1 . 介绍
甲壳素由N-乙酰基-d-葡萄糖胺通过β-1,4-糖苷键连接而成，是昆虫角质层的主要结构成分。1蜕皮过程中几丁质的降解和合成对于昆虫的生长和发育至关重要。2由于高等动物或植物中不存在几丁质，因此昆虫中发现的几丁质分解酶已被研究作为潜在的杀虫剂目标。3根据对家蚕蜕皮液的蛋白质组学分析，已鉴定出四种丰富的几丁质分解酶，其中包括三种糖苷水解酶(GH) 家族 18 种几丁质酶（ChtI、ChtII 和 Chi-h，EC 3.2.1.14）和一种昆虫 GH20 β- N-乙酰基-d-己糖胺酶（Hex1，EC 3.2.1.52）。4 , 5不同物种的几丁质酶（ChtI 和 ChtII）的RNA干扰（RNAi）导致严重的表型，包括异常蜕皮、生长抑制和高死亡率（表 1）。6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Chi-h 的沉默，仅发现于 鳞翅目，可能导致一些幼虫（甜菜夜蛾、粘虫、黑夜蛾）的死亡。7 , 9 , 16 Hex1 表达的下调也会导致化蛹阶段异常表型的死亡（玉米螟）和旧角质层无法脱落（赤拟谷盗）。17 , 18这些研究支持它们在昆虫几丁质代谢中的关键作用。

昆虫几丁质分解酶的生化性质和作用机制的研究进展主要集中在亚洲玉米螟中。表达和功能分析表明GH18几丁质酶和GH20 Hex1参与了角质层几丁质的协同降解（图1）。图19、20具有一个催化结构域(CD)和一个几丁质结合结构域(CBD)的ChtI的非进行性几丁质酶从非还原端抛光几丁质原纤维。21 ChtII的II 组几丁质酶具有 5 个 CD 和 7 个 CBD，与几丁质晶体表面具有出色的结合亲和力。22 OfChtII 的表达早于OfChtI 和OfChi-h，可以随机催化几丁质链的内部水解，导致角质层上出现空洞。23它们为持续性外切几丁质酶提供了可接近的还原端。OfChi-h 结合底物的能力得到了增强，其持续合成能力也得到了增强。24 , 25然后Hex1作为外切酶，断裂 β-1,4糖苷键，将壳寡糖水解成N-乙酰基-d-葡萄糖胺（GlcNAc）。17因此，特定酶 ChtI、ChtII、Chi-h 和 Hex1 协同参与几丁质降解。因此，昆虫几丁质分解酶的多靶点策略可以综合调控多种途径，使其更容易高效发挥作用，且不易产生耐药性。除此之外，昆虫几丁质分解酶表现出相同的催化机制和与晶体结构揭示的底物相当的结合模式，这为发现针对这些潜在杀虫剂靶点的多靶点抑制剂提供了基础。

天然产物，包括微生物和植物来源的代谢物，已经进化出理想的物理和化学性质，可以更有效地与生物靶标接触。26大多数植物源代谢物不断进化以抵御昆虫和其他食草动物，提供了令人印象深刻的化学多样性。27由于几丁质分解酶参与植物病原真菌的防御，因此天然产物是开发昆虫几丁质分解酶的新型多靶点抑制剂的宝贵资源。该小型综述还介绍了源自针对昆虫几丁质分解酶（例如生物碱和类黄酮）的天然产物的多靶点抑制剂的进展。这些可能为发现具有优异生物活性的新型化学支架进一步应用于绿色农药提供思路。

2 . 几丁质分解酶作为多靶点的可行性
已经报道了亚洲玉米螟几丁质分解酶的晶体结构（ChtI 、21个ChtII、22 个ChtIII 、 28 个ChtIV 、 29个Chi - h、24 个Hex1）17 ，这为催化机制和催化机制提供了有意义的见解。底物的结合模式。结构和化学生物学分析表明GH18和GH20酶均采用底物辅助机制。来自亚洲玉米螟的四种几丁质分解酶（ChtI、ChtII、Chi -h 和Hex1 ) 具有保守氨基酸和相似的催化结构域整体结构（图 2a）。催化结构域具有经典的 (β/α) 8 TIM 桶，其中包含四个保守区域。GH18几丁质酶具有催化基序 DXDXE，GH20 Hex1 形成相邻基序 (Asp-Glu)。30、31结合底物的催化发生在GH18几丁质酶的亚位点+1和亚位点-1与GH20 Hex1的亚位点-1之间。以ChtI为例，酸性氨基酸 Asp 146与乙酰氨基相互作用在子位点-1处，并在初始反应中刺激对异头碳的亲核攻击。然后，Asp 146还可以稳定恶唑啉鎓离子中间体，并形成形成的正电荷，而 Asp 144似乎对于维持 Asp 146质子化至关重要。Glu 148贡献一个质子以支持糖基团在+1子位点的离开。在反应的第二阶段，Glu 148作为碱基，通过水转移的质子占据了断裂键的氧原子的位置。然后产生的羟基攻击杂环碳，导致 C1-O 键在过渡态断裂（图2b）。由于水分子的攻击方向与糖苷键的断裂方向相对应，因此-1糖环保留了其原始结构。31 GH18几丁质酶利用相同的催化机制，但一个区别是 还原端和非还原端的几丁质二糖 被ChtI和ChtII的核酸内切酶催化后从结合位点解离，而Chi-的持续外切几丁质酶在非还原性终产物首先离开后，h 向链的还原端前进至两个单元以进行再水解。GH20 Hex1也采用相同的催化机制。32Asp 367协助2-乙酰胺基团的羰基攻击糖苷键并稳定瞬时恶唑啉鎓中间体。Glu 368参与催化三联体（Asp 249 –His 303 –Glu 368）并促进水攻击中间体。

H18几丁质酶和GH20 Hex1不仅利用相同的底物辅助机制，而且根据与底物或底物类似物复合的几丁质分解酶的晶体结构，采用相似的结合模式（图2a）。GH18 几丁质酶含有长底物结合裂口 (SBC) 以及多个高度同源且富含芳香族残基的亚位点，例如从亚位点 -3 到 -3 的Trp 34、 Phe 61、 Trp 372、 Tyr 217、 Trp 107和 Trp 223 ChtI中+2 。ChtI /(GlcNAc) 2,3和酶-底物复合物的结构ChtII -C1/(GlcNAc) 7以及Of Chi-h 与脱乙酰壳低聚糖(GlcN) 的结构表明，这些分子以相同的相互作用和模式与SBC 结合。21 , 22 , 24与 SBC 结合的底物主要基于 π-π 堆积和/或与芳香残基的疏水相互作用以及与催化氨基酸的几个氢键。Hex1与N,N,N-三甲基-D-氨基葡萄糖(TMG)-壳三霉素的结合方式也是相同的。有关键的催化氨基酸（Asp 367和 Glu 368）和子位点 -1 和 +1 中的芳香族残基（Trp 490、 Trp 483、 Tyr 475、 Trp 448、 Trp 424和 Trp 524）。底物类似物TMG-壳三霉素的GlcNAcI通过疏水性堆积和+1亚位点处的氢键与Hex1相互作用。这些力使 TMG 组件稳定在活动口袋中。因此，这些酶本质上适合开发多靶点抑制剂。昆虫几丁质分解酶具有保守的底物结合腔并以类似的相互作用发挥作用，为我们合理设计新型多靶点抑制剂提供了可行性。

3 . 天然产物作为昆虫几丁质分解酶的多靶点抑制剂
针对多种昆虫几丁质分解酶的小分子可以实现对昆虫几丁质代谢的全面调控，且抗性风险较低。天然产物是几丁质分解酶抑制剂的潜在储存库，因为它们结构多样并参与多种自然入侵和防御事件。从天然产物中发现并验证了一系列昆虫几丁质分解酶的多靶点抑制剂，并证实了其生物活性（表2、图3），包括生物碱、黄酮类、萘醌类、氧杂蒽酮类和酚酸类。

3.1 . TMG-壳三霉素
TMG-壳三霉素是从环状链霉菌的培养滤液中获得的，被发现是昆虫和真菌 GlcNAcase 的选择性抑制剂。34 TMG-(GlcNAc) 4和TMG-(GlcNAc) 2对10 μM的Of Chi-h的抑制率分别为95%和65%。根据K i值，TMG-(GlcNAc) n对Of Hex1的抑制作用达到微摩尔水平。TMG-壳三霉素的结合方式类似于几丁质酶和Hex1中的底物，如图2a所示。TMG-(GlcNAc) n和 (GlcN) n可能是几丁质酶和 Hex1 的抑制剂。17 , 24 日

TMG-(GlcNAc) 4对亚洲玉米螟的生物活性测定表明，幼虫的发育受到严重阻碍。注射TMG-(GlcNAc) 4的幼虫中有60%在幼虫期停止发育，并蜕变成头部囊膜和胸部未分离的异常蛹。注射后几乎所有异常蛹和幼虫最终死亡。24

3.2 . 春雷霉素
春雷霉素（Kasugamycin）是一种著名的氨基糖苷类抗生素，被鉴定为来自三种不同生物体的 GH18 几丁质酶的抑制剂，对于ChtI和OfKi。发现春雷霉素通过静电相互作用、CH-π 相互作用和氢键与 GH18 几丁质酶的 SBC 相互作用，其方式与底物类似。不同GH18几丁质酶的-1亚位点甲基春酰胺部分的构象是相同的。D-肌醇部分定居在Of ChtI的 -2 亚位上，但它从Of中的芳香族氨基酸旋转离开Chi-h，导致缺乏CH-π相互作用，这可能是Of Chi-h活性较差的原因。上述研究为新型GH抑制剂的研发提供了新的支架。35

3.3 . 喜树碱
喜树碱（CPT）是一种五环单萜生物碱，来源于喜树，对同翅目、鞘翅目、双翅目、鳞翅目等多种昆虫具有杀虫活性。36几丁质酶被认为是喜树碱的潜在杀虫分子靶标。CPT 及其类似物被鉴定为 ChtII-C1 和 Of Chi-h 的竞争性抑制剂，具有微摩尔Ki值。分子动力学模拟表明， Of中 CPT 维持在 SBC 的 -1 亚位点上。ChtII-C1 通过与保守色氨酸残基相互作用（Trp 1961、Trp 1621、Typ 1691）。CPT还与Met 1801和Tyr 1803产生静电引力和范德华引力。37

CPT 对亚洲蝗表现出中等杀虫活性（第 8 天死亡率为 100%，5 mM），但对飞蝗具有强效活性（第 4 天死亡率为 100%，3.3 μmol/个体/天）。37

3.4 . 胡椒碱
胡椒碱是一种主要来源于胡椒的生物碱，不仅具有多种药理功能，还具有抗真菌和杀虫作用。38胡椒碱是一种潜在的抑制几丁质酶活性的化学支架。胡椒碱对三种 GH18 几丁质酶具有抑制作用， K i值范围为 55.73 至 83.03 μM。分子动力学揭示了相互作用模式，胡椒碱稳定地固定在 SBC 的 -1 至 +2 亚位点上。ChtI、Phe中的苯并间二氧杂环戊烯环与 Arg 195、Trp 223形成氢键和阳离子-π相互作用Of ChtII中的1830，以及Of Chi-h中的Lys 362和 Trp 411。胡椒碱的摆动哌啶酰胺部分和 SBC 的 -1 亚位点的保守芳香残基之间缺乏明显的非键相互作用，这为优化提供了方向。39还合理开发和生产了各种独特的胡椒碱衍生物，为探索基于胡椒碱支架的新型多靶点抑制剂提出了可行的策略。它们对Of ChtI、Of Chi-h 或Of ChtII 表现出优异的抑制效率。

胡椒碱具有良好的胃毒性，在 500 mg/L 的剂量下对亚洲螟有良好的杀虫效果（~33% 死亡率） 。胡椒碱还影响蜕皮、化蛹和羽化过程。胡椒碱衍生物化合物5k具有较好的抑制活性，在500 mg/L的剂量下对亚洲稻螟的杀虫效果达69.23%。39基于Of ChtI和Of Chi-h的活性的化合物7c在500 mg/L的剂量下表现出30.77%的杀虫效力。40具有胡椒碱和丁烯内酯支架的化合物 5f在剂量为 200 mg/L 时可达到 65% 的死亡率。41这些胡椒碱衍生物表现出更好的杀虫功效。

3.5 . 小檗碱
小檗碱是一种来自植物代谢产物的异喹啉生物碱，在医药和农业方面具有很强的生物药理活性。42小檗碱已被证明对 GH20、GH18、GH84 和 GH63 酶具有抑制活性。小檗碱对 GH18 几丁质酶和 GH20 Hex1 表现出竞争性抑制活性，包括OfChtI (Ki = 23 μM)、OfChi-h (Ki = 16.06 μM) 和OfHex1 (Ki = 12 μM)。小檗碱和GH18几丁质酶之间的抑制机制可以利用复合结构进行分析Sm ChiB 和小檗碱。来自粘质沙雷氏菌的Sm ChiB可以作为 GH18 几丁质酶的代表来分析结合机制。SBC +1 和 + 2 亚位点小檗碱的共轭平面通过 π−π 堆积相互作用被 Trp 97和 Trp 220夹在中间，这在其他几丁质酶中可能是相同的模式（图 4 a 和 b） 。小檗碱与Hex1的 -1 和 +1 亚位点中的Trp 490相互作用。带正电的共轭平面是一个关键的官能团，允许小檗碱与保守的带负电的残基（ Of中的Glu 328）产生静电相互作用。ChtI中的Hex1、Asp 218）（图 4c）。小檗碱还在Of Hex1中形成范德华相互作用。这些结果表明，小檗碱通过类似的抑制机制抑制这些酶，为开发多靶点农药提供了支架。

小檗碱对亚洲玉米螟的杀虫活性较小。在0.5 mM的剂量下，小檗碱可能导致一些幼虫死亡并损害幼虫生长。43

3.6 . 麻碱B 1
Phlegmacin B 1是微生物产生的次级代谢产物，已被证明具有抗疟原虫活性。44 Phlegmacin B 1还被鉴定为Of ChtI、Of Chi-h 和Of Hex1 的多靶点抑制剂，K i值分别为 79.3 μM、5.5 μM 和 26 μM。通过分子动力学模拟分析了phlegmacin B 1与Of Chi-h和Of Hex1复合物的抑制机制，了解其对两种酶的特异性抑制活性。麻碱B 1与Of Chi-h的 SBC 从 -3 到 +1 子位点合并。一个前蒽醌部分位于+1和-1子位点之间，因此与Glu 308和Trp 160形成氢键。另一个前蒽醌基团与色氨酸160堆叠良好。在Hex1中，只有一个前蒽醌部分与活性口袋中的Trp 490堆叠。Phlegmacin B 1还与Val 484和Lys 323生成两个氢键，但贡献不大。45

注射和饲喂实验均表明，phlegmacin B 1可导致亚洲稻螟幼虫死亡。Phlegmacin B 1显着影响幼虫的蜕皮和生长，包括头部不脱落的异常蛹。45

3.7 . 萘醌类
一些天然存在的萘醌类化合物是中药（紫草）的组成部分，不仅具有多种药理功能，而且还具有抗菌作用。46在此，紫草素及其类似物（脱氧紫草素和紫草素）被确定为 Hex1 抑制剂和几丁质酶的中度抑制剂， K i值范围分别为 0.68–1.8 μM 和 5.5–119.2 μM。脱氧紫草素优于其他化合物，并通过分子对接证明了其抑制机制。比较复合物中脱氧紫草素与三种几丁质酶的相互作用，脱氧紫草素与-1亚位点的保守色氨酸残基堆积，并与催化残基（Of ChtI中的Asp 146和Glu 148 ， Of ChtII中的Asp 1731和Glu 1733）产生氢键，以及Of Chi-h中的Asp 306和 Glu 308）。在Hex1的情况下，脱氧紫草素的萘醌和异己烯基分别位于+1和-1亚位。脱氧紫草素在Of中稳定Hex1 通过 π−π 相互作用和氢键形成，就像它与几丁质酶相互作用一样。47

紫草素是三种萘醌中对亚洲稻螟最有效的化合物，浓度为10 mM时，5天后死亡率为80%。紫草素对草地贪夜蛾和分离紫草也有毒性，在相同浓度下7天后分别导致50%和30%的死亡率。紫草素、紫草素和脱氧紫草素均影响亚洲玉米螟的发育和延迟蜕皮。47

3.8 . 黄酮类化合物
类黄酮是生物活性植物中最丰富的次生代谢产物之一，已知是由植物响应微生物感染而产生的，并具有多种药理特性。通过高通量筛选，发现48 种黄酮类化合物（汉黄芩素、黄芩素、山奈酚、槲皮素和杨梅素）是昆虫几丁质分解酶的抑制剂。淫羊藿素对Of ChtI和Of Chi-h的抑制作用优于其他黄酮类化合物，但对Of ChtII-C1和Of Hex1的抑制作用较差。杨梅素抑制活性ChtII -C1 和Hex1优于其他黄酮类化合物。分子对接揭示的结合机制表明，黄芩素通过形成π−π堆积相互作用与SBC的-1亚位点结合（Of ChtI中的Trp 372 、 Of ChtII-C1中的Trp 1961和Of Chi-h中的Trp 532） 。杨梅素还通过与芳香族氨基酸相互作用而与相同的亚位点结合，甚至比形成的黄芩素增强了堆积相互作用和氢键。杨梅素和黄芩素以相似的构象锚定在Hex1的口袋上，并与 Trp 490、 Trp 483、 Trp相互作用524和瓦尔327。杨梅素与天冬氨酸367和酪氨酸475形成额外的氢键，这可能是杨梅素的抑制活性比黄芩素高 8 倍的原因。47

在10 mM的剂量下测试了上述黄酮类化合物对鳞翅目害虫的生物活性。山奈酚、黄芩素、杨梅素对亚洲蝽的死亡率均低于20% ，而汉黄芩素则达到50%，是所研究的黄酮类化合物中生物活性最显着的。汉黄芩素对M. separata也更有效，死亡率高达88%。汉黄芩素虽然对草地贪夜蛾无杀虫作用，但对三种鳞翅目幼虫的发育过程有显着影响。47

3.9 . 氧杂蒽酮
山竹 果皮中富含的氧杂蒽酮已被证明具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌活性。通过机器学习和分子对接相结合的策略，将49 α-Mangostin 和 γ-Mangostin 鉴定为三种几丁质酶的多靶点抑制剂，其中K i值范围为 3.6 至 34.4 μM。分子对接分析表明它们主要通过氢键和疏水相互作用占据SBC的非还原端。例如，γ-山竹素与三种几丁质酶的-2和-1亚位点结合，通过氢键和π-π相互作用保持稳定。虽然只有一个取代基不同，但γ-倒捻子素对Hex1表现出比α-倒捻子素更好的抑制活性。γ-Mangostin 与 Hex1 结合时主要与 Glu 368 形成氢键，与Trp 490和Trp 524形成疏水相互作用。50

据报道，α-山竹素对双翅目、鞘翅目和半翅目害虫具有杀虫特性。10 mM浓度的γ-倒捻子素生物活性测试表明，γ-倒捻子素严重影响生长发育，但对亚洲玉米螟和草地贪夜蛾无杀虫活性。

3.10 . 酚酸类
咖啡酰奎尼酸 (CQA) 是一类重要的酚酸，是植物的次生代谢产物，可以防御生物和非生物胁迫。51 3,5-Di- O-咖啡酰奎尼酸 (3,5-CQA) 被鉴定为四种酶的多靶点抑制剂，具有微摩尔K i值。分子对接表明，3,5-CQA 以相同的相互作用（包括氢键和疏水相互作用）从 -3 到 +2 锚定在几丁质酶的 SBC 上。奎尼酸基团位于三种几丁质酶的-1亚位点，而3-咖啡酰基在还原端延伸，5-咖啡酰基在非还原端延伸。采取_以 ChtI 为例，催化氨基酸（Glu 148和 Asp 146）与奎尼酸基团通过氢键相互作用，SBC 中的芳香族氨基酸（Tyr 149和 Trp 34）主要通过 π-π 与咖啡酰基相互作用。堆叠。尽管Of Hex1中3,5-CQA的结合构象与几丁质酶中的不同，但相互作用的类型相似。5-咖啡酰基部分主要与活性口袋内的Arg 220、Glu 368、Trp 524和Trp 490相互作用，而3-咖啡酰基团可能通过与Val 369的氢键进一步提高亲和力口袋外面。3,5-CQA 的抑制活性也优于其他 CQA，这可能是由于其稳定的构象以及一个奎尼酸和两个咖啡酰部分在结合模式中的重要作用。50

浓度为 10 mM 时， 3,5-CQA 对亚洲稻瘟病菌和草地贪夜蛾的死亡率约为 30% 。3,5-CQA还会延迟幼虫的发育过程，导致其体重和体型变小。50

4 . 结论和观点
正如这篇小综述中所总结的，具有不同支架的天然产物已被确定为昆虫几丁质分解酶的多靶点抑制剂，例如生物碱、类黄酮和萘醌。尽管这些化合物在体外和体内均具有活性，但仍需要寻找具有更高杀虫活性的产品。因此，应利用人工智能、数据挖掘、高通量筛选等多种先进技术，探索更多天然产物，发现新型农药先导物。