介绍
创伤弧菌是一种水生细菌，因摄入生的或未煮熟的海鲜或伤口暴露于海水而感染，导致胃肠炎、伤口感染和败血症。原发性败血症的死亡率高达50%以上（Hlady & Klontz, 1996 ; Oliver, 2005 ; Shapiro et al., 1998）。在海鲜摄入量较高的韩国，创伤弧菌在全国范围内稳步检出，2000年至2020年每年报告37至88例弧菌败血症病例，2011年至2020年死亡率为45.7%（曹和朴，2019；韩国发展局，2021 年；金等人，1987；1990年；Park 等人，2019）。创伤弧菌具有多种毒力因子 (VF)，如荚膜多糖 (CPS)、铁摄取、溶血素 ( vvhA )、蛋白酶 ( vvpE )、毒素重复序列 (RTX) 毒素、脂多糖、菌毛和鞭毛以及各种创伤弧菌致病性的调控因素已有报道，并且还进行了毒性激活机制鉴定等研究。琼斯和奥利弗，2009 年；李等人，2019）。

随着新一代测序技术的发展，许多对公共卫生具有重要意义的病原菌已经进行了基因组分析，就创伤弧菌而言，从2003年第一份基因组报告开始，已经对创伤弧菌进行了全基因组分析。识别基因组特征并进行了各种尝试，例如临床和环境基因型之间的比较（Chen等人，2003年； Morrison等人，2012年；Pan等人，2017年；Pang等人，2020年；Roig等人，2020年）。 , 2018）。然而，与 肠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等其他病原菌相比，创伤弧菌的基因组分析意义微不足道，甚至与同属弧菌相比，也不及副 溶血弧菌和霍乱弧菌 （NCBI，2023） 。

加德岛东海岸 由于洛东江的流入，为创伤弧菌的栖息地提供了良好的条件。另外，该区域内流经三个污水处理厂的最终处理水，有可能从土地上涌入污染物。我们前期的研究确定了加德岛东海岸海水中创伤弧菌的检出趋势、与致病性相关的遗传特征以及分离株的抗生素耐药性特征( Oh et al., 2020 , 2021）。本研究对加德岛海岸分离的致病性创伤弧菌进行全基因组测序分析，寻找VF的特征。

材料和方法
菌株和 DNA 提取
在之前的研究中，用于全基因组测序分析的创伤弧菌1908-10 于 2019 年 8 月从加德岛东海岸的海水中分离出来（Oh et al., 2020 , 2021）。该菌株具有毒力相关基因（vvhA、viuB和vcgC)、β-溶血活性和头孢西丁耐药性（最低抑菌浓度 32 μg/mL）。将菌株在添加有 1％ NaCl 的 Luria-Berani 肉汤（NEOGEN，Lancing，MI，USA）中于 35°C 培养 12 小时，并使用基因组 DNA 提取试剂盒（Bioneer，Daejeon，Korea）提取基因组 DNA。到制造商的程序。

全基因组测序和注释
根据 Illumina 和 PacBio 平台制造商的说明构建了两个不同的基因组 DNA 文库。使用 PacBio Sequel I 系统（Pacific Biosciences，Menlo Park，CA，USA）和 Illumina HiSeqX 10 测序仪（Illumina，San Diego，CA，USA）进行测序。CANU v1.7（Koren 等人，2017）和 Pilon v1.21（Walker 等人，2014）用于从头组装。基因组数据的完整性由 BU SCO v5.1.3 评估（Manni 等人，2021）。创伤弧菌的基因组序列1980-10 被保存在国家生物技术信息中心 (NCBI) GenBank 服务器中，染色体 I 和 II 的登录号为 CP118438 和 CP118439。使用 prokka v1.13 ( Seemann, 2014 )、eggnog 4.5 ( Huerta-Cepas et al., 2016 ) 和 PATRIC v.3.6.12 ( Wattam et al., 2017 ) 进行基因注释。编码序列的功能分类是通过位置特定迭代基本局部比对搜索工具（PSI-BLAST； https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）进行的）基于直系同源基因簇（COG）数据库（2014年更新版本；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/），并使用CIRCOS v.0.69-63（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ ）通过圆形图进行可视化://circos.ca）。

比较基因组分析
使用 MEGA11 v.11.08（ Tamura 等人，2021）针对弧菌属的 16S rRNA 序列进行比较系统发育分析，证实了创伤弧菌 1908-10的身份。通过 EDGAR 3.0 构建了平均核苷酸同一性 (ANI) 矩阵（Dieckmann 等人，2021）。本研究使用NCBI数据集对 创伤弧菌进行比较基因组分析（表1）。

毒力因子和多功能自动加工重复序列 (MARTX) 毒素的鉴定
使用毒力因子数据库 (VFDB) 2019（ Liu et al., 2019 ）分析创伤弧菌1908-10 基因组的 VF ，并使用 Adob​​e Photoshop 2023 在可视化圆形图上编辑它们的位置。 毒力基因存在/不存在通过从 NCBI 数据集中获取比较菌株信息并使用 prokka 重新注释来进行比较。我们使用 PROSITE ( Sigrist et al., 2012 ) 来查找多功能自动处理毒素重复序列 (MARTX) 毒素重复区域，并使用 MEGA 11 来识别重复序列的数量和位置，描述为罗伊格等人。（2011）。NCBI BLAST ( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) 用于执行和比较效应域搜索。

抗菌素耐药基因
使用 ResFinder ( Bortolaia et al., 2020 ) 和综合抗生素抗性数据库 (CARD) ( Alcock et al., 2020 ) 搜索创伤弧菌1908-10中的抗生素抗性基因。

结果与讨论
基因组属性和注释
全基因组分析结果显示，创伤弧菌1908-10由两个环状重叠群组成，未鉴定出任何质粒。基因组总长度为5,018,425 bp，GC含量为46.9%。重叠群 1 和 2 的长度分别为 3,273,700 bp 和 1,744,725 bp，对应的鸟嘌呤胞嘧啶 (GC) 含量分别为 46.7% 和 47.3%。总编码序列（CDS）为4,352个，其中contig 1中有2,890个，contig 2有1,462个。鉴定出119个tRNA和34个rRNA，主要分布在contig 1中（表2）。

根据COGs分析结果，创伤弧菌1908-10的基因组中与代谢相关的基因最多，占31.6%，与细胞处理和信号相关的基因占29.3%，与信息存储和处理相关的基因占16.2%。 %。原噬菌体、转座子等移动组相关基因为1.8%（图1）。具体来说，参与信号转导机制的基因最常见，占8.3%，其次是参与转录的基因，占7.1%，涉及氨基酸转运和代谢的基因，占6.8%。参与细胞壁/膜/包膜生物发生的基因为 5.7%。的 COG创伤弧菌Vv180806 和创伤弧菌VV2014DJH 已有报道，并且总体表现出相似的趋势。然而，在细胞骨架类别中，创伤弧菌Vv180806和创伤弧菌VV2014DJH没有相应的基因，而在创伤弧菌1908-10中鉴定出两个基因表现出差异（Pan等，2017；Pang等，2020） 。

系统发育树和平均核苷酸同一性 (ANI)
在使用 MEGA 11 软件比较 16s rRNA 的系统发育分析中，该菌株被鉴定为与其他弧菌不同的 创伤弧菌。和外群（图2A）。基于NCBI数据集使用EDGAR比较基因组相似度时，创伤弧菌1908-10与创伤弧菌FORC_077最相似，相似度约为99.41%，其次是创伤弧菌CMCP6和创伤弧菌FORC_053，相似度为99.02% 。创伤弧菌 FORC_017 其次为 98.92%。菌株 FORC_077、CMCP6 和 FORC_017 属于 C 型，根据基因型分类时常见于临床分离菌株。 V. vulnificus FORC_053 为 E 型。ANI 大于 98% 的前 15 个分离株中有 12 个（80%）为 C 型，因此V. vulnificus 1908-10 总体上与 C 型相似（图 2B）。95% ANI 对应于物种描述的推荐截止点（Goris 等，2007）。

毒力因子的鉴定
通过VFDB分析的结果，创伤弧菌1908-10具有甘露糖敏感血凝素IV型菌毛、CPS、鞭毛、金属蛋白酶、与铁吸收相关的弧菌素、血红素受体和周质结合ATP结合盒等VF基因（ ABC）蛋白质转运系统。它具有群体感应类中自诱导剂2的luxS基因，并且在分泌系统中，鉴定出EPS II型分泌系统。诸如vvhA、 tlh和 RTX 基因簇 ( rtxABCD )等毒素因子已被鉴定（表3）。与附着、运动和分泌系统相关的基因位于基因组的重叠群 1 中，而金属蛋白酶、铁吸收弧菌素、运输系统和毒素（如溶血素和 RTX）的基因在重叠群 2 中被鉴定。CPS 基因在两个重叠群中均被鉴定。重叠群1和重叠群2（图3）。据报道，CPS 在菌株之间具有生化和遗传多样性（Pettis & Mukerji，2020），并且发现创伤弧菌1908-10 具有cpsABCDFHIJ、hp1、 wbfU、wbfV/wcvB、wbfY、 wza、wzb和wzc（表 3）。

与NCBI数据集中的 29个创伤弧菌菌株相比，创伤弧菌1908-10具有fur、hlyU、luxS、ompU、pilA、pilF、rtxA、rtxC和vvhA基因。包括 1908-10 在内的所有 30 个菌株均具有共同的hlyU、ompU、pilF和 vvhA基因。另一方面， 在 96.7% 的菌株中，鉴定出Fur ， 90% 的菌株鉴定出 rtxA ， 83.3% 的菌株鉴定出luxS ， 76.7% 的菌株鉴定出 rtxC ， 60% 的菌株鉴定出pilA 。特别， pilA是IV型菌毛操纵子的一部分，在80％的C型菌株中发现，但在40％的E型菌株中发现，显示出基因型之间的差异(表3和图4 )。hlyU在转录水平调节rtxA1的表达，影响其细胞毒性和毒力( Liu et al., 2007 )。ompU是参与细菌粘附至宿主细胞的因子( Goo et al., 2006 )。 皮尔夫是IV型菌毛组装所需的蛋白质基因，其功能包括菌株的表面运动、集落和生物膜形成以及宿主细胞粘附( Alm & Mattick，1997；Hobbs & Mattick，1993 )。vvhA是创伤弧菌的溶血素/溶细胞素基因。Fur调节溶血素的产生， rtxA编码 RTX 毒素，rtxC 编码毒素激活剂（Lee 等，2013；Lin 等，1999）。 luxS是群体感应系统中的自诱导剂 2 合酶基因，据报道会影响vvhA和vvpE的转录 （Kim et al., 2003）。总体而言，创伤弧菌 1908-10 与 C 型菌株具有更相似的毒力特征，因为 80% 的 C 型菌株具有全部九个基因，而 40% 的 E 型菌株具有。

多功能自动处理重复毒素 (MARTX) 毒素
MARTX毒素是由多种革兰氏阴性细菌产生的大型单一多肽毒素。它们将大量效应蛋白从细菌传递到宿主细胞，以改变靶细胞的生理机能。与大多数霍乱弧菌分离株中 MARTX 毒素结构域结构的保守性相反 ，创伤弧菌 MARTX 毒素具有惊人的多样性（Kim，2018；Satchell，2015）。在弧菌的各种 MARTX 毒素中已识别出 10 个不同的效应结构域spp.，尽管任何一种毒素仅携带两到五个效应器（Satchell，2015）。创伤弧菌1908-10的MARTX毒素含有8个A型重复序列(GXXGXXXXXG)、25个B.1型重复序列(TXVGXGXX)、18个B2型重复序列(GGXGXDXXX)和7个C型重复序列(GGXGXDXXX)。NCBI BLAST显示 创伤弧菌1908-10的RtxA蛋白具有效应结构域，其顺序为肌动蛋白交联结构域(ACD)-C58_PaToxP-样结构域-α/β水解酶-C58_PaToxP-样结构域(图5 ) ，具有与创伤弧菌FORC_017 相同的结构域序列，创伤弧菌FORC_053 和创伤弧菌 CECT4999（NCBI，2023）。它们的效应结构域氨基酸序列与创伤弧菌FORC_017 100%相同，但与创伤弧菌FORC_053和创伤弧菌相比，某些氨基酸存在差异CECT4999。ACD 破坏细胞骨架并抑制宿主吞噬免疫细胞的吞噬活性。α/β 水解酶降低细胞内磷脂酰肌醇 3-磷酸水平并阻断自噬/内体途径。C58_PaToxP 样结构域，也称为毛毛虫软盘样结构域 (MCF)，与细胞凋亡相关 ( Kim, 2018 )。

V. vulnificus FORC_077基因组具有高ANI值，其效应结构域序列为膜定位结构域(MLD)-α/β水解酶-C58_PaToxP样结构域。创伤弧菌CMCP6和YJ016具有MLD-α/β水解酶-C58_PaToxP样结构域-toxin_MLD（毒素效应区膜定位结构域）-RtxA样结构域（各种多结构域毒素的C2-2样结构域）的结构域（NCBI，2023））。MARTX毒素特定效应域的生化机制和直接靶分子已得到表征，但其中一些仍需要进一步研究（Kim，2018）。同时，MARTX 毒素中效应结构域的多样性与基因型无关（数据未显示）。

抗菌素耐药基因
关于创伤弧菌1908-10 中的抗生素耐药性，在使用 ResFinder 的分析中没有发现获得性耐药基因。另一方面，CARD分析鉴定了该菌株中的抗生素抗性基因 crp、adeF、varG、 parE和ftsI。其中， ftsI是从与头孢菌素抗生素靶点改变相关的蛋白质变异模型中检测到的，但它是否是该菌株中头孢西丁耐药性的一个因素需要进一步研究（数据未显示）。

对从加德岛东海岸分离的创伤弧菌1908-10 进行的基因组分析表明，该菌株在 ANI 和 VF 方面与 C 基因型创伤弧菌相似 。MARTX 毒素序列也被鉴定。创伤弧菌不断威胁着食品卫生和公众健康。在韩国已报道的基因组菌株中，尚未有从河流海水中分离的报道。该菌株的基因组信息可作为根据分离环境了解该菌株基因组的基础数据，了解创伤弧菌的基因组特征和毒力。