）），而群体之间和群体内部的差异（称为 FIS）是使用 Genetix 4.05 版软件计算的。此外，通过使用R编程语言（版本：3.6.1）构建UPGMA树状图（ Nei，1972 ）来确定菌株之间的遗传相关性和变异。

结果
微卫星标记的遗传变异
PCR法有效扩增Lr-28、Lr-29、Lr-37引物，三个微卫星位点均被鉴定为多态性，PIC值均超过0.5（PIC>0.5）。Lr-28 位点的 PIC 值为 0.79，而 Lr-37 位点的 PIC 值为 0.59。三个位点总共识别出12个等位基因，其中Lr-28位点有5个等位基因，Lr-29位点有3个等位基因，Lr-37位点有4个等位基因。等位基因的数量从3到5个不等，每个位点平均有4.0个等位基因。总体选择的基因座（表 2）、等位基因大小和频率因样本而异。

菌株之间的遗传多样性和 Hardy-Weinberg 平衡
不同菌株之间观察到的遗传变异见表2。所有菌株的 Ho 范围为 0.671 至 0.791，其中 TM 的 Ho 最高，TK 的 Ho 最低。同样，He 范围为 0.758 至 0.860，WK 的 He 最高，其次是 TM 和 TK 的 He 最低。根据所有位点的总体平均值，与其他菌株相比，TM 显示出最高的遗传变异性，而 TK 显示出最低的遗传变异性。FIS 值范围为 0.103 至 0.325，其中 TM 的平均 FIS 值最低，其次是 WR 和 WK，而 TK 的平均 FIS 值最高。此外，24 项测试中有 12 项显示与 HWE 存在显着偏差。表2）。CM、TK、SP 和 US 在各两个基因座上显示出偏差，TM、MK 和 WK 在一个基因座上显示出偏差，而 WR 在任何位点上均未显示出与 HWE 的偏差。

遗传分化和品系间遗传结构
本研究对各菌株进行了两两比较（表3）并发现它们的遗传分化存在显着差异。FST值表明所有菌株均表现出分化。所有菌株的FST值平均范围为0.002至0.059，表明种群结构处于中等到低水平。研究表明，WK 和 WR 之间的基因流最高，CM 和 MK 之间的基因流最低。CM 和 MK 之间的最高 FST 值表明两个菌株不共享等位基因并且显着不同 (FST = 0.059)，而 TM 和 MK 之间的最低 FST 值表明两个菌株之间的基因流最大 (FST = 0.002)。相似地，

微卫星和线粒体标记 (CO1) 基因的分子方差分析 (AMOVA)
表 4中的分子方差分析揭示了使用微卫星 (FST = 0.03524, p = 0.000) 和 COI 基因 (FST = 0.04464, p = 0.000)的菌株之间存在较小的遗传差异。然而，观察到的群体遗传变异（微卫星标记，68.98％，COI基因，59.36％是在菌株内的个体水平）。

通过 UPGMA 树状图建立相关性
UPGMA 树状图如图2所示，基于Nei 遗传距离 (1972)，证明了所有菌株之间的遗传相关性。两个主要簇的形成如图2A和2B所示基于微卫星和线粒体DNA标记。一簇包含三个菌株，而另一簇包含五个菌株。每个簇又进一步划分为子簇。在第一个子簇中，仅存在 USs 菌株，而 TMs 和 MKs 则存在于另一个子簇中。第二个子簇进一步分为两个簇。一个簇有两个菌株，WR 和 WK，而另外三个菌株，CM、TK 和 SP，则位于另一个簇中。

讨论
建立有效的保护方法、提高对种群动态的了解以及对任何物种实施遗传改良计划和遗传多样性评估是至关重要的第一步。近年来，微卫星标记和线粒体DNA已被频繁用于此目的（Costa-Urrutia et al., 2012）。在当前的研究中，三个微卫星标记和一个线粒体DNA标记提供了有关分别从喀布尔河和拉维河捕获的两个野生（WK和WR）种群以及6个圈养繁殖（TM、TK、CM、MK、 SPs 和 USs）本地可养殖物种L. rohita种群从巴基斯坦各地的不同鱼类孵化场收集。

检测多态性对于选择分子标记至关重要。遗传标记在遗传多样性分析中的信息量和有用性通常使用 PIC 值来衡量（Serrote 等，2020）。本研究中所选的微卫星标记被发现具有多态性，在三个位点上有12个等位基因，PIC值超过0.5（0.59-0.79）（表2）。遗传评估研究通常更喜欢每个位点具有 3-4 个等位基因且 PIC 值大于 5 的微卫星（Lie et al., 2010）。这些结果表明本研究中使用的微卫星标记对于评估L. rohita菌株的遗传多样性有意义。先前的研究已使用Lr家族标记与其他标记结合来检查野生和养殖的L. rohita种群的种群结构和遗传多样性，并发现了类似的遗传变异模式（Alam等人，2009年；Hussain等人，2009年）。 ，2021）。

在保护和遗传改良计划中，维持种群的遗传变异是最重要的。遗传多样性使种群能够应对未来的环境挑战，并对长期选择做出反应，无论是自然选择还是人工选择，以获得理想的性状（Sharma 等，2016）。然而，由于管理不善、鱼种生产者缺乏技术知识和遗传意识，圈养种群遗传多样性丧失是巴基斯坦的主要问题（Riaz 等，2023））。尽管野生种群的遗传变异性构成了选择性育种计划选择种群的中心，然而，大多数鱼类的天然种群由于人为干预而受到威胁（Islam & Alam，2004）。一般来说，遗传退化导致鱼类数量减少，从而影响水产养殖业的可持续性。因此，必须解决遗传问题，对种群进行遗传表征，并为启动选择性育种计划和供应优质鱼苗提供基线数据。

测量群体遗传变异的最有效方法是每个基因座的 Ho，它不仅在基因座水平上而且在物种和群体水平上都具有非随机变异（Allendorf & Utter，1979））。所有菌株的 Ho 平均值范围为 0.671 至 0.791，TM 的 Ho 值最高，TK 的 Ho 值最低。同样，He 的平均值范围为 0.758 至 0.860，WK 的 He 值最高，其次是 TM，而 TK 的 He 值最低。这里，从拉维河和喀布尔河收集的野生种群的 Ho 和 He 值分别为 0.755–0.766 和 0.829–0.860，高于Nabeela 等人报道的 Ho = 0.655–0.705、He = 0.702–0.725。(2014) L. rohita野生种群采集自孟加拉国三大河流（哈尔达河、贾穆纳河和帕德马河），表明杂合度较高。 尽管如此，Hussain 等人从 Chenab 河三个不同地区采集的L. rohita标本中记录到的 He (0.5624) 。（2021）低于当前调查中报告的值。

在圈养种群中，种群规模小和负选择是导致近交衰退和遗传多样性的主要因素( Sah et al., 2018 )。然而，在本研究中，从不同鱼类孵化场收集的所有种群的观测杂合度和预期杂合度为 Ho = 0.67-0.79，He = 0.758-0.85，其中 TM 最高，TK 最低，表明杂合度水平有些相似。在一些圈养人口中。然而，苏丹娜等人。(2015)报道了L. rohita中 Ho = 0.42–0.7 和 He = 0.661–0.717 的低水平除此处报告的孵化场外，还从六个鱼类孵化场采集了样本。在本研究中，样本是在巴基斯坦各地收集的，而Sultana 等人。（2015）仅选择了一个省的孵化场。圈养种群遗传变异性的差异可能表明遗传意识水平、技术性和用于诱导育种的亲鱼数量。根据个人观察，与 Tanda 孵化场相比，TM 拥有健康的亲鱼和受过教育/培训的工作人员，并且实行亲鱼轮换实践。

在本研究中，野生和圈养种群中的 Ho 均低于 He，这表明与 HWE 的背离以及连续几代近亲繁殖的可能性，可能是由于非随机交配所致（Sharma 等，2016）。这些偏差不是系统性的，是在 24 项测试中的 12 项中检测到的，并且是在不同人群的不同基因座上发现的。例如，WR 在任何基因座上均未显示偏差，而其他基因座则在一个基因座（TM、MK、WK）、其他三个基因座（CM、SP、US）或所有基因座（TK）出现偏差。Alam 等人报告称，HWE 的偏离程度较低（41.66）。(2009)在三个野生种群中，而Ullah 等人。(2015)与本研究中观察到的 (50%) 相比，检测到 61.11% 的偏差。这种差异可能归因于不同的遗传结构（Hussain et al., 2021）。

在基于微卫星标记的分析中，观察到的 Ho 和 He 之间的 FIS 正值差异也很明显，该值揭示了菌株之间的差异，范围为 0.103 (TMs)–0.325 (TKs)。此外，除 TM 外，所有孵化场种群均表现出比野生种群 (0.164-0.165) 更高的 FIS (0.192-0.325)。高正 FIS 值归因于非随机交配导致近亲繁殖。与目前的观察结果一样，其他一些研究也表明巴基斯坦L. rohita种群的 FIS 值和杂合性损失水平相似（Qadeer & Abbas，2017；Sultana 等，2015））并确认本研究的结果。

基于微卫星和线粒体DNA分析的不同种群对之间的FST分析表明不同菌株之间的遗传分化较低，范围分别为0.002至0.059和0.004至0.068。两个标记均表明野生种群（WK 和 WR）中遗传差异最小，基因流最高。这可能是由于两条河流的物理连通性，喀布尔河在旁遮普邦阿托克与印度河交汇，拉维河在旁遮普邦拉詹普尔米桑科特与印度河交汇，尽管地理上存在距离，但这使得人口的基因混合得以实现。而且，阿拉姆等人，2009）。然而，MK 和 TM 之间以及 CM、TK 和 SP 之间的遗传距离较小，可能与孵化场之间共享育雏器有关，因为 Tawakkal 鱼类孵化场和 Mianchannu 鱼类孵化场位于同一省旁遮普省。同样，开伯尔-普赫图赫瓦省的白沙瓦鲤鱼孵化场和培训中心、查尔班达、马尔丹的政府鱼类孵化场和科哈特坦达政府鱼类孵化场均位于开伯尔-普赫图赫瓦省。由于地理距离的原因，同一个省而不是另一个省的孵化场之间共享育雏器是一种常见的做法。目前的调查证实了遗传和地理分离之间的相关性， 苏丹娜等人。（2015）和卡姆兰等人。(2023)，他观察到来自同一省的三个不同孵化场（费萨拉巴德、法鲁卡巴德和 Mianchannu 孵化场）的种群之间具有相当程度的遗传相似性。UPGMA 树状图根据遗传距离将八个菌株分为两个主要簇，随后又分为子簇，表明七个菌株的遗传邻近性。然而，美国菌株在基因上与所有其他菌株不同。

对微卫星标记和mtDNA进行的AMOVA分析表明，8个菌株之间的分子多样性主要是由于种群内的个体差异，与种群之间的差异关系较小。Luhariya 等人也报告了类似的发现。(2012)野生南亚野鲮种群。这两项研究均观察到，这些变异主要是由于微卫星标记和线粒体 DNA 基因的个体内部变异所致。在分散的种群中，特别是淡水物种中，通常预计会有更高程度的遗传分化（Habib，2010）。然而，在本研究中观察到的八个L. rohita菌株中相对较低的遗传多样性可能归因于共享祖先基因库。

结论
总之，基于微卫星和线粒体DNA标记，所有菌株在野生和圈养的 L. rohita群体中都表现出菌株内和菌株间的遗传变异，但总体变异为低至中等，反映出适当的管理策略。此外，当前研究的结果为启动基因计划提供了基线数据。