1 . 介绍
嗜血支原体或血原体是广泛存在的细菌，附着在哺乳动物的红细胞表面[1] , [2]，可引起不同程度的溶血性贫血，特别是在免疫功能低下的宿主中[1] , [2]。在过去的几年中，血原体的宿主范围急剧增加，并且很难找到不受一种或多种这些细菌感染的野生物种[2]。

尽管微型哺乳动物（啮齿目和真鼠目，后者以前称为食虫目）数量丰富且分布在世界范围内，存在于所有类型的环境中，包括与人类密切相关的动物，但在这些分类学中对血原体感染的关注很少。组。仅在少数地理区域发表了少量针对啮齿动物的研究。大多数研究包括同人物种，如家鼠 ( Mus musculus ) 或大鼠 ( Rattus spp.) [1]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。真正的野生啮齿动物仅在巴西[6]、[9]、[10]、瑞士[1]、南非[11]和以色列[12]进行了调查。

已经建立了两种啮齿动物血原体，均属于血猫支原体组：球状支原体和血鼠支原体。大多数感染野生啮齿动物的基因型与这两种动物密切相关，除了大型啮齿动物，例如水豚（Hydrochoerus Hydrochaeris）和毛矮豪猪（Sphiggurus villosus），它们似乎具有血浆体[13]，[14]。此外，还描述了一些特征不明的新基因型[3]、[7]。相比之下，目前还没有研究调查真鼠类成员中血原体的存在，真鼠类是一种分类目，包括刺猬、鼩鼱或鼹鼠等。

由于多种原因，有必要扩大我们对野生啮齿动物血原体感染基因型和其他特征的了解。首先，它将作为一个新的部分来完成嗜血支原体系统发育的复杂难题。其次，啮齿动物数量丰富，适合测试有关传播和感染动态的不同假设（例如[12]）。还假设某些啮齿动物可能是感染家猫[1]和野生食肉动物[15]、[16]、[17]的某些血原体物种的天然宿主。，可能会因猎物到捕食者的溢出而被感染。最后，从人畜共患病的角度来看，它也具有相关性[18]、[19]、[20]。尽管迄今为止没有啮齿动物血原体被认为是人畜共患的，但通常，后来在野生动物中检测到人类中描述的新病原体，例如由血人支原体引起的飞狐溶血热的情况[21] , [22] , [23]，[24]。

血浆的传播方式尚未完全阐明。与媒介传播和直接途径[2]一起，垂直传播被认为是人类和家养物种的另一种传播方式，尽管这方面的证据有限且存在争议[25]、[26]、[27]、[ 28]、[29]、[30]。对圈养的野生啮齿动物进行的一项实验研究未能证明母婴传播，尽管此类实验的样本量很小[12]。没有其他研究调查过野生动物的子宫内传播。因此，血浆的垂直传播需要进一步探索。

本研究的目的是确定伊比利亚半岛不同栖息地的野生啮齿动物和鼩鼱样本中嗜血支原体的感染率和遗传多样性。我们还旨在通过比较远距离的同一物种，了解血原体的遗传特性是否与宿主物种或地理位置更相关。以及是否发生从母亲到后代的垂直传播。

2 . 材料和方法
本次调查中包含的微型哺乳动物是 2013 年至 2020 年间在西班牙东北部三个省的四个研究地点进行的不同研究中现场捕获的（图 1）。这三个地区的生物气候条件截然不同：奥德萨国家公园（42°40′N 00°03′E）位于韦斯卡省（阿拉贡）比利牛斯山脉，是海拔 2000 米以上的高山栖息地；洛斯莫内格罗斯（Los Monegros）（41°49′N 00°45′W）位于萨拉戈萨省（阿拉贡），是一个寒冷半干旱气候的草原；科塞罗拉 (41°24′N 02°04′E) 和圣洛伦索德尔蒙特 (41°38′N 02°01′E) 自然公园位于巴塞罗那省（加泰罗尼亚），相距仅 25 公里，具有典型的地中海风格。气候。

图。1
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图。1。西班牙半岛地图显示了阿拉贡和加泰罗尼亚的研究地点以及采样的微型哺乳动物物种。数字指出了三个研究地点和栖息地类型：1，Los Monegros（草原）；2、奥德萨国家公园（高山）；3、Collserola 和 Sant Llorenç del Munt 公园（地中海）。Jordi Mateos 的绘图来自“Atlas y Libro Rojo de los Mamíferos Terrestres de España”，由 Dirección General para la Biodiversidad-SECEMSECEMU 编辑，经授权使用。

本研究包括三种不同的 Eulipotyphla 和六种啮齿类动物（表 1）。使用谢尔曼陷阱（HB Sherman Traps，Inc.，塔拉哈西，佛罗里达州）捕获动物，并将其从陷阱转移到塑料袋中，使用 Pesola 秤称重，精确到 0.5 克，并用氯胺酮（Domtor©，Esteve）组合麻醉。 ，巴塞罗那，西班牙）和美托咪定（Imalgene©，梅里亚，巴塞罗那，西班牙）[31]。然后对啮齿类动物实施安乐死并进行详细尸检。收集一块脾脏并保存在 –20 °C 直至进一步分析。还从陷阱中发现的死鼩鼱身上获取了一块脾脏。在对 12 只怀孕雌性（3 只鼩鼱和 9 只小鼠）进行尸检时，小心取出完整的子宫，放入单独的小瓶中，并保存在 –20 °C 下。随后，使用一套消毒的仪器将胎儿（n=35，每窝一到六个胎儿）从子宫中单独取出到解剖罩中，并放入单独的小瓶中。为了避免污染，每个胎儿都使用不同的解剖工具，每个样本后都用95%乙醇清洗并进行火灭菌。

基于 Sybr Green 化学的实时 PCR，以支原体spp 的 16 S rRNA 基因的 391 bp 为目标。[8]进行了。我们已经证明，与整个基因的表征相比，该协议发现了足够的变异性来表征检测到的血浆[32]。通过桑格测序，用两种引物对 PCR 片段进行测序。我们进行了 BLAST 搜索，以将测序产物与 GenBank 中描述的血血浆序列进行比较。ClustalW 对齐后，使用 ModelFinder（IQ-TREE Web 服务器）进行进化模型的选择[33]。然后，利用基于Tamura-Nei模型的最大似然算法进行系统发育分析。本研究中获得的显示 100% 同一性的序列被分类为相同核苷酸序列类型 (ntST)。所有序列分析均使用 MEGA 软件 X 版进行[34]。为了推断在啮齿动物、鼩鼱、翼手目动物、灵长类动物、食肉动物和有蹄类动物中检测到的支原体的基于宿主的聚类，使用 Splitstree4 软件（版本 4.19）在 Jukes-Cantor 距离上的 NeighborNet 模型上进行了系统发育网络[35]。

新的支原体16 S rRNA 基因序列已提交给 GenBank©，登录号为 OR661898-OR661911。

使用卡方或费舍尔精确检验比较不同目、物种和栖息地之间患病率的差异。

3 . 结果
189 名成年人中有 49 人的血质 DNA 呈阳性（观察发生率 = 25.9%；95% 置信区间 = 19.8%–32.8%）（表 1）。总体而言，Eulipotyphla 和 Rodentia 之间的病原体发生率没有差异（36% vs 23%；χ 2 =2.8，p>0.5）。在比较样本量足够的物种时，雪田鼠的发生率 (6%) 显着低于阿尔及利亚小鼠 (34%) 和白齿鼩鼱 (32%；Fisher's p = 0.037 和 0.007，分别)。

当物种合并时，草原 (69%) 的发生率高于高山 (19%；Fisher p= 0.0001) 和地中海 (12%；χ 2 =34.6，p<0.001)，但没有这种差异在高山气候和地中海气候之间观察到了这种差异（Fisher p= 0.42）。当比较在不同栖息地捕获的相同物种时，来自草原的阿尔及利亚小鼠的发生率明显高于地中海气候的小鼠（Fisher's p = 0.0001）。白齿鼩也有类似但不显着的趋势（χ 2 =3.4，p=0.06）。

测序结果显示，56 个成人可读序列中存在 14 个 ntST（表 2、表 3）。序列之间的同一性在 94.9% 到 99.2% 之间，与已发表的序列的同一性在 94.1% 到 100% 之间。一般来说，这些序列在全世界的啮齿类动物中都有描述，但有以下几个例外：ntST-5 与在蝙蝠蜱Ixodes simplex中检测到的序列 100% 相同；ntST-8还表现出与狗血原体血型支原体100%同一性；ntST-10 和 11 与蝙蝠 ( Eptesicus Furinalis)的序列分别具有 95.7% 和 97.1% 的同一性，Genbank® 登录号 MK353816）。此外，ntST-11与来自大鼠（褐家鼠，Genbank登录号AB752303）的序列具有相同的一致性（97.1%）。系统发育树将我们的序列分类为不同的进化枝，包括啮齿动物、食肉动物、蝙蝠和人类的血浆（图2）。ntSTs-1、2、9 和 14（啮齿类动物簇的 88%）、ntST-7（啮齿类动物簇的 99%）、ntST-13（M. coccoides的 100% 、分别）、ntST-11 和 12（在单纯性支原体中检测到的 90%支原体）和 ntST-8（100%血支原体）。ntST-3、4、6 和 10 未正确分类。

网络分析（图3）与系统发育树一致，揭示了至少9个按主要宿主分类群分类的不同簇。大多数 ntST（1-4、6、7、9 和 11-13）被分为三个不同的啮齿动物簇，而 ntST5 和 10 被分为两个不同的翼手类簇，ntST8 被分为有蹄类簇。有趣的是，我们的网络显示，食肉动物的血浆分布在有蹄类动物、啮齿类动物和翼手目动物的不同簇中。

图3
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图3 . 系统发育网络对从Genbank和本研究获得的60个序列的Jukes-Cantor距离进行NeighborNet模型。我们研究中获得的序列通过其核苷酸序列类型（ntST）进行标记，而在Genbank中获得的序列的标签是指其宿主分类单元（Carn：食肉动物；Chir：翼手目；Prim：灵长类；Rod：啮齿类；Rod：啮齿类Ung：有蹄类动物）。

在木鼠（19 个可读序列中有 8 个不同的 ntST）和阿尔及利亚小鼠（9 个可读序列中有 7 个不同的 ntST）中检测到最高的多样性。相比之下，白齿鼩的 11 个序列中有 9 个属于同一个 ntST。很少有物种间共享 ntST 的案例被发现，而且总是涉及木鼠或阿尔及利亚鼠。在草原，ntST-12 被白齿鼩鼱、家鼠和阿尔及利亚小鼠共享；ntST-13在白齿鼩鼱、阿尔及利亚小鼠和黑大鼠之间共享。在地中海地区，木鼠、伊特鲁里亚鼩鼱和黑鼠共有 ntST-2。当比较不同的研究区域时，ntST-3在高山和地中海地区的木鼠之间是共享的；ntST-10 存在于草原和地中海地区的白齿鼩鼱中；

12窝中的9窝（75.0%）中的35个胎儿中有12个（34.2%）血浆阳性（表4）。阳性胎儿属于三个不同物种，在血浆阳性和阴性母亲中均发现。一只呈阳性的雌性鼩鼱有五个阴性胎儿。当从母亲和胎儿处获得可读序列时，在一种情况下它们具有相同的 ntST，而在两种情况下则不同。其中包括一位患有 ntST-12 的母亲和两个阳性胎儿，一个感染了 ntST-12，另一个感染了 ntST-13。

4 . 讨论
越来越多的研究表明，血浆体在野生动物中多种多样且普遍存在[2]。然而，这样的审查还确定了在监测方面代表性不足的分类群体，其中两个群体是啮齿动物和食虫动物。该评论还反映出，欧洲仅进行了少量关于该主题的研究[2]。因此，本次调查有助于通过有关野生啮齿动物血浆的新数据和新的基因序列（其中一些可能对应于尚未描述的物种）部分地弥补这些弱点。

此前，仅发表了两项关于欧洲自由放养啮齿动物血浆的研究。第一个实验在瑞士进行，以确定它们作为猫科动物血原体自然宿主的作用，其在野生物种中的平均患病率，代表性样本量范围为 0% 至 47% [1]。然而，这项研究使用了物种特异性引物，这可能导致无法检测到其他血浆。第二项研究分析了匈牙利的同生啮齿动物，总体患病率较高（71%；[3]）。世界其他地方分析血液或脾脏样本的研究报告患病率约为 50% 或以上[7]、[8]、[10]，但智利的一项研究除外（8%；[5]））。因此，与之前的研究相比，我们的调查期间观察到的发生率可以被认为处于低度和中等程度之间[5]，[7]，[8]，[10]。

这项研究首次证实鼩鼱也容易受到血原体感染，并且其发生率与其他野生动物相当。然而，该物种的序列多样性较低。大多数个体，即使是来自 350 公里外的两个地区，也感染了同一种 ntST，而这种病毒不与任何其他物种共享。这表明该变体与其宿主之间存在密切关联或共同进化。根据与最接近序列的低相似度（96.8%）和系统发育分析，该序列对应于一种新的基因型。然而，系统发育分析无法解决其分类问题。尽管在蝙蝠中发现了其最接近的序列，并且该序列在系统发育树中被归类于其他蝙蝠序列中，但引导值较低。

与其他两种类型的栖息地相比，草原栖息地的患病率更高，无论是在所有物种集中的情况下，还是在仅比较最具代表性的物种时。这与之前在智利野狐中的观察结果一致，在智利野狐中发现，在所研究的最干燥地区，血胞浆菌的患病率较高[36]。草原栖息地比其他两个研究的生境更干燥和更热，但显然，这不应该有利于细菌在宿主中的持久存在或增强血质的传播。在所有三个栖息地的动物中都发现了跳蚤、蜱虫和螨虫（数据未显示），因此节肢动物媒介流行率的差异似乎不是原因。高山雪田鼠的患病率非常低，这可能是由于研究区域雪田鼠种群的丰度较低。

4.1 . 遗传变异和种间传播
正如之前在野生动物中发现的那样[2]，样本中的遗传多样性相当大，尤其是啮齿类动物。这里分析的一些来自地中海地区的木鼠之前曾进行过巴尔通体 DNA 分析。[37]，该物种也是巴尔通体含量最高的物种基因型多样性。这种啮齿动物的特殊攻击性或宿主种群的高丰度可能会增强病原体的传播，这可以解释这种多样性。来自草原的阿尔及利亚小鼠也表现出相当大的多样性，在仅有的 9 个可读序列中就有 7 个不同的 ntST。尽管我们没有该地区的种群数据，但阿尔及利亚小鼠是草原上最常捕获的啮齿动物（数据未显示），并且是通常在干燥气候中发现的物种。相反，如前所述，白齿鼩鼱的大多数可读序列都属于同一个 ntST-10。这也与 Cevidanes 等人的研究一致。[37]，其中大多数鼩鼱都感染了相同的巴尔通体基因型。鼩鼱和啮齿动物是遗传上距离较远的分类群体，这可能会阻止种间传播。事实上，大多数共享的 ntST 都是在啮齿动物之间发生的，只有一种与鼩鼱之间存在共享，这可能是孤立的溢出事件的结果。

尽管一些血原体基因型在微型哺乳动物物种之间是共享的，但大多数都表现出宿主特异性，正如之前在蝙蝠中发现的那样[38]。此外，通过比较来自遥远地点的相同物种，我们获得了血浆基因型与特定宿主相关这一事实的进一步支持。尽管在某些地区我们只能获得一些序列，但总的来说，我们发现在两个不同地区捕获个体的三个物种中，它们的遗传变异都存在于两个地点。这在鼩鼱身上尤其明显，在 300 多公里外捕获的鼩鼱个体中发现的单倍型更为频繁。从这个意义上我们可以得出结论，宿主-寄生虫与最终的种间传播事件存在一定程度的关联。

两只林鼠和一只鼩鼱被与血支原体/血猫（这些物种仅根据 16 S rRNA 测序无法区分）、家养和野生食肉动物的血原体100% 同一性的序列感染[39]。这可能是从食肉动物向啮齿动物溢出的结果，但这种假设缺乏生态意义。相反，这为以下可能性打开了大门：血猫分枝杆菌/血猫分枝杆菌最初是一种啮齿动物病原体，通过猎物到捕食者的方式传播到食肉动物，正如血猫分枝杆菌的假设一样 [1]。从这个意义上说，网络分析表明，食肉动物通常存在于其他分类群的进化枝中。这表明通过捕食路线发生溢出事件，正如之前的假设[15]，[39]，[40]。

4.2 . 垂直传输
我们发现了强有力的证据，证明血浆在子宫内从雌性传播到其后代。此外，我们在三种研究物种中证实了这一点：一种鼩鼱和两种小鼠。人们经常假设存在血原体垂直传播，这可以解释一些所研究的野生动物（例如 97% 的蝙蝠种群样本，[41]）中普遍存在的高流行率，以及幼年和成年之间流行率缺乏差异的原因。一些研究中发现了成年个体（例如[39]）。七十多年前，已有猪子宫内传播的报道[42]。在人类中，嗜血支原体。在所有 44 名接受检测的阳性孕妇的脐带以及出生时采集的新生儿外周血样本中均发现了这种病毒[27]。最近的研究报告支持潜在垂直传播的发现，包括在哺乳前的新生羊驼[25]、[30]和仔猪[43]、新生牛犊[26]、[29]和狗[44]中检测血质 DNA 。因此，我们首次提出野生动物垂直传播的证据。与我们的发现相反，科恩等人。[12]未能从野生捕获的阳性安德森沙鼠 ( Gerbillus andersoni)中检测到受感染的后代) 女性，也不是来自实验感染的女性或未感染的女性与实验感染的男性的结合。然而，这些实验缺乏成功可能是由于样本量较小，因为正如我们在此所示，并非所有窝或受感染雌性的窝中的所有个体都是阳性的。最近对野生动物进行的一项研究表明，蝙蝠体内不太可能发生血浆经胎盘垂直传播[45]。同样，霍诺克等人。[29]仅在 10.5% 的小牛 ( Bos taurus ) 中证实了血浆 DNA（38 头中有 4 头）。霍诺克等人。[29]表明血质基因型是解释是否发生垂直传播的一个因素。我们没有找到支持该假设的证据，因为我们发现感染了五种不同 ntST 的阳性胎儿，并且这些 ntST 在系统发育树中单独分类。

我们的垂直传播研究得出的另一个有趣的发现是，胎儿并不总是与母亲共享血质基因型。此外，一位母亲的胎儿有两种不同的 ntST。对这一发现最合理的解释是这些雌性同时感染了不止一种血浆。事实上，无论何时研究，血浆体合并感染都是频繁发生的[1]、[15]、[36]、[39]、[46]、[47]、[48]。最后，一些阳性胎儿属于明显阴性的女性。这一发现可能构成假阴性结果。

5 . 结论
总的来说，我们的研究增进了我们对嗜血支原体的分布、遗传多样性和传播的理解。我们提出了强有力的证据，表明垂直传播不仅是可能的，而且是频繁的，这不仅与微生物学家和疾病生态学家相关，而且与大型和小型动物兽医从业者相关。我们还表明，鼩鼱是一种新基因型的宿主，值得进一步表征。