介绍

可以考虑多种因素来成功建立玻璃化程序并获得高 PVSPR。对于母马/母马来说，准确确定排卵至关重要，因为它可以恢复具有预期大小的胚胎。如果很小，则不需要胶囊穿孔（Panzani 等人，2012 a；Fanelli 等人，2020）。然而，如果较大，可能会优先在玻璃化步骤之前刺穿（Hochi 等人，1995 年；Eldridge-Panuska 等人，2005 年；Scherzer 等人，2011 年；Wilsher 等人，2019 年；Fanelli 等人，2020 年）；威尔舍等人，2021）。一般来说，选择尝试胚胎恢复的排卵后日期会影响收集到的胚胎的百分比。马胚胎的成功恢复受到多种因素的影响：年龄、每个捐赠者的周期数（Dorado et al., 2020）、使用的精液是新鲜的、冷藏的还是冷冻的（Meadows et al., 2000）、相对于排卵的授精时间（Eldridge-Panuska 等，2005）、一年中的季节；在母马中，但在珍妮中则不然（Peréz-Marín et al., 2017；Dorado et al., 2020），每个周期的排卵次数；单个或多个（Squires 等，1985），马或驴的生育能力（Peréz-Marín 等，2017；Dorado 等人，2020）和其他因素（ Allen 等人，1985）。在大多数情况下，平均胚胎恢复率高于 50%；无论是否在第六、第七、第八或第九 PO 天尝试收集（ Allen 等人，1985； Freeman 等人，1991； Hinrichs，1990； Eldridge-Panuska 等人，2005）。

然而，马胚胎的可视化和操作在第七天后变得更容易；因为与在产后第六天或第六天半收集的胚胎相比，它的尺寸更大。一些研究比较了经过不同类型的收集（ Oguri & Tsutsumi，1974）、清洗、保存（Oguri & Tsutsumi，1974）和转移液体溶液（Carnavale 等，2000；Eldridge-Panuska）的胚胎获得的妊娠率。等人，2005）。在比较不同的玻璃化冷冻解决方案以及使用每种解决方案所达到的妊娠率时，信息也很少。可选择多种选项作为胚胎载体：开拉吸管或 OPS ( Guignot et al., 2015）；细直径微量移液器（Choi 等人，2011）；Cryolock（Díaz 等人，2016；Ferris 等人，2016；Wilsher 等人，2019）；半吸管（Sanchez 等人，2017）、Fibreplugsolid 表面（Pérez-Marín 等人，2018）和冷冻顶部（Bottrel 等人，2019；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2020b）。即使在大量溶液（即 30 uL）中玻璃化，小型马胚胎也不需要直接接触液氮即可在冷冻保存过程中存活（Eldridge-Panuska 等人，2005 年；Fanelli 等人，2020 年））。另一方面，如果马胚胎较大，除了囊穿孔（Wilsher等人，2021）和囊胚液提取（Sanchez等人，2017；Herrera，2021）之外，它们将优先需要与液氮直接接触（Díaz 等人，2016 年；Sanchez 等人，2017 年；Herrera，2021 年）。似乎对于大型马胚胎（除了囊穿孔和囊腔液提取），当比较开放式和封闭式玻璃化胚胎载体时，允许在玻璃化步骤期间与液氮直接和间接接触；开放系统促进更高的 TTI，从而增强 PVSPR（Sanchez 等人，2017）。此外，在玻璃化步骤中用于容纳大胚胎的液体体积可能优先较小（通常 < 1 uL），以增加 TTI（Díaz 等人，2016；Sanchez 等人，2017）。另一个可能影响胚胎存活的因素是用于在囊膜上穿孔的微量移液器的直径。然而，针对这一主题的数据有限且非结论性的（Choi 等人，2010；Díaz 等人，2016；Ferris 等人，2016；Sanchez 等人，2017；Wilsher 等人，2021））。最后，可以仔细分析选择用于将胚胎移植到母马或珍妮子宫中的液体溶液。生殖冷冻生物学领域的进一步研究已获得批准，其中马胚胎是一种易于使用的实验模型；因为它们可以很容易地收集、操作并转移回母马、母马、骡子和/或小马的子宫中。本研究的目的是为与胚胎玻璃化相关的相关因素提供简单的指导，包括：在马和驴中，建立信息有限或缺乏的领域，并促进马生殖冷冻生物学领域未来研究的想法。

相对于排卵日，母马和母马恢复胚胎的百分比

考虑到尝试恢复的日期，母马恢复的胚胎百分比存在很大差异。例如; 在 PO 的第六、第七或第八天，报告的恢复率从零（Battut 等人，1997 年）、62%（Camillo 等人，2003 年）到 100%（Hochi 等人，1995 年）不等。分别。尽管如此，大多数研究表明回收率接近或高于百分之五十（Allen 等人，1985 年；Iuliano 等人，1985 年；Squires 等人，1985 年；Hinrichs，1990 年；Freeman 等人，1991 年；Hochi等人，1995 年；麦克莱伦等人，2002 年; 埃尔德里奇·帕努斯卡等人，2005；穆萨等人，2005；德尔巴拉和阿卜杜，2017；席尔瓦等人，2018；罗瑟等人，2020）。当尽早尝试胚胎收集（产后第六天）时，恢复率范围从零（Battut 等人，1997 年）到 82%（Hochi 等人，1995 年））。先前报告之间的巨大差异可能部分归因于专业人员的专业知识，因为在发育的早期阶段（第 6 天）胚胎尺寸通常≤ 300 µmØ，胚胎搜索和观察更加困难。尽管由于每项研究中使用的方法和动物数量的差异，不可能对平均恢复率进行直接比较；他们表明，早期执行（PO 第六天与以后几天相比）的成功收集率往往较低。有趣的是，通过适应收集技术的修改可以提高胚胎回收率；例如，让恢复介质或冲洗溶液在子宫内多停留几分钟（Hinrichs，1990；阿尔瓦伦加等人，1993）。

除了显示出高度的变异外，与珍妮每日胚胎恢复率相关的数据也很有限（Allen 等人，1985 年；Vendramini 等人，1997 年；Camillo 等人，2010 年；Peña-Alfaro 等人，2010 年）。 ，2014 年；Bottrel 等人，2017 年； Pérez-Marín 等人，2017 年；Ottmann 等人，2018 年；Dorado 等人，2020 年）。在 PO 的第六天，成功采集胚胎的百分比范围为 43（Vendramini 等人，1997）到 75（Dorado 等人，2020）。在 PO 的第七天，它从十二点开始（Camillo 等人，2010）到百分之八十（ Dorado 等人，2020）。或者，如果在 PO 第八天到第九天进行尝试，成功的胚胎采集率通常高于 50%（ Camillo 等人，2010 年；（ Peña-Alfaro 等人，2014 年； Dorado 等人，2020 年）。如前所述，马科动物恢复胚胎的百分比可归因于多种因素，例如每个供体的周期数（ Dorado 等人，2020）、精液类型（ Meadows 等人，2000）、授精和排卵时间（埃尔德里奇-帕努斯卡等人，2005）、母马的季节性（Peréz-Marín 等人，2017 年；Dorado 等人，2020 年）、每个周期的排卵次数（Squires 等人，1985 年）、雄性的生育力（Peréz-Marín 等人， 2020 年） 2017；Dorado 等人，2020）和其他人（Allen 等人，1985）。

恢复天数与胚胎大小的关系

在母马中，胚胎大小很大程度上受到为实现其恢复而选择的 PO 日的影响（Betteridge 等人，1982 年； Hochi 等人，1995 年；Eldridge-Panuska 等人，2005 年；Choi 等人，2010 年；McCue 等人）等人，2010；Díaz 等人，2016；Guignot 等人，2016；Wilsher 等人，2019）。在大多数情况下，如果在产后第六天或第六天半期间收集胚胎，则其通常≤ 300 µmØ（Iuliano 等人，1985；Freeman 等人，1991；Eldridge-Panuska 等人， 2005；哈德森等人，2006; 崔等人，2010；吉尼奥特等人，2015；佩雷斯-马林等人，2017；佩雷斯-马林等人，2018；席尔瓦等人，2018）。相反，当胚胎恢复在第七天、第七天半时完成时；八、八个半；或九，通常>300 µmØ（Hochi等人，1995；McCue等人，2010；Díaz等人，2016；Pérez-Marín等人，2017；Wilsher等人，2019）。

描述胚胎大小与收集日期之间关系的珍妮研究很少。然而，与母马相反，在产后第七天或第七天半期间收集的驴胚胎的比例似乎仍然< 300 µmØ（Vendramini 等人，1997 年；Panzani 等人，2012b；Bottrel 等人，2012 年）。 ，2017；Pérez-Marín 等人，2017；Pérez-Marín 等人，2018；Bottrel 等人，2019； Bottrel 等人，2020b；Dorado 等人，2020；Fanelli 等人，2020）。当尝试从产后第八天或之后收集驴胚胎时，其直径通常接近或大于 500 µmØ（Panzani 等人，2012a；Pérez-Marín 等人，2017；Bottrel 等人， 2019；Dorado 等人，2020）。

包括或不包括玻璃化冷冻前胚胎囊 (EC) 穿刺的方案

如果马胚胎尺寸≤300 µmØ，则在玻璃化过程之前不需要将胶囊刺破，并且其PVSPR通常高于百分之三十（Eldridge-Panuska等人，2005年；Hudson等人，2006年；Choi等人）等人，2011 年；由Urías-Castro 和 Boeta审查，2020 年）。大多数关于马胚胎玻璃化冷冻的报告表明，当马胚胎直径为 ˃300 µmØ 时，它不仅可能被刺穿以穿孔其 EC，而且其囊腔液也可能被抽出以优化 PVSPR（Choi 等，2011；Guignot ）等人，2015 年；Díaz 等人，2016 年；Ferris 等人，2016 年；S ánchez 等人，2017 年；威尔舍等人，2019；由Urías-Castro 和 Boeta审核）。然而，当考虑到胚胎大小的进一步划分时；据观察，马胚胎的玻璃化冷冻尺寸范围为 300 至 550 µmØ（≤ 550 µmØ）；在不抽吸囊腔液的情况下对胚胎囊进行穿孔可导致妊娠率高于 75%（ Wilsher 等人，2021）。

报道驴胚胎 PVSPR 的研究很少。现有工作表明，玻璃化冷冻 ≤300 µmØ 的驴胚胎的妊娠率范围从妊娠第十四天 (D14) 时的 36% 到第 25 天 (D25) 时的 27%；这表明如果胚胎大小≤300 µmØ，则 EC 穿刺和囊腔液提取可能不是必需的（Panzani 等人，2012 b）。此外，描述驴内皮细胞穿刺及其囊胚液体抽吸的研究项目有限（Ottmann 等人，2018）。大型驴胚胎 ˃300 µmØ 是否需要 EC 穿刺和囊腔液提取以增加其 PVSPR 仅间接测试，因为 EC 穿刺和囊腔提取导致体外存活率很高（Ottmann 等人，2018；由Urías审阅） -卡斯特罗和博埃塔，2020）。

宫内输注液体溶液以收集马胚胎

一些描述马科动物胚胎收集的首批研究报告了使用含有 2% 明胶的生理盐水溶液（Oguri & Tsutsumi，1974）。如今，乳酸林格氏菌的使用（Alvarenga 等，1993；Barfield 等，2008；Sánchez 等，2017；Wilsher 等，2019）；已经描述了哪种成分接近哈特曼溶液（Guignot et al., 2015）。用于恢复马胚胎的其他培养基包括 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 DPBS/PBS（Alvarenga 等人，1993；Landim E Alvarenga 等人，1993））。Hinrichs (1990 )报道了Dulbecco改良磷酸盐缓冲盐水(DMPBS)与胎牛血清(FCS)的结合。DMPBS 可以补充热灭活的阉牛血清 ( McKinnon & Squires, 1988 )；或牛血清白蛋白 (BSA) 加抗生素（Battut 等，1997）。DMPBS 与 1% 的 FCS 或小牛血清以及葡萄糖和丙酮酸混合也被描述为胚胎恢复培养基（Carnavale 等人，2000）。商业 Emcare® 完全冲洗溶液（Eldridge-Panuska 等人，2005 年）和 Vigro® 冲洗介质（Hudson 等人，2006 年）是报道作为胚胎恢复介质的其他替代品。

在驴中，乳酸林格氏溶液最常被报道为胚胎恢复培养基（Panzani 等人，2012a；Peña-Alfaro 等人，2014；Panzani 等人，2016；Pérez-Marín 等人，2018；Bottrel 等人，2019；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2020b）。另一种报道的替代方案是 DPBS（Camillo 等人，2010）。

用于保存回收的马胚胎的液体溶液

就成分而言，最简单的胚胎保存介质是含有 2% 明胶的盐水介质，或含有马血清（1:1，v/v）和每毫升 1000 国际单位青霉素的林格氏乳酸盐溶液（Oguri & Tsutsumi） ，1974）。成分更完整的是 Ham's F10 培养基，辅以 10% FCS 和 1% 青霉素/链霉素；该介质中充满了 5% 的二氧化碳、氧气和 90% 的氮气（Carnavale 等，2000）。商业胚胎保存介质 Vigro® ( Hudson et al., 2006 ) 和 Syngro® ( Barfield et al., 2009)) 也已被描述。法国研究人员使用了 EHM 培养基，这是一种基于 PBS 的液体溶液，每升含有 4 克 BSA（Guignot 等人，2015）。科罗拉多州立大学的研究人员报告了使用补充有 20% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基（无机盐、氨基酸、维生素、抗生素等） - DMEM/F12/FBS（Ferris 等人，2016））。Sánchez 等人使用了缺乏钙和镁的 DMPBS，辅以 10% 的 FBS 和每毫升 50 微克的庆大霉素。(2017年）。或者，补充有 10% FBS 加 1% 抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的 M-199 Hepes 培养基也被描述为胚胎保存溶液（Wilsher 等人，2019） 。

据报道，PBS 和乳酸林格氏液可作为驴胚胎的保存介质（Camillo 等，2010）。一些研究人员也记录了商业 Emcare Holding Solution® 的使用（Camillo 等人，2010 年；Panzani 等人，2012 年a）。另一种保存驴胚胎的替代方法是 Holding Vitrocell ®，其中含有百分之零点四的 BSA（Peña-Alfaro 等人，2014 年）。在将驴胚胎移植到骡子子宫之前，已将 Syngro® 保存介质用于驴胚胎（Bottrel 等人，2017）。Pérez-Marín 等人报道了等渗保持介质（IVM 技术）的使用。(2018年）。最近，Bottrell 和他的团队采用 TCM-199 HEPES 辅以 20% FCS 作为胚胎保存介质（Bottrel 等人，2019）。

胚胎清洗和操作介质

PBS 是一种用于母马清洗和操作所收集胚胎的液体溶液。它通常补充有动物源血清，如胎牛血清 FCS（Alvarenga 等，1993）。Eldridge-Panuska 等人已记录了使用不含钙和镁的 PBS，辅以丙酮酸钠、葡萄糖和 FCS 的情况。（2005）。据报道，含有牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液可作为胚胎清洗/操作介质（Guignot 等，2015）。其他清洗液包括 Vigro® 保持液（Hudson 等人，2006 年；Barfield 等人，2008 年）和 Syngro® 保持介质（Barfield 等人，2009 年））。Ferris 等人还报道了使用补充有 20% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM/F12 。（2016）。科罗拉多州立大学的研究人员已使用含有 10% FCS 的 Dulbecco PBS (DPBS) 溶液来清洗马胚胎（Carnavale 等人，2000）。另一种已记录的洗涤介质是含有 10% FBS、青霉素和链霉素的 M-199 HEPES（Wilsher 等人，2019）。

对于驴，Emcare Holding Solution ®经常被描述用于清洗/操作胚胎（Camillo 等人，2010；Panzani 等人，2012a；Panzani 等人，2012b；Panzani 等人，2016）。Syngro® 保持介质被多位研究人员用作胚胎清洗液（Bottrel 等人，2017 年；Pérez-Marín 等人，2017 年；Bottrel 等人，2019 年；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2017 年）。 ，2020b）。或者，PBS（Camillo 等人，2010）、林格氏乳酸盐（Camillo 等人，2010）），等渗保持介质也被描述为胚胎清洗溶液（Pérez-Marín 等人，2018）。

胚胎囊的微量移液器尺寸和穿刺（EC）

没有针对母马的研究正式将用于穿孔 EC 的微量移液器尖端的直径及其与 PVSPR 的关联关联起来。大多数进行 EC 穿刺的实验都设计有直径等于或小于 16 微米 (umØ) 的微量移液器尖端；正如多项研究所述（Choi 等人，2010；Choi 等人，2011；Hinrichs 和 Choi，2012；Guignot 等人，2015；Díaz 等人，2016；Sánchez 等人，2017）。只有少数研究人员证明，用大于 16 umØ 的微量移液器尖端刺穿 EC 后，胚胎的存活率反映在妊娠率上（Wilsher 等人，2019））。据报道，即使用 25 号针刺破 EC，也有怀孕的情况（Ferris 等，2016）。另一方面; 当使用珍妮胚胎时，它们通常在 ≤ 300 umØ 阶段被玻璃化，因此既不需要穿刺也不需要缩小尺寸（Panzani 等人，2012 b；Pérez-Marín 等人，2018；Bottrel 等人，2018）。 ，2019）。一项使用大于 300 µmØ 的大型驴胚胎进行实验的研究描述了压电钻显微操作系统（Ottmann 等人，2018），该系统采用 7-15 umØ 范围内的微量移液器吸头（Choi 等人，2011；Hinrichs ） ＆崔，2012；平冈＆北村，2015）。然而，在Ottman及其同事的工作中，胚胎在升温后并未进行移植，仅报告了它们的体外存活率（Ottmann et al., 2018）。最近的一项研究表明，可以使用（< 1μm 尖端）超细微针刺穿马囊胚（Wilsher 等人，2021）。

用于玻璃化马胚胎的冷冻保存溶液

大多数用于马胚胎玻璃化冷冻的方案均使用渗透性冷冻保护剂的混合物，例如二甲亚砜 (DMSO)、乙二醇和甘油。其他方案包括最后的玻璃化步骤，其中渗透冷冻保护剂，例如乙二醇或乙二醇和 DMSO；与非渗透性冷冻保护剂（例如半乳糖或蔗糖）混合。例如，首先将胚胎放入含有低浓度甘油的溶液中，然后将其从该溶液中取出并逐渐放入含有浓度较高的甘油和乙二醇的溶液中（Eldridge-Panuska 等，2005；Díaz等人，2016 年；桑切斯等人，2017 年；佩雷斯-马林等人，2018 年）。另一方面，还描述了使用含有乙二醇和 DMSO 的介质对马胚胎进行玻璃化冷冻（Choi 等人，2011；Sánchez 等人，2017；Wilsher 等人，2019）。这些方案首先将胚胎放入含有低浓度乙二醇和 DMSO 的溶液中。在前面的初始步骤之后，胚胎随后被转移到含有更高浓度的这些冷冻保护剂的溶液中。用于马胚胎玻璃化的其他冷冻保存液体溶液含有低浓度的乙二醇（初始孵育溶液）和最终或玻璃化溶液。最终溶液由半乳糖和较高浓度的乙二醇组成（Choi et al., 2011; 吉尼奥特等人，2015；费里斯等人，2016；Guignot 等人，2016）。

对于驴胚胎的玻璃化冷冻，根据Eldridge-Panuska 等人对马胚胎玻璃化的早期研究改编了一个方案。(2005 ); 它通常由三个步骤组成，每个步骤都有一个特定的解决方案。例如，溶液一仅含有甘油；溶液二是甘油和乙二醇的混合物；溶液三含有较高浓度的甘油和乙二醇（Panzani 等人，2012 b；Panzani 等人，2016；Pérez-Marín 等人，2018）。其他驴胚胎玻璃化研究的设计考虑了Campos Chillon 等人的研究。(2009)。他们使用含有乙二醇和乙二醇补充半乳糖的溶液（Ottmann 等人，2018；Pérez-Marín 等人，2018）。其他人使用乙二醇和 DMSO 混合物的初始溶液；随后，使用含有乙二醇、DMSO 和蔗糖的第二种溶液（Bottrel 等人，2019；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2020b）。

玻璃化过程中使用的胚胎载体和装载量

零点二十五毫升 (mL) 容量的未辐照聚氯乙烯吸管是马科动物中最早描述的胚胎载体之一，此后经常使用（Obe​​rstein 等人，2001 年；Eldridge-Panuska 等人，2005 年）；Hudson 等人，2006；Hendriks 和 Stout，2010；Choi 等人，2011；Hendriks 等人，2015；Sánchez 等人，2017）。与聚乙烯吸管相反，聚乙烯吸管在最终玻璃化步骤中使用大量液体溶液；Cryolock 载体系统允许研究人员将马胚胎玻璃化成小体积液体（Díaz 等人，2016 年；Ferris 等人，2016 年）; 威尔舍等人，2019）。使用小体积液体对马胚胎进行玻璃化冷冻是通过诸如打开拉吸管之类的设备来实现的（Oberstein et al., 2001 ; Moussa et al., 2005 ; Guignot et al., 2015 ; Guignot et al., 2016）， fibreplug ( Pérez Marín et al., 2018 )、cryoloop ( Oberstein et al., 2001 )、细径微型装载移液器吸头 ( Choi et al., 2011 )、cryoleaf ( Scherzer et al., 2011 )、hemi 吸管 ( Sánchez)等，2017）和剥离器尖端（Sánchez 等，2017）。

可以使用不同体积的液体溶液对马胚胎进行玻璃化冷冻。胚胎装载体积范围从 50（Oberstein 等人，2001）到 30 uL（Eldridge Panuska 等人，2005；Hudson 等人，2006；Hendriks & Stout，2010；Choi 等人，2011；Hendriks 等人） .，2015）。据报道，体积约为 3 或 2 uL 范围（Moussa 等人，2005 年；Guignot 等人，2015 年；Sánchez 等人，2017 年；Pérez-Marín 等人，2018 年；Wilsher 等人，2019 年）。还描述了接近或小于 1 uL 的胚胎装载量（奥伯斯坦等人，2001；迪亚兹等人，2016；桑切斯等人，2017）。在驴中，零点二十五毫升容量的未辐照聚氯乙烯吸管也被报道为胚胎载体（ Panzani 等人，2012 b； Fanelli 等人，2020）。最近描述了几种用于驴胚胎玻璃化冷冻的小容量装置；它们包括低温顶部（ Bottrel 等人，2019； Bottrel 等人，2020a； Bottrel 等人，2020b）、开放式拉吸管（ Ottmann 等人，2018）和纤维塞（ Pérez-Marín 等人， 2018年）。30 uL 液体溶液已用于玻璃化驴胚胎（Panzani 等人，2012b）；但也使用了体积从 3 到小于 1 uL 的低容量胚胎载体（Pérez-Marín 等人，2018；Bottrel 等人，2019；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2020b））。

用于加热胚胎的液体溶液

由于方案之间差异较小，用于加热马胚胎的培养基通常含有浓度等于或小于零点三摩尔的蔗糖。马胚胎被加热并在先前的培养基中保持约一分钟。此后，将胚胎置于蔗糖含量较低的第二溶液中；通常接近或低于零点十五摩尔蔗糖；最后，在升温过程的最后一步，将胚胎置于不含蔗糖的液体培养基中（Choi et al., 2011；Guignot et al., 2015；Ferris et al., 2016；Guignot et al., 2016；威尔舍等人，2019）。单步胚胎升温方案首先由埃尔德里奇-帕努斯卡等人。(2005 )利用零点五摩尔半乳糖溶液。单步升温方案也已在其他研究中实施（ Choi 等人，2011； Díaz 等人，2016； Sánchez 等人，2017）。一些研究人员使用三步方案对胚胎进行加热。第一步，将胚胎置于一摩尔半乳糖溶液中；第二个，它停留在零点五摩尔半乳糖；在第三个加温步骤中，将胚胎置于零点二十五摩尔半乳糖的液体溶液中（ Campos-Chillon 等人，2009； Choi 等人，2011）。

如马胚胎中所述（Eldridge-Panuska 等，2005），驴胚胎的加温是在直接一步加温方案中使用零点五摩尔半乳糖培养基进行的（Panzani 等，2012b；Panzani 等，2012b）。 ，2016）。其他方案采用零点二十五摩尔半乳糖作为加温溶液（Pérez-Marín 等人，2018）。在一些加温方案中，将驴胚胎连续放置在蔗糖浓度逐渐降低的不同液体溶液中（Ottmann 等人，2018；Pérez-Marín 等人，2018；Bottrel 等人，2019；Bottrel 等人，2020a）。最近的一项研究比较了使用三步蔗糖稀释或一步蔗糖溶液方案时玻璃化冷冻后加热的驴胚胎的质量（Bottrel 等人，2020b）。

用于马胚胎宫内移植的培养基

用于移植马胚胎的液体溶液的一些成分在七十年代首次由Oguri & Tsutsumi (1974 ) 描述。在这项研究中，报告了两种不同的转移溶液：含有 2% 明胶粉的盐水溶液和补充有马血清和抗生素的乳酸林格氏液。Eldridge-Panuska 等人报道了两种升温后转移技术。(2005)。第一种方法是在除去温热溶液中所含的半乳糖后，使用 PBS 加 10% FCS 作为转移介质。第二种是直接升温后转移技术。后者包括将含有胚胎的玻璃化溶液（30微升三点四摩尔甘油和四点六摩尔乙二醇）与两柱液体（PBS中的零点五摩尔半乳糖）混合，每柱九十微升（Eldridge ） -帕努斯卡等人，2005）。在之前的技术中，在加热过程中将玻璃化溶液和加热的半乳糖溶液混合到吸管中，形成含有胚胎的稀释液体溶液，随后将其转移到母马的子宫中。哈德森等人，2006）。Syngro® 保持介质也被报道为胚胎移植溶液（ Barfield 等人，2008 年； Sánchez 等人，2017 年）。法国研究人员对含有合成改良输卵管液的培养基进行了实验，并将其用作胚胎移植培养基（ Guignot et al., 2015）。

EmCare Holding Solution ®已被意大利和西班牙研究人员用于移植驴胚胎（Panzani 等人，2006；Panzani 等人，2012a；Camillo 等人，2010）。其他报道的转移介质是 PBS 或林格氏乳酸盐（Camillo 等人，2003；Camillo 等人，2010）。Peña Alfaro 等人将含有零点四的 BSA 的Holding Vitrocell ®用作驴胚胎移植培养基。（2014）。据报道，等渗保持介质（IMV Technologies，L'Aigle，法国）也可作为胚胎移植溶液（Pérez-Marín 等人，2018）。

讨论

近年来，非传统马科动物的胚胎玻璃化冷冻变得频繁（Bottrel等，2019；Bottrel等，2020a；Bottrel等，2020b；Fanelli等，2020）。尽管如此，玻璃化、玻璃化后胚胎移植和妊娠率仍然是珍妮胚胎中很少探索的研究领域（Ottmann 等人，2018 年；Pérez-Marín 等人，2018 年；Bottrel 等人，2019 年））并且尚未使用骡子、hinnies 或其他杂交胚胎进行研究。早期对母马的研究允许收集有关胚胎下降到子宫的时间的知识，然后描述胚胎早在产后 120 小时（五天）就进入子宫（Freeman 等人，1991）。珍妮的可用性有限，而且研究所需的数量庞大，使得广泛追踪驴胚胎进入珍妮子宫的时间变得困难。考虑到这一点是合乎逻辑的；驴胚胎可能会在产后第六天或之后不久下降到珍妮的子宫中（Allen 等人，1985 年；Vendramini 等人，1997 年；Pérez-Marín 等人，2017 年））。然而，对于珍妮来说，就像母马一样，晚一点而不是早一点进行胚胎采集会更成功。此外，与驴胚胎相比，马胚胎的早期发育似乎更快。例如，在产后第七天和第七天半时收集时，大多数马胚胎≥300 µmØ（Hochi等人，1995年；McCue等人，2010年；Guignot等人，2015年；Wilsher等人，2015年） ，2019），而在同一天内收集的大多数驴胚胎≤300μmØ（Vendramini等人，1997年；Panzani等人，2012b；Bottrel等人，2017年；Pérez-Marín等人， 2017年；佩雷斯-马林等人，2018；多拉多等人，2020）。马科动物的胚胎会发育出一种糖蛋白胶囊（ Stout 等，2005），当其进一步发育时，对冷冻保护剂的渗透性较低（ Kingma 等，2011； Scott 等，2012）。EC 渗透性的这些变化也可以通过 PVSPR 来间接假设，PVSPR 是在分析马胚胎玻璃化冷冻 ≤ 300 µmØ 获得的数据时获得的（ Eldridge-Panuska 等人，2005 年； Hudson 等人，2006 年； Choi 等人）等，2011）。玻璃化小胚胎时获得的高 PVSPR 很可能是这些胚胎性质的结果；其囊膜较不发达，对冷冻保护剂的渗透性更强，因此可以轻松玻璃化，获得正常至高的 PVSPR。另一方面，大于 300 µmØ 的大马胚胎的胶囊对冷冻保护剂的渗透性较低。在分析Legrand 等人获得的数据时，可以证实 EC 渗透性的这些变化。（2001）。在之前的研究中，观察到具有较发达或厚胶囊的马胚胎，诸如甘油等冷冻保护剂进入胚胎的机会受到限制（Legrand等，2001）。然后，根据胚胎大小的子类别，仅穿刺（Wilsher 等人，2021）或可能需要穿刺并抽吸囊腔液才能获得高 PVSPR（ Díaz 等人，2016； Sánchez 等人，2017））。哪些驴胚胎亚类（尺寸：≤ 300 µmØ、> 300 ≤ 500 µmØ、> 500 ≤ 1200 µmØ）是否需要在玻璃化步骤之前刺破其囊并吸出囊腔液体的问题尚未得到充分测试然而。基于对马的研究以及对驴的有限研究（参见本综述的前一部分）；可以说，驴胚胎不仅需要被穿刺并吸出囊腔液，还需要被玻璃化，随后加温，并转移到珍妮的子宫中以计算它们的PVSPR（由Urías-Castro & Boeta审查，2020） 。在马科动物中，小栗旬的早期研究描述了胚胎收集或冲洗 (ECF) 溶液的成分（Oguri & Tsutsumi，1974）。它们是含有动物源血清的等渗培养基，在某些情况下还补充有葡萄糖、丙酮酸和抗生素。一些 ECF 溶液含有碳水化合物和抗生素；添加它们的决定可能基于几个因素，例如操纵或保存胚胎所花费的时间以及所使用的设施和设备是否干净或无菌。通过分析报告 ECF 的研究，母马（Guignot 等人，2015 年；Sánchez 等人，2017 年；Wilsher 等人，2019 年）和珍妮犬（Pérez-Marín 等人，2018 年；Bottrel 等人）中的这一现象变得显而易见。 ., 2019）像林格乳酸或哈曼溶液一样简单的培养基可能是很好的替代品（具有实用和经济相关性；因为林格乳酸或哈曼溶液可能更便宜且更容易获得）。

多种液体介质可用于保存马胚胎。一些研究人员使用了盐水或林格氏乳酸盐。还有更复杂的解决方案，如 Vigro ®和 Syngro ®，而就胚胎营养需求而言最完整的解决方案似乎是 Ham's F10 和 TCM-199。然而，很少有研究比较不同类型的保存介质以及使用每种保存介质对胚胎存活、发育和/或妊娠率的影响（Oguri & Tsutsumi，1974；Alvarenga 等，1993））。所选择的培养基类型可能取决于收集或保存过程中的普遍情况，以及胚胎是否会被冷却、储存数小时或在操作后立即处理。用于清洗收集的马胚胎的液体溶液与用作胚胎保存介质的溶液保持密切的关系。然而，当保持介质用作洗涤溶液时，它通常包含抗生素。用于刺穿 EC 的移液管直径与其对 PVSPR 的影响之间的关系尚未在马科动物中得到充分研究，特别是使用驴和骡子胚胎。用于穿刺大于 300 µmØ 的大型马胚胎的微量移液器的直径存在显着变化（Choi 等人，2011；吉尼奥特等人，2015；迪亚兹等人，2016；费里斯等人，2016；桑切斯等人，2017；威尔舍等人，2019；威尔舍等人，2021）。

马胚胎玻璃化有多种方案；然而，在比较使用它们中的每一个时获得的 PVSPR 时，数据有限（Choi 等人，2010；Pérez-Marín 等人，2018）。进一步研究不同胚胎大小类别（≤ 300 µmØ、> 300 ≤ 500 µmØ、> 500 ≤ 1200 µmØ）及其对特定玻璃化方案的敏感性将很有趣。胚胎对甘油等单一冷冻保护剂（Scott et al., 2012）或不同组合：乙二醇和甘油（Kingma et al., 2011）的脆弱性；乙二醇和 DMSO - 乙二醇和半乳糖（Campos-Chillon 等人，2009），是一个有待对驴、骡、hinnies 和其他杂交胚胎进行进一步研究的领域。对于体内（Kingma 等人，2011 年；Scott 等人，2012 年）和体外产生的马胚胎（Campos Chillon 等人，2009 年） ，胚胎渗透性和玻璃化后存活率是一个已经部分描述过的话题。 。

一般来说，当胚胎尺寸减小时（或者因为收集时胚胎尺寸较小；或者因为通过穿刺和/或吸出囊腔液而尺寸减小）并且使用少量培养基（< 1 µL） ）在玻璃化步骤中，由于直接将胚胎放入液氮中会诱导高 TTI，因此冰形成的机会降低（由Urías Castro 和 Boeta 审查，2020）。有趣的是，在描述成功玻璃化小马胚胎导致正常至高妊娠率的最初报告中，使用了大容量载体，将胚胎冷冻保存在 30 uL 玻璃化溶液中（Eldridge-Panuska 等人，2005 年））。胚胎越小，研究人员在玻璃化过程中可以使用的培养基量就越少。然而，当胚胎 >300 µmØ 时，就会出现挑战。由于胚胎最大，因此在玻璃化过程中容纳它所需的介质体积也最大。上一问题使得在玻璃化冷冻过程中和加温步骤之后实现高 TTI 并减少冰形成以提高胚胎存活率变得更加困难。即使在练习胚胎囊穿刺和囊腔液体抽吸之后，在> 300 µmØ的胚胎中实现高PVSPR的困难仍然存在，特别是对于> 800 µmØ的胚胎，很难加载到小体积的玻璃化介质中（个人经验）。

胚胎升温过程通常从摩尔浓度从零点二到零点三、零点五甚至一摩尔浓度的半乳糖或蔗糖溶液开始。一旦加热，胚胎随后被放置在半乳糖/蔗糖摩尔浓度降低的溶液中。在升温过程的最后步骤中，胚胎被放置在不含半乳糖/蔗糖的溶液中。其他方案采用一种称为直接升温后转移的技术，该技术包括将胚胎置于零点五摩尔蔗糖中（最后一个方案的使用具有实际意义，因为允许在升温后直接转移胚胎）。在后一种方案中，胚胎在最后的溶液中加热并直接转移到母马的子宫中。崔等人，2011；博特雷尔等人，2019；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2020b）。例如，大胚胎（>300 µmØ）在升温过程中可能需要更多时间才能达到渗透平衡；由于存在更发达的胶囊，可能会降低其渗透性。有必要进一步研究大型马胚胎所用加温溶液的摩尔浓度。按胚胎大小子类别（>600 ≤ 900 µmØ；>900 ≤ 1200；>1200 ≤ 1500 µmØ）调整摩尔浓度可能会改善胚胎升温方案和 PVSPR。关于加温溶液的摩尔浓度（基于胚胎囊的发育程度和渗透性），可以预期胚胎敏感性有很大的变化。目前尚未完全确定驴和/或马胚胎对玻璃化/加温过程的敏感性是否存在差异（Bottrel 等人，; Bottrel 等人，2020b）。例如，驴胚胎似乎不太容易受到玻璃化损伤（Pérez-Marín 等人，2018；Bottrel 等人，2020a；Bottrel 等人，2020b）。先前马和驴胚胎之间玻璃化敏感性的差异可以部分解释为对冷冻保存物质的渗透性的差异。在驴胚胎中观察到的对玻璃化过程不太明显的敏感性是否适用于变暖过程，需要进一步研究。

多种液体转移溶液可用于马胚胎的宫内沉积。用于装载和转移胚胎的介质和体积将取决于后者的大小。一般来说，如果胚胎较大（>300 µmØ），则可以使用授精移液器。如果胚胎较小（≤ 300 µmØ），可以使用零点 5 或零点 25 mL 吸管。像盐水和/或林格氏乳酸盐（价格便宜且易于获得）这样简单的培养基辅以明胶，是可用于移植马、驴或骡胚胎的替代品。PBS 和商业 Syngro 培养基是可用作胚胎移植溶液的其他选择（但是这些选择更难以获得并且通常更昂贵）。其他替代方案可能为马胚胎的营养和发育提供更稳定的条件。前者可能包括补充有合成输卵管液或 Dulbecco 改良 PBS 的培养基。在驴种中，经常报道的胚胎移植溶液是 Emcare、PBS 和 Holding Vitrocell®。没有研究系统地调查用于通过 PVSPR 转移马胚胎的解决方案的相关性。尚不清楚诸如盐水或林格氏乳酸盐之类的简单溶液是否是胚胎移植培养基的良好替代品。尚未研究单独或与抗生素联合使用盐水或林格氏乳酸盐溶液是否可以产生可接受的驴或骡胚胎 PVSPR。比较使用简单且易于获得的溶液（例如盐水或林格氏溶液）移植马胚胎时获得的 PVSPR；或者补充有动物源血清和/或合成输卵管液的更复杂的培养基需要进一步研究。利用驴和杂交马胚胎（如骡子和骡马）作为模型进行冷冻保存领域的研究可以提高其玻璃化冷冻后的存活率，从而提高移植后怀孕的比例。需要对母马和珍妮进行进一步研究，以改进玻璃化冷冻方案，从而提高 PVSPR，尤其是对于>300 µmØ 的驴和骡胚胎。