背景
十字花科是经济上重要的开花植物科，也称为芥菜科或十字花科植物。芸苔属包括世界范围内种植的一些最重要的蔬菜和油籽作物，有二倍体和异源四倍体物种[ 1 ]。拟南芥是一种微小的二倍体十字花科植物，由于其生长迅速、自体受精和基因组尺寸小，已被用作研究植物分子、细胞和发育机制的模式物种[2 ]。

拟南芥_基因组序列和数十个重建的核型和染色体级基因组组装已将十字花科确立为研究植物基因组进化关键机制（包括驯化和作物多样化过程）的模型家族。所有细胞遗传学和基因组研究都需要来自不同器官和发育阶段的植物材料。然而，对于十字花科和其他植物科的某些物种来说，种子供应可能有限（例如，濒危或稀有物种），种子可能难以发芽，植物可能不容易在培养物中维持，并且需要重复收集植物材料在野外可能不切实际，甚至不可能。此外，植物身材矮小或其器官尺寸小可能会妨碍 DNA/RNA 分离和鉴定分生组织或减数分裂组织以进行染色体制备。为了克服这些障碍，可以建立所研究植物物种的体外培养物。这种培养物允许植物在无菌、受控的环境中生长，并从少量的原始植物材料产生大量植物。体外培养可用于保护稀有或濒危植物物种[3,4,5 ]和无病植物的生产。

毛状根培养是植物生物技术中广泛应用的植物组织培养。毛状根源自带有根诱导 ( Ri ) 质粒的农杆菌菌株感染宿主植物。感染后， Ri质粒的 T-DNA 片段被转移到植物细胞中并整合到基因组中。T-DNA 编码基因的表达，尤其是根致癌位点( rol ) 基因，使得毛状根的发育成为可能[ 6,7,8 ]]。除了使用毛状根培养物作为产生有价值的次生代谢物的工具外，转化的根还被用于基因功能分析、重组蛋白的生产，或使用成簇规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白进行基因组编辑 9 ( Cas9 ) 通过将Ri质粒与人工二元载体共转化[ 9,10,11 ]。毛状根技术也被提议用于保护稀有、濒危或特有物种[ 9 ]。

在开发了甘蓝型油菜毛状根转化的优化方案后[ 12 ]，我们测试了基于注射的毛状根诱导方法以及随后从不同十字花科植物物种的毛状根培养物中再生植物的方法。在这里，我们使用毛状根培养物来获得Asperuginoides axillaris的无菌植物，这是伊朗-图兰尼亚植物区（从土耳其到吉尔吉斯斯坦的地区，[ 13 ]）的一种稀有十字花科植物物种。这种稀有物种具有精致的叶子形态和叶腋中的小单花，其中含有很少的花粉母细胞，使得减数分裂染色体传播的有效制备变得困难。此外，我们还开发了酸枣的胚胎拯救方案绕过种子发育的成熟阶段并提高无菌植物的产量。我们还表明，花序初生茎适合在两种模型十字花科植物拟南芥和毛苦芥菜中诱导毛状根。

结果
毛状根诱导方案的跨属适用性探索
此前，我们成功优化了一种通过注射诱导毛状根并随后在甘蓝型油菜品种 DH12075 中进行芽再生的方案 [ 12 ]。为了评估该协议对十字花科其他属的适应性，我们开始对成熟的模式物种拟南芥进行调查。考虑到拟南芥具有明显的莲座状生长，与甘蓝型油菜的长下胚轴形成鲜明对比，我们将注射直接注射到花序初生茎上。使用含有强毒力 Ri 的农杆菌悬浮液将一个月大的拟南芥幼苗注射到花序茎的基部质粒。值得注意的是，转化效率（量化为接种部位长出毛状根的植物与注射植物总数的比率）平均为 94%。该计算基于注射后一个月收集的数据，该数据来自三个独立的转化实验，每个实验有 10 至 12 株植物（图 1 A）。当我们将拟南芥植物的树龄延长至六周时，转化效率略有下降至 75 ± 8%。小心地切下拟南芥的毛状根，并在补充有 B5 维生素 (MS + B5) 的固体 Murashige 和 Skoog 培养基上的培养皿中进行培养。

图。1
图1
拟南芥和毛毛菜毛状根的诱导和再生。毛状根从拟南芥 A和C. hirsuta D的接种部位长出。拟南芥 B和粗毛C. hirsuta E再生培养基上的芽诱导。C，拟南芥再生体在芽伸长培养基上的早期开花。F，土壤中C. hirsuta的再生体。比例尺代表 1 厘米

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为了启动芽的形成，我们将十个独立的毛根系转移到再生培养基（RGM）中。RGM 含有浓度为 8 mg/L 的生长素 1-萘乙酸 (NAA) 和浓度为 8 mg/L 的细胞分裂素 6-苄氨基嘌呤 (BAP，5 mg/L)。在所有十个品系中均观察到愈伤组织发育，并且在培养的十个品系中的九个中形成芽（表明强大的再生效率为90%）。该再生效率与用欧洲油菜DH12075实现的再生效率相似（表 1）。经过18至21天的培养期后，第一批芽的出现很明显（图 1 ）B）。随后，将这些芽切下并重新放置到芽伸长培养基 (SEM) 中，在那里培养 2 至 3 周，以促进进一步生长和伸长。此阶段之后，将芽转移到根诱导培养基（RIM）中。然后将所得生根植物移植到土壤中以进一步发育。毛状根再生体表现出独特的表型特征，例如矮化的身材和致密的根系。这些再生体在扫描电镜上就开始开花，甚至在根出现之前。这种向开花的转变发生在培养后仅 40 天内（图 1 C）。这种形态变化与毛状根衍生植物中有据可查的观察结果一致，这种现象被认为是毛状根或Ri表型[ 6 ]。

表1 使用基于注射的方法在不同十字花科物种中诱导毛状根
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为了证明花序初生茎作为十字花科内通过注射诱导毛状根的宝贵基质的广泛适用性，我们对另一种具有莲座状生长习性的物种进行了实验，Cadamine hirsuta。将一个月大的C. hirsuta幼苗在花序主茎基部进行注射。转化后大约一个月，我们观察到平均 93% 的处理植物出现了毛状根（图 1D）。随后对C. hirsuta毛状根系的分析显示再生效率为 30%（表 1、图 1 ）E、F）。这些结果强调了花序茎作为两个模型物种中毛状根诱导的高效平台的适用性。此外，使用生长素 NAA 和细胞分裂素 BAP 进行芽诱导的方案被证明在这两个物种中均有效。

酸枣中的毛状根和再生体
酸枣的种子是在伊朗塞姆南省采集的。为了建立酸枣植物的无菌培养物，对种子进行乙醇处理的灭菌过程。随后在由含有0.25mg/mL赤霉酸(GA 3 )的MS培养基组成的发芽培养基1(GM1)上进行培养导致发芽效率显着降低(3.3％，附加文件1：表S1)。为了提高发芽率，用乙醇对种子进行灭菌并用次氯酸钠溶液处理。处理过的种子在改良的 MS 培养基上培养，补充有 B5 维生素、0.4% 活性炭和 0.1 mg/mL GA 3（发芽培养基 2 或 GM2）。这种改良方法使发芽率略有提高，达到 4.6%。值得注意的是，用氯气对种子进行灭菌的效率很低，因为它会导致微生物污染，使所有种子都无法存活。

对在无菌条件下培养的三株植物注射农杆菌悬浮液。转化两个月后，从注射的植物之一中长出毛状根（转化效率33%，表 1、图 2）。建立了14个独立的毛状根系（图 2 ），并通过对来自Ri质粒的TL和TR插入南酸枣基因组的基因分型来监测成功转化。提取的 DNA 中不存在virC位点，证实不存在农杆菌污染（附加文件1：图 S1）。

图2
图2
酸枣毛状根的诱导和再生过程。通过注射携带Ri质粒的农杆菌来诱导毛状根。在培养皿上培养选定的毛状根系。通过在再生培养基上培养毛状根来引发芽形成。随后将芽转移至芽伸长培养基(SEM)和根诱导培养基(RIM)。将生根植物转移到土壤中并产生T1毛状根衍生种子。或者，RIM 上的再生体用携带Ri的农杆菌进行另一次基于注射的转化。质粒和表达核靶向荧光蛋白 VENUS (VENUS-NLS) 并携带卡那霉素抗性盒的二元载体。在卡那霉素上选择新出现的毛状根系并筛选荧光信号

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在 RGM 上培养酸枣毛状根系以诱导发芽。一个月内，所有 14 个品系均产生黄色或绿色愈伤组织。四个品系（29%）在培养 2-3 个月后出现芽（图 2）。毛状根衍生的再生体（T0植物）在形态上与野生型植物不同，具有缩短的节间和较小的叶子（图 2，附加文件1：图S2）。再生植物比野生型植物开花更早。事实上，在转移到土壤之前，RIM 上就检测到了花蕾。Ri的 T-DNA 区域在所有四个系的再生体的基因组中均检测到质粒（TL 和 TR）（测试了每个系 3 至 5 个再生体的叶子）。四个品系之一没有结出能存活的种子，因为发育的硅粒是空的（附加文件1：表S2）。

酸枣再生体的再转化
我们测试了再转化的可能性，即在 RIM 上生长的再生酸枣小植株中诱导毛状根。将携带Ri质粒和表达靶向细胞核的荧光蛋白 VENUS 的双元载体的农杆菌菌株悬浮液注射到再生剂中。1-2个月内，T0再生体的茎中出现毛状根（图 2）。再转化效率为29±4%，与酸枣野生型植物的转化效率相似。在含有选择剂（卡那霉素，15 mg/L）的培养基上生长的毛状根表现出荧光（图 2 ））。当种子无菌或无活力时，再转化方法非常重要。

酸枣T1 种子的萌发
直接播种在土壤中或用乙醇和次氯酸钠溶液表面消毒并无菌播种的毛状根来源的T1种子的发芽率不超过5%（附加文件1：表S1）。因此，测试了不同的处理方法来打破种子休眠。

对拟南芥Cvi的发芽研究表明，用冷处理或硝酸盐处理然后进行光照可以打破种子休眠。种子对此类处理的敏感性取决于收获后干燥和成熟种子的储存期[ 14 ]。因此，所有测试的种子在成熟/收获后干燥储存至少六个月。由于 T1 种子中没有观察到内源性污染，因此我们使用氯气灭菌程序。此外，在灭菌前手动除去干燥的二氧化硅。为了克服种子休眠，我们测试了在黑暗中 4 °C 下冷分层对固体 GM3（0.4% 木炭、0.5 mg/L GA 3和 0.1% 植物保存混合物）的影响以及种子在高浓度溶液中的吸胀作用。 GA浓度滤纸上的3 (1 mg/mL) 和 KNO 3 (0.5%)（附加文件1：表 S1）。处理后，将种子在 GM3 上于 21°C、16 小时光照/8 小时黑暗光周期下培养。在 GA 3  + KNO 3溶液中吸胀 24 小时并结合冷分层两周，将发芽率提高至 35%（附加文件1：表 S1）。

未成熟酸枣T1 种子的胚胎拯救
我们在酸枣种子中测试了胚胎拯救（ER）技术，以绕过种子休眠。由于甘蓝型油菜ER 的有效胚胎阶段是鱼雷阶段 [ 12 ]，我们首先鉴定了不同成熟年龄种子的胚胎阶段。我们根据种子的大小和颜色定义了七个种子阶段：阶段 1 – 直径 2.8 ± 0.2 毫米；阶段 1 – 直径 2.8 ± 0.2 毫米。阶段 2 – 3.9 ± 0.2 毫米；阶段 3 – 4.4 ± 0.2 毫米；第 4 级 – 5.1 ± 0.2 毫米；5 级 – 5.6 ± 0.2 毫米；6 级 – 6.5 ± 0.2 毫米；阶段 7 – 5.6 ± 0.2 毫米。1-5 阶段的种子是绿色的，而 6 和 7 阶段的种子是黄色的。第 2 阶段种子含有球形胚（图 3 B1、B2）。在第 5 阶段种子中检测到鱼雷胚（图 3 ）C)，而在第6阶段种子中观察到成熟胚胎(图 3D )。为了确认鱼雷胚对南酸枣ER实验的适用性，在无菌条件下打开所有阶段的种子种皮，并在胚拯救培养基4（ERM4，表2）上培养种子 。事实上，第 4-5 阶段的种子发芽了，而较年轻和较老的种子则没有发芽（图 3 E）。我们成功地在源自所有三种能够产生种子的毛状根系的植物种子中诱导了 ER（附加文件1：表 S2）。此外，先前胚胎拯救的T1植物的T2种子中也诱导了ER。

图3
图3
腋毛状根衍生种子中的胚胎拯救。A，根据大小和成熟程度，种子的七个发育阶段。B1，第2阶段的种子含有球形胚。B2，B1 的更高放大倍数，放大胚胎。C，在第 5 阶段检测到鱼雷胚。D，在第 6 阶段的种子中观察到成熟胚。E，第 4-5 阶段的种子在胚胎救援培养基上发芽，而早期或较老阶段的种子不发芽。比例尺代表 1 cm ( A , E )、1 mm ( B1 , C , D ) 和 100 µm ( B2）

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表2酸枣毛状根T1种子的胚拯救
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我们还测试了 ER 对在含有赤霉酸 (GA 3 )、生长素（吲哚-3-乙酸，IAA）和细胞分裂素 (BAP)不同组合的培养基上萌发的种子（4-5 阶段）的功效（ERM1- 4、表 2）。含有所有三种激素的 ERM4 培养基观察到最高的发芽率 (66 ± 4%)。将发芽的种子以等比例转移到SEM、RIM或不含激素的培养基中。观察到转移至 SEM 的种子存活率最高（转移后两个月计算，表 2）。所有培养基中存活的小植株均形成根，随后转移到土壤中。

因此，南枣ER 的最佳方案涉及使用在含有 0.5 mg/L GA 3、 1 mg/ L BAP、1 mg/L IAA和0.4%木炭，发芽后转移到含有0.5 mg/L BAP和0.03 mg/L GA 3的SEM的培养箱中。

酸枣T1 植物
筛选转移到土壤中的T1植物（分别来自2系、5系和7系的8、6和7株植物）的基因组中Ri T-DNA（TL和TR区）的存在。在从源自7系的所有T1植物的叶子提取的基因组DNA中检测到TL和TR区。源自2系和5系的所有T1植物都含有TL区，但一些植物（2系的1/8和2/6）和5）不携带TR区域（附加文件1：表S2）。图 4显示了 T0 再生体和 T1 植物的比较。T1 植物失去了 T0 再生植物的早期开花特征。它们在转移到土壤中几周后开花，并且与野生型表型相似（图 4 ）C）。毛状根表型的丧失可能是由 T-DNA 基因沉默引起的 [ 6 ]，毛状根中发根农杆菌T-DNA 衍生的小 RNA的检测支持了这一点[ 15 ]。

图4
图4
酸枣毛状根再生体与T1植物的比较。A，代表性再生剂（左侧的 T0 植物）与 T1 植物（右侧）进行比较。B，T0 再生剂中正在发育的种子的细节。在相同高度的 T1 植物中未检测到花或种子。C，野生型酸枣植物。比例尺代表 2 厘米

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酸枣毛状根和再生体染色体稳定性的细胞遗传学评价
为了探索毛状根和再生体对于细胞遗传学研究的适用性并评估它们相对于野生型的染色体稳定性，对DAPI染色的有丝分裂染色体进行了分析（图 5）。在野生型a. axillaris植物中，计数了 32 条染色体 (2n = 32)。核型表现出明显的双峰分布，包括 14 条大染色体和 18 条小染色体（图 5 A）。毛状根（第7行，图 5B）和再生体（图 5C）具有相同的染色体数目和双峰核型。这凸显了毛状根系及其再生植物在细胞遗传学研究中的潜在用途。

图5
图5
从根尖制备的酸枣有丝分裂染色体。A，从种子培育的植物（野生型）。B、毛状根。C、T0再生剂。核型 (2n = 32) 显示双峰分布，其特征是存在 14 条大染色体（由蓝色箭头表示）和 18 条小染色体（由黄色箭头表示）。染色体用 DAPI 复染。比例尺表示 10 µm

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讨论
毛状根转化系统代表了植物生物技术的多功能工具，并且可以为顽抗根癌农杆菌转化的物种提供选择[ 9 , 16]。获得毛状根培养物的两种主要方法是浸泡接种和注射接种。浸没法涉及将外植体浸入细菌悬浮液中。感染时间和共培养持续时间是所研究植物物种需要测试的关键因素。注射法需要使用无菌注射器将细菌悬浮液直接注射到植物组织中。经过不同的培养期后，根据所研究的植物种类，毛状根会在受伤部位出现：外植体的切割部位（在基于浸泡的方法的情况下）或注射部位。一般来说，两种方法都能有效诱导毛状根，尽管在某些物种中，注射法的转化效率高于浸渍外植体后的转化效率[ 17，18 ]。

先前通过将下胚轴或叶外植体浸入细菌悬浮液中在拟南芥中诱导毛状根[ 19,20,21,22 ] 。通过在愈伤组织诱导培养基上预培养叶外植体四天并与农杆菌悬浮液共培养五分钟，然后在标准培养基上培养，获得了最高的根诱导率（95％）[22 ]。还通过将农杆菌悬浮液注射到莲座丛的中部来诱导毛状根[ 23 ]。然而，转化效率并未被报道。在我们的研究中，我们测试了拟南芥花序初生茎的适用性对于基于注入的方法。1个月大的幼苗转化效率达到95%，与叶外植体实验相当[ 22 ]，但不需要准备外植体并将其转移到不同的培养基中。花序茎对于注射转化的适用性在C. hirsuta中得到了验证。

植物组织（包括毛状根）的再生是植物生物技术的一个重要瓶颈。这是一个高度可变的过程，取决于物种、生态型或栽培品种。因此，优化每种植物材料的再生条件是必要的步骤。在我们的研究中，我们开发了一种针对属于该科不同超级部落（谱系）的几种十字花科物种的毛状根的再生方案（拟南芥和毛状十字花属属于骆驼科，甘蓝型油菜属于十字花科，而十字花科油菜属于十字花科。酸枣属于拟南芥科；[ 24]）。我们建议该协议也适用于在其他十字花科物种中建立根培养。如果在其他物种或品种中观察到很少或没有再生，则需要调整方案。例如，不同的细胞分裂素/生长素比例（5 mg/L BAP 和 5 mg/L NAA）成功地引发了不同甘蓝品种的芽形成[ 25 , 26 ]。或者，可以使用另一种类型的细胞分裂素，如使用噻苯隆代替 BAP 来再生油菜毛状根时所显示的那样[ 26 ]。较高的培养温度也被证明可以加速拟南芥激素诱导的愈伤组织形成和芽再生[ 27]。因此，毛状根在再生过程中可以在较高的温度下培养。

使用A. axillaris T0再生体，我们测试了再转化的可能性，即转化转基因植物以插入新性状。将来自第一次转化的含有Ri衍生的T-DNA的再生植物用携带Ri质粒和编码VENUS荧光蛋白的双元载体的农杆菌菌株重新转化。通过检测 T0 再生体诱导的毛状根细胞核中的荧光信号证明了成功的再转化。先前的研究已使用毛状根通过检测与感兴趣的蛋白质融合的荧光蛋白来进行亚细胞蛋白质定位（例如，[ 28 , 29]]）。因此，这种双重转化方案可用于检测难以产生可行种子的再生植物中的蛋白质定位。

种子发芽率低是许多特有或稀有物种研究的限制因素。施用 KNO 3和 GA 3以及暴露于低温增强了酸枣种子休眠的释放，这与其他物种的研究一致（例如，[ 14,30,31 ]）。或者，可以通过胚胎拯救来克服种子休眠。在这项技术中，未成熟的植物胚胎被切除并在特殊培养基上培养。ER已被用于拯救无法存活的胚胎、避免二次休眠并加速跨代过渡。使用胚胎拯救技术开发芸苔属种间杂种的研究物种表明，这种方法的有效性取决于雌性基因型、胚胎发育阶段和培养基成分（例如，[ 32、33、34 ] ）。因此，我们使用含有激素 IAA、BAP 和 GA 3的培养基，针对未成熟的酸枣种子开发了一种有效的胚胎拯救方案。类似于B. 油菜cv。DH12075 [ 12 ]，鱼雷发育阶段的胚胎似乎最适合南酸枣的 ER 。

据报道，毛状根培养物在核学上是稳定的（例如，[ 35,36,37,38 ] ），因此可以作为细胞遗传学分析的根中期染色体的连续来源。毛状根已被用来在具有重建核型的豌豆系中制备完整的染色体[ 39 ]。由于活种子数量有限以及与有性繁殖相关的问题，此类品系通常难以繁殖。在酸枣中，我们评估了毛状根和毛状根衍生的再生剂用于细胞遗传学研究的适用性。与野生型植物相比，我们没有发现明显的染色体异常。因此，毛状根培养物和再生体可以作为稀有物种、难以发芽物种以及分生组织和产孢细胞数量有限的物种有丝分裂和减数分裂染色体的宝贵来源。

结论
近年来，体外培养在保护特有、稀有和濒危植物物种方面引起了相当大的关注（综述见[ 40 , 41 ]）。这种兴趣源于生物技术的固有能力，能够从有限数量的亲本组织快速产生新植物，从而避免从自然栖息地重复收集植物材料的需要。在我们的研究中，我们成功地在体外培养了毛状根，并从稀有十字花科植物Asperuginoides axillaris中产生了 T0 再生体。事实证明，来自毛状根和再生体的植物材料适合细胞遗传学研究。毛状根的固有优势，即它们易于在无激素培养基上繁殖，也使其成为各种分子生物学和细胞遗传学分析的宝贵且可持续的植物材料来源。