1 . 介绍
利什曼病是一种由原生动物利什曼原虫引起的人畜共患疾病。由雌性白蛉（白蛉）传播。这种疾病在欧洲、亚洲、非洲和美洲超过 88 个国家流行[1] , [2]。根据其趋向性，可分为皮肤型、皮肤粘膜型或内脏型[3] , [4]。

犬利什曼病呈现出非凡的临床多态性，能够影响许多系统或器官[2]。最近的研究揭示了不同淋巴组织（如脾脏或淋巴结）中寄生虫负载或临床状态与其免疫学或生化特征、血液学参数和组织病理学生物标志物的改变之间存在显着相关性[2]、[5]、[6]。

不幸的是，血液学和/或血清生化特征对于利什曼病诊断的用途有限。然而，它们对于评估受感染动物的临床进展很重要，也可能有助于了解利什曼病的发病机制[2] , [7]。

最近的研究发现，中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、血小板与淋巴细胞比值（PLR）和全身免疫炎症指数（SII）可以作为肿瘤和疾病危重人类患者发病率和死亡率的预测因子。 /或心血管疾病[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]，以及某些传染病，如 COVID-19 [14]、[15]。另一项研究评估了皮肤利什曼病患者的 PLR，发现与健康个体相比，患病患者的 PLR 有统计学上的显着升高[8]。

在狗中，NLR 在不同的情况下进行了评估，例如全身炎症反应综合征 (SIRS)、化脓性腹膜炎、胰腺炎、病因不明的脑膜脑炎、慢性炎症SIRS：肠病、心脏病和不同类型的肿瘤。有趣的是，已经证明，高 NLR 值通常与更严重的炎症状态、肿瘤的恶性程度更高以及总体预后较差相关[16]、[17]、[ 18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。PLR 和 SII 已在患有慢性炎症性肠病的狗中进行了评估，并且 PLR 也在患有急性胰腺炎的狗中进行了研究。患有慢性炎症性肠病的狗的 PLR 和 SII 值下降，与临床改善同时发生。此外，患有急性胰腺炎的狗和猫的 PLR 显着升高，并且恢复时间延长[20] , [21]。在继发于粘液瘤性二尖瓣疾病的充血性心力衰竭的狗中，PLR 并未导致临床上显着的变化[23]。

这项研究旨在实现两个主要目标。首先，其目的是确定诊断患有利什曼病的狗群中的中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）、血小板与淋巴细胞比率（PLR）和全身免疫炎症指数（SII）。其次，它试图调查这些参数、利什曼病的严重程度和狗一年内的存活率之间的潜在相关性。

2 . 材料和方法
该研究包括第一组回顾性数据，随后是前瞻性数据。2012年1月1日至2022年9月31日之间的临床病例已被纳入。

本研究得到了环境和农村、土地政策和领土部伦理委员会以及埃斯特雷马杜拉动物健康委员会的批准（西班牙；批准号：No 2018208250016063）。

根据健康状况（健康和患有利什曼病）将动物分为不同的组。患有伴随病症的狗被排除在外。

健康动物组，称为对照组（C 组），由 43 只不同品种的狗组成，主要是杂交品种，它们要么在我们医院的内科服务部门接受过临床检查，要么是选择性绝育计划的一部分。纳入标准是已正确驱虫和接种疫苗、体检正常、血液和尿液检查正常、利什曼病诊断测试（Uranotest Leishmania、Uranovet）呈阴性结果的成年犬。

病犬组（L组）由100只诊断患有利什曼病的成年犬组成，排除无形体、埃利希体和心丝虫检测呈阳性的动物（Uranotest Quattro，Uranovet），根据国际肾脏利益协会（IRIS）的分类进行分组（第 1、2、3 和 4 期）[ C 组： ] 并取决于生存期是否低于或超过一年（分别为 L1Y 和 G1Y）。

考虑到临床体征和/或临床病理异常，利什曼病的诊断按照先前 Solano Gallego 等人，2011 年[20]和 Belinchón-Lorenzo 等人，2013 年[21]的描述进行。对怀疑患有利什曼病的狗进行血清学检查（ELISA 测试）。在滴度高（至少三倍）的动物中，没有进行进一步的测定。在滴度低的狗（14 名患者）中，进行了淋巴结或骨髓的细胞学检查（在 4 只动物中观察到无鞭毛体）。在未获得验证性 ELISA 且细胞学中未观察到无鞭毛体的其余狗（10 只动物）中，对骨髓进行 PCR 以确认诊断。

通过穿刺头静脉、隐静脉或颈静脉获取血样，并立即处理所有样品。

对于血液学分析，使用 EDTA-K3 作为抗凝剂。在自动分析仪（BC-5300 Vet，Mindray）中对血液进行分析，并对红细胞、白细胞和血小板系列进行完整的研究。对所有狗进行血涂片（Diff 快速染色）和 40 倍整个涂片的手动计数。

对于血液生化，肝素钠用作抗凝剂。获得的血浆用于测定以下参数：尿素、肌酐、磷、总蛋白和白蛋白；所有这些都在自动分析仪（Saturno 100，VetCrony Instruments）中进行分析，每个参数使用特定的商业套件（Spinreact Laboratories）。球蛋白浓度通过从总蛋白中减去白蛋白来计算。通过超声引导的膀胱穿刺术收集尿液样本。首先，使用尿液试纸（Spinreact），通过折光仪（PCE-Oe，PCE Instruments）测定尿比重，通过自动化学分析仪计算尿蛋白：肌酐比值（UP/C）（UP/C）。 Saturno 100，VetCrony 仪器）。

NLR 计算为中性粒细胞/淋巴细胞比率，如先前的 Arbel等人，2012 [20]所述，PLR 计算为血小板计数与淋巴细胞计数的比率，如先前的 Kurtul等人，2014 [21]所述。全身免疫炎症指数 SII 是利用血小板计数和中性粒细胞/淋巴细胞比率（SII，血小板计数 * 中性粒细胞/淋巴细胞比率）计算的，如之前 Yang 等人，2020 [13]所述。

使用SigmaPlot 14.5软件进行统计研究。进行夏皮罗-威尔克正态性检验，获得数据的非高斯分布。因此，对血液学和血浆生化值的所有成对比较进行了 Kruskal-Wallis 检验，然后采用 Dunn 事后方法。为了比较获得的数据，用两种不同的方式将狗分开。首先，根据 IRIS 阶段的肾病严重程度将病犬分开，并与对照组进行比较。然后，根据患者的生存期（超过或低于 12 个月）将患者分开，并与对照组进行比较。当 p < 0.05 时，值被认为具有统计显着性。数据以中位数±标准差表示。

3 . 结果
L组由100只不同品种的狗（主要是杂交品种）组成，其中40只雌性（媒体年龄和标准差为6.16±2.98岁）和60只雄性（媒体年龄和标准差为7.16岁） ± 2,50 年）。根据 IRIS 将这些狗分类为：第 1 阶段有 52 只狗，第 2 阶段有 18 只狗，第 3 阶段有 15 只狗，第 4 阶段有 15 只狗。此外，在存活低于 12 个月的患者中，不考虑其 IRIS 阶段，将这些狗分开（34 只狗） ）或初次诊断后 12 个月（66 只狗）。

C组由43只狗组成，其中17只雄性（平均年龄和标准偏差4.71±2.34岁）和26只雌性（平均年龄和标准偏差3.75±2.71岁）。

表 1详细列出了不同 IRIS 阶段研究参数的变化。我们的数据显示，随着疾病的进展，血细胞比容下降，与 C 组相比，所有阶段都有统计学显着差异，而与 IRIS 2、3 和 4 相比，第 1 阶段的血细胞比容也有统计学显着差异。超过 1 年（L1Y 和 G1Y），组间以及相对于 C 组具有统计学显着性差异（表 2；p<0.001）。

随着疾病的进展，中性粒细胞计数呈增加趋势(如表1和表2所示)。然而，仅当根据存活时间将狗分开时，才观察到与对照组（C）组相比的统计学显着差异。发现与对照组相比，L1Y 和 G1Y 组的中性粒细胞计数较高（表 2）。就淋巴细胞计数而言，除了IRIS 2之外，在表1和表2中列出的所有组中观察到与C组相比具有统计显着性差异。此外，表1和表2显示了在血小板系列值中观察到的变化。

因此，随着疾病的进展，NLR呈现增加趋势，并且与对照组相比，IRIS 3和4（表1）以及G1Y和L1Y组（表2）与对照组相比，存在统计学上的显着差异。类似地，随着疾病恶化，SII趋于增加，并且仅当与IRIS 4和L1Y的对照组相比时才观察到统计学显着差异（表2）。然而，没有观察到 PLR 的相关发现。

表1和表2还提供了研究的主要血液生化参数。随着疾病恶化，观察到肌酐、尿素和磷的增加，发现C组和IRIS 1与其余阶段之间存在统计学显着差异（表1）。当使用一年以上或以下的生存率对患者进行分类时，也可以观察到相同的情况，观察到C组和组间的显着差异（表2；p<0001）。此外，与对照组相比，所有 IRIS 组的血浆白蛋白浓度均显示出统计学上显着的降低（C；p<0.001），与生存时间无关（表 2；p<0.001）。

4 . 讨论
犬利什曼病呈现出非凡的临床多态性，针对多个器官和组织，因此必须在犬医学的各种鉴别诊断中予以考虑，特别是在流行地区[2] , [22]。

最近的人类研究已确定 NLR、PLR 和 SII 是危重患者发病率和死亡率的预测因子[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。Cristóbal JI 等人进行的一项研究中。(2022)，建立了健康狗的参考值，表明 NLR (0,74−5,62)、PLR (56,41−198,02) 和 SII (52,93–1503) 的范围[17]。在我们的对照组中观察到的值落在之前在健康个体中验证的这些指数的范围内。

在我们的研究中，随着疾病的进展，观察到 NLR 逐渐增加，与 IRIS 3、4、L1Y 和 G1Y 中的 C 组有统计学显着差异，这表明 NLR 可能与疾病的严重程度有关。在之前的研究中，据描述，中性粒细胞计数随着疾病的进展而增加，并且在具有更明显临床症状的狗中，表明与针对寄生虫的炎症反应相关的中性粒细胞需求更高[3]，[24]。相反，随着疾病恶化，外周血中的淋巴细胞计数减少，这是对寄生虫在其迁移到的目标器官中的作用的反应，这与所获得的发现有关[3]，[25]，[24]、 [26]。这些观察结果与 Ferreira 等人的观点一致。2021 年[27]，他发现与健康狗相比，受利什曼病影响的狗的 NLR 更高，但与 Escobar 等人的报告相反。2019年[28]有所下降。我们的结果与 Escobar 等人的结果之间的差异。2019年[28]的研究可归因于他们的研究中使用的动物数量较少（11只病狗）以及不排除其他疾病的事实。

PLR 中未观察到显着变化。在对患有慢性炎症性肠病和胰腺炎的狗进行的不同研究中，PLR 随着临床改善而下降[16]，[17]，但在我们的研究中，所有组中都获得了与健康狗相似的值。因此，我们的研究表明 PRL 不能预测受利什曼病影响的狗的死亡率。这可以通过以下事实来解释：大约 50% 受影响的狗表现出血小板减少症，30% 表现出淋巴细胞减少症，但比例没有显着差异[29]、[30]。

我们的数据显示，随着疾病恶化，SII指数呈增加趋势，这与之前的人类研究一致[8]、[9]、[11]，在IRIS 4和L1Y中与C组有统计学显着差异。如前所述，这一发现主要归因于在疾病晚期观察到的中性粒细胞水平升高。在兽医领域，疾病改善或慢性炎症性肠病等病例中已注意到该指数的下降[17]、[19]、[31]。

大约 60% 的受感染动物出现贫血[24] , [26]，这与我们的研究一致，其中 62% 的动物表现出这种改变。我们的数据显示，所有患病动物组的血细胞比容均低于下限（表 1 和表 2），在更晚期的 IRIS 阶段（IRIS 4）或生存期较短的患者（L1Y）中血细胞比容较低。这一发现可能归因于骨髓寄生导致红细胞生成减少或慢性肾衰竭导致红细胞生成素生成减少。此外，由红细胞隔离在肝脏和/或脾脏中引起的溶血因感染的炎症反应而加剧，这也解释了观察到的血细胞比容的下降[2]，[24]。

在患有利什曼病的狗中，血浆生化对于评估和监测肾功能和肝功能非常有用。虽然这些参数不能用于诊断疾病，但它们可以提供患者临床状态、预后和演变的相关重要信息[28]。

利什曼病犬的一个非常常见的并发症是肾衰竭。这是由循环免疫复合物在肾小球中沉积引起的，会造成不可逆的损伤，导致慢性肾脏疾病，这是死亡的主要原因[29] , [30] , [31] , [32] , [33]。这些变化反映在肌酐和尿素血浆浓度的增加上。肌酐血浆浓度用于根据 IRIS 对动物进行分类（表 1），观察到 C 组和存活一年以上及以下的动物显着增加（表 2）。血浆尿素浓度从IRIS 2开始显着升高（表1）。据描述，其他因素也会影响尿素升高，例如消化道的慢性失血[34]，[35]。与血浆肌酐和尿素水平升高同时，循环磷浓度也增加，并且众所周知，患有高磷血症的狗预后较差，存活率降低[36]。随着血浆肌酐的增加，磷的重吸收能力降低，两者都是疾病严重程度的晚期指标，在我们的研究中观察到 IRIS 4 和 L1Y 中磷的浓度最高。

受利什曼病影响的狗中与血浆蛋白相关的最常见的改变包括血浆白蛋白水平低和球蛋白水平高。球蛋白水平的增加导致疾病更不利的发展，几乎没有保护作用[24]，[30]，[37]，[38]，[34]。在我们的研究中，所有组中该参数相对于 C 组均观察到统计学显着差异。

这项研究的主要局限性之一在于其回顾性和前瞻性的性质，这会带来某些固有的偏见。此外，尿液分析和蛋白质/肌酐比数据并不适用于所有狗，以及更多诊断测试（例如间接荧光抗体测试......）。尚未考虑使用 SDMA 进行分类，因为很大一部分样本是在 2019 年之前采集的，这一年 IRIS 分类进行了修订，将 SDMA 作为肾脏疾病分类的要求[39]。另一个限制是该研究使用单个样本，从而限制了评估疾病进展的能力。在未来的研究中，通过 C 反应蛋白等测定来评估动物的炎症状态，对于获得患者临床状况的更全面的了解将会很有趣。

5 . 结论
总之，根据获得的结果，NLR 和 SII 值随着利什曼病的进展而增加，这些发现支持进一步的研究，并可能有助于临床评估疾病的严重程度。这种情况与 PLR 不同，因为与对照相比没有观察到统计学上的显着差异。这是第一项针对患有利什曼病的狗进行 SII 调查并获得临床相关结果的研究。使用不同时间点的不同样本来评估患者的进展以及与炎症参数进行比较将会很有趣。