介绍
在韩国，目前养殖两种本土对虾品种（中国明对虾 和日本对虾）和一种引进品种（凡纳滨对虾），大部分养殖产品来自南美白对虾（Jang 等人，2007 年，2009 年）。虾是韩国乃至全世界最重要的经济水产养殖品种之一；然而，韩国的许多养虾场已受到各种病原体的严重影响，包括白斑综合症病毒（WSSV；Jang 等人，2011a； 孟等人，2010）。2006 年，韩国 468 个养虾场中的 32.9% 受到 WSSV 爆发的打击，尽管此后产量已恢复（Jang 等，2009）。我们之前的研究证明了生物絮团对南美白对虾生长和免疫的积极影响（Kim et al., 2014）。通过提高虾的免疫活性来增强抗病性被认为是控制包括中华对虾在内的虾类疾病的有效策略（Huang et al., 2006））。本研究调查了一些选择性免疫相关基因，包括：原酚氧化酶1（proPO1）、原酚氧化酶激活酶（PPAE）、丝氨酸蛋白酶1（SP1）、伪装样丝氨酸蛋白酶（Mas）和ras相关核蛋白（Ran）mRNA表达。先天免疫反应是脊椎动物和无脊椎动物抵御病原体的第一道防线（Loker et al., 2004）。它是通过识别入侵生物体中而非宿主中的病原体相关分子模式而启动的（Janeway & Medzhitov, 2002），随后触发宿主的细胞和体液反应（Medzhitov & Janeway, 2000））。在无脊椎动物中，细胞反应包括包裹、吞噬作用和结节形成，而体液反应包括凝血、抗菌肽的合成和原酚氧化酶（proPO）系统的激活（Lee等，2004）。proPO 激活系统在防御病原体和寄生虫以及角质层硬化过程中发挥着重要作用。proPO 系统的激活由源自微生物细胞壁的诱导子触发，例如脂多糖、肽聚糖和 β-1, 3-gulcan（Loker 等人，2004 年；Medzhitov 和 Janeway，2000 年））。原酚氧化酶激活蛋白，也称为PPAE，是丝氨酸蛋白酶(SPs)级联的最后一个蛋白酶，其将夜蛾中的proPO转化为PO ( Jiang et al., 2003 )。SP 构成动物界最大的酶家族之一（Shi et al., 2008）。SP 通过特定蛋白质的蛋白水解裂解参与许多生理过程（Rawlings 和 Alan，1994）。它们通常分泌在细胞外、囊泡或颗粒位置，并具有细胞外功能（Gorman & Paskewitz, 2001）。已从各种虾中克隆了几种 SP：包括来自斑节对虾的黄头病毒的结合蛋白（Sriphaijit 等，2007 ）和含有来自南美白对虾血细胞的 SP 的伪剪辑结构域 （Jiménez-Vega 等，2005） 。伪装样蛋白是 SP 之一，并且该蛋白已被证明在粒细胞粘附、模式识别和调理作用中起作用（Huang 等，2000；Lee & Söderhäll，2001）。杜兰或将出演南美白对虾针对病毒和细菌感染的免疫力（Zhang et al., 2019）。

肯特等人。(2011)发现，在对提供不同大小微藻的南美白对虾幼体进行的培养试验中，细胞大小似乎是动物饲料消耗的关键因素。此外，金等人。(2015，2021 )报道，生物絮团的不同贡献与各物种第三颌足刚毛的形态特征密切相关。南美白对虾、中华对虾、日本对虾后期幼虫上颌足的观察研究表明，刚毛的类型和结构影响这些虾种的生物絮团摄食效率。特别是，中华对虾和日本对虾对生物絮凝物的反应低于南美白对虾。第三颌足是口器，由一个大的五节内足、一个长外足和一个外足组成，配备各种类型的刚毛（Alexander & Hindley，1985；Suthers，1984））。通过口器和肠道功能形态研究产生的信息可以帮助识别猎物的适当特征或开发有效的配方饲料，以更好地满足重要水产养殖生物每个生命阶段的营养需求。这种方法已成功用于各种甲壳类动物，例如拖鞋龙虾、大龙虾、蓝蟹和对虾（Alexander & Hindley, 1985； Cox 等人，2008；Johnston & Alexander, 1999；McConaugha, 2002））。本研究探讨了生物絮团对中华白蚁幼体和成虫生长、存活率和免疫反应的影响，以及生物絮团取食效率与第三颌足形态结构的关系。

材料和方法
动物
共10000尾中华对虾虾苗（平均体长18.3±2.86毫米，平均体重29.4±13.53毫克），购自当地虾苗孵化场。在研究开始之前，动物在经过沙子过滤、臭氧处理并加热至 25°C 的 1,000 L 水族箱中适应环境。总共 400 尾虾苗被饲养在 20 升塑料箱中。我们从室外池塘生产 中华白杨成虫（平均体长106.5±5.77毫米，平均体重15.2±3.05克）。我们在 200 升的水箱中饲养了 20 个人。所有实验均在每个水箱中使用树木复制品进行，每个水箱中装有一块空气石以提供通气。

实验设计
该研究是在韩国泰安国家水产科学研究所 (NIFS) 西海水产研究所 (WSFRI) 的室温 27°C 下进行的。三种处理均使用 20 L 和 200 L 饲养池（总悬浮固体 [TSS] 浓度的平均值）：生物絮凝剂 (480 mg/L)；混合（50% BF:50%海水，200 mg/L）；和海水（10 毫克/升）。每个水处理的饲养池以50%的比例从相应水库接收循环水。每个水箱底部中心均配有空气石，以保持颗粒轻柔悬浮并保持溶解氧 (DO) 高于 5 毫克/升。使用臭氧对用于对照无生物絮凝处理的海水进行灭菌。生物絮团水源每天由实验站的温室封闭集约化虾生产跑道池（14米宽×22米长×1.2米深）提供，零交换。混合水为50%海水和50%生物絮凝水。在实验过程中，混合水为50%海水和50%生物絮凝水。在实验过程中，混合水为50%海水和50%生物絮凝水。在实验过程中，在温室水道池中饲养南美白对虾约 5-10 克，放养密度为 400-450 只虾/m 2 。为虾苗提供幼虫饲料（45% 粗蛋白，CJ Feed & Care，韩国首尔），为成体提供配方虾饲料（40% 粗蛋白，CJ Feed & Care），每日三份（9:上午 00 点、下午 5:00、晚上 10:00）。每天使用 YSI 85 测量仪（YSI，黄泉，俄亥俄州，美国）测量水温、盐度、pH 和 DO。碱度、总氨氮（TA-N）、亚硝酸盐氮（NO 2 -N）、硝酸盐氮（NO 3-N) 和每三天在储水池中测量一次细菌总数 ( Kim et al., 2014 )。

细菌总数
通过4, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）染色法测定细菌总数（Hobbie等人，1977）。细菌数量按照Kirchman 等人的描述进行计算。（1982）。

生长性能和成活率
14 天后，使用秤（BP221S，Sartorius，Goettingen，德国）测量最终平均体重，精确到 0.1 mg，并在实验结束时计算每个水箱的存活率。

通过定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 分析免疫相关基因的表达（针对虾苗）
目的基因名称及GenBank登录号如表1所示。实验结束时，从每次处理中选择三只动物放入液氮中，然后储存在 –80°C 直至用于 RNA 提取。使用 RNeasy Mini Kit 提取总 RNA，然后使用 DNase I (Qiagen, Valencia, CA, USA) 纯化。采用 TaqMan 定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 技术测量 6 个免疫相关基因的 mRNA 表达。mRNA表达量测定参照 Kim等的方法。(2014)。通过比较阈值循环法(2 -ΔΔCT法，Livak&Schmittgen，2001 )确定相对表达。

酚氧化酶（PO）酶活性测定（成人）
将每只虾的心包腔中的血淋巴（0.5 mL）分别抽取到含有 1 mL 抗凝溶液的 3 mL 无菌注射器中（Bae 等人，2012）。从三个样品中收集的血淋巴汇集在管中，然后离心。血细胞沉淀用于 PO 酶活性测定。使用以下Jang 等人测定了血淋巴的 PO 活性。(2011b)方法：将稀释后的血淋巴匀浆，离心20min后收集血细胞裂解物上清液(HLS)。对于 PO 测量，将 50 µL HLS 置于 96 孔微孔板中，并与 50 µL 胰蛋白酶 (Sigma-Aldrich) 在 25°C 下孵育 10 分钟。然后添加 50 µL L-3, 4-二羟基苯丙氨酸（L-多巴；Sigma-Aldrich）。10 分钟后，加入 50 µL 匀浆缓冲液（HB、10 mM 二甲胂酸钠、10 mM CaCl 2、pH 7.0），并使用酶标仪（PowerWaveXS, BioTek, Winooski, VT, USA）在490 纳米。

第三颌足的观察与测量
本研究中检查的所有标本均处于后期幼体或成虫阶段。按照 Kim 等人的方法，对每个阶段的 5 个个体进行固定和检查。（2015）。使用 Kim 等人提出的方程测量和计算第三颌足内足的总内足长度、刚毛长度、刚毛距离、刚毛长度、刚毛距离和过滤面积。（2015）。集合特征的定义和分类一般遵循Garm（2004a，2004b）的定义和分类。

数据分析
结果表示为平均值±SD。三组以上之间的显着性差异通过单向方差分析后的逐步Newman-Keuls检验确定，并且在SPSS 13.0软件中使用95％置信度的t检验对两个参数结果进行分析。

结果
各处理库水质参数
池内水质参数见表2。水温保持在28.8℃，DO在5.5至5.7mg/L范围内，碱度保持在各处理之间，各参数均无显着差异。另一方面，其他因素包括盐度（29.9、31.7 psu）、pH（7.8、8.4）和无机氮（TA-N、NO 2 -N、NO 3 -N）浓度在处理之间显着差异。特别是，生物絮凝水的浊度高出 24 倍（海水和生物絮凝水分别为 7 毫克/升和 169.5 毫克/升），显示处理之间存在较大差异。

细菌总数
表 3显示了每个处理和阶段的细菌总数。生物絮团水中的细菌总数明显高于海水中的细菌总数（表3）。此外，海水和混合水在每个处理和阶段之间存在显着差异。但是，生物絮凝水显示虾苗和成虫的总细菌计数范围分别为 5.59 × 10 6至 1.28 × 10 7 个细胞/mL，以及 6.79 × 10 6至 1.72 × 10 7 个细胞/mL。两个阶段之间没有显着差异。

生长率和存活率
表4总结了研究终止当天每种处理的虾的平均最终体重和存活率。生物絮凝水和海水的虾苗最终体重分别为51.4和58.5 mg，两种处理之间没有显着差异。但混合水处理的最终仔鱼体重为90.5 mg，显着高于其他两种处理。成虫与后期幼体的变化趋势相似，混合水的最终体重为15克，显着高于其他处理。生物絮团水与混合水之间虾苗存活率无显着差异（32%~36%），但生物絮团水与海水之间存在显着差异（52%）。另一方面，三种治疗方法之间成人的存活率没有显着差异。

免疫相关基因表达（虾苗）
五个免疫相关基因的相对mRNA表达结果总结于图1中。生物絮团和混合水处理中的 PPAE、SP1 和 Mas 基因的表达水平显着低于海水。但在生物絮团和混合水中，proPO基因表达量显着高于海水。

酚氧化酶（PO）活性（成人）
测定了中华木犀成虫血细胞中的PO活性。PO 活性随着生物絮凝浓度的升高而线性增加。生物絮凝水中的PO活性显着高于海水（图2）。

后期幼体和成虫的第三颌骨结构
表 5总结了平均身体、第三颌总长度、刚毛长度、刚毛长度和阶段距离。后期幼虫和成虫之间存在显着差异。发现刚毛距离在各阶段之间没有显着差异。成虫的过滤面积明显大于虾苗。图3和表6分别提供了两个阶段中第三颌足（下文称为“颌足”）的内足节段的显微图和设置描述。

讨论
不同水处理间的某些水质参数存在显着差异。生物絮凝水的pH值低于海水的pH值。它与硝化细菌的活性和生物絮团产生CO 2有关。由于与这些容器中丰富的微生物群落相关的新陈代谢增加，生物絮团和混合水中的无机氮副产物的浓度显着较高。但是，所有水质参数都在其他研究人员报告的可接受的范围内，以实现中华木的最佳生存和生长（Chen et al., 1990；Hu & Lu, 1990））。雷等人。(2010)和Samocha 等人。(2007)建议南美白对虾的 TSS 浓度范围应为 460 至 500 mg/L 。但是，在本研究中，发现低于 15 mg/L TSS 浓度的浓度对于中国白杨来说是最佳的后期幼体（表 2 和表 4）。TSS浓度高于15 mg/L时，存活率显着降低，低至32%–36%，这可能是因为颗粒积累引起的TSS浓度增加会增加需氧量，导致养殖物种鳃结垢，抑制有益藻类的生长，并促进潜在有害微生物的大量繁殖（Brune 等人，2003 年；Hargreaves，2006 年；Liltved 和 Cripps，1999 年）。在这项研究中，不同治疗方法之间的存活率和特定生长率存在显着差异。这是免疫反应与能量消耗的关系，他们的治疗虾无法生长。泰勒等人。(2006)表示，由于非致病性免疫刺激，能量消耗增加了 7.5%。此外，混合水和生物絮凝水中的每个平均细菌总数范围为 9.53E+05 和 2.30E+06 mL –1 （表 3）。Biofloc 刺激虾的部分免疫系统（Kim 等人，2014）。螃蟹等人。(2010)说生物絮凝技术可以保护虾免受弧菌病的侵害。相比之下，本研究发现生物絮团和混合水中的免疫相关基因的表达低于海水。最后，过高浓度的 TSS 和大量细菌可能会给中华对虾后期幼体带来压力。它们不会对生长和免疫反应产生任何影响。我们之前的研究调查了生物絮团对南美白对虾后期幼体免疫活性和生长速度的影响。由于它们是在基于生物絮凝技术的系统中养殖的，虾显然在原位消耗了微生物絮凝物 （Ekasari 等人，2014 年）和（Crab 等人，2012）因此，总血细胞数量和 PO 活性的增加表明（消化的）生物絮团对虾的免疫力具有刺激作用。金等人。(2014)清楚地表明 proPO、PPAE1 和 SP1 基因的表达水平，这些基因调节 PO 激活系统。作者预计这项研究会得到类似的结果。但不同的物种带来不同的结果。在这项研究中，我们使用需要确认的其他不同年龄的虾苗。在图1中，PPAE和SP1基因在海水中显着较高，proPO基因在生物絮团和混合水中显着较高。PPAE、SP1和Mas等初始前体基因的活性出现在系列实验结束时，并且在生物絮团和混合水被认为是最后的 proPO 活性。另一方面，在成人中，生物絮团和混合水中的PO活性显着高出两到三倍，这与之前的其他研究一致（图2））。海水中虾苗的存活率和生长速度较高，但免疫相关基因活性并未达到更好的水平。但是，成虫在混合水和生物絮凝水中表现出高生长，并且具有高 PO 活性（免疫指标）（表 5）。这被认为与成虫的过滤面积比虾苗的过滤面积增加以及漂浮生物絮凝体的使用效率的增加有关。

已知南美白对虾过滤并取食漂浮生物絮团的颌足结构形成网状结构( Kent et al., 2011 )，而本研究中，虾苗期颌足结构形成的过滤面积较小。 ，和成虫形成类似于南美白对虾的宽网，导致过滤增加，因此，体内使用的生物絮凝物有助于刺激先天免疫（Kim et al., 2015）。

可以通过检查口器和肠道来评估特定物种的喂养策略。例如，下颌骨的坚固性和胃磨的复杂性的增加可能与甲壳类动物的肉食性食物选择相关（Kunze＆Anderson，1979）。十足目动物摄食偏好和能力的变化之前已被认为与消化不良和消化器官的结构和功能的变化有关（Cox & Johnston，2004；Nishida 等，1990）。

事实上，在幼虫发育过程中观察到了Lysmata amboinernsis的口器和肠道的一系列形态变化。取食附属物的潜在作用可以从它们的形状和刚毛类型推断出来。因此，在L. amboinensis幼虫的早期和晚期阶段，上颌骨可能主要用于呼吸。舟颌石上的长羽状刚毛在发育中的鳃上产生电流。尾端较短的羽状刚毛可以充当网，防止颗粒进入鳃室（Crain，1999；Factor，1978；Farmer，1974））。我们之前关于生物絮团的不同贡献的研究与这些物种第三颌足上刚毛的形态特征密切相关（Kim et al., 2015）。

结论
在这项研究中，随着中华对虾从幼体到成虫的发育，上颌刚毛和刚毛的作用似乎发生了变化 。在成年时期，第三颌足可能主要在口部区域起到滤食作用，这可以从它们在水柱中密集的刚毛中得到证明。这说明 中华白杨第三颌刚毛密集、刚毛较长带来了这些结果，而滤食面积的显着增加也与漂浮生物絮团的利用效率有关。

支持这一点的数据是，除了成年人的先天免疫活性外，生长和总产量显着高于海水。