基因型选择对免疫应答的影响 流产的布鲁氏菌 在霍尔斯泰因养牛场

在美国,对牛奶生产性状的遗传选择影响了许多与繁殖和免疫相关的基因。本研究将外周血单核细胞的转录组反应与体外反应进行比较。 流产的布鲁氏菌 自20世纪60年代中期以来,未被选为牛奶生产性状的当代霍氏菌和霍氏菌之间的细菌挑战。从4个现代和4个未选择的哺乳期初产妇的外周血单核细胞中提取出总RNA,经过24小时的培养,并与rb51细菌进行刺激或不刺激。RNA的序列和读分析使用的工具来自 galaxy.scinet.usda.gov .共有412个差异表达基因(假发现率) P 结果表明,日志折叠变化&t;|1进行了检测.在19个术语/途径中,高蛋白基因(在当代的牛中比未选的牛表达更高的基因)得到了丰富,包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,这表明细胞的应激反应。在37个术语/途径中丰富了降低调节的基因(在未选定的奶牛中表达较高的基因),代表了多种免疫反应,包括自然杀伤细胞介导的免疫力、干扰性卵母细胞生成、白细胞介素-10生产的负调节和细胞因子受体活性,表明广泛的免疫反应,强调免疫防御。这些结果提供了证据,证明这两个基因型对体外细菌挑战的反应存在差异。这表明当代奶牛,基因选择用于产奶,可能会降低免疫功能,包括对细胞内细菌反应的限制。

导言
人畜共患病 流产的布鲁氏菌 是牛布鲁氏菌病的病因。一种革兰氏阴性细菌, B. abortus 会引起人类的慢性感染、炎症和关节炎;然而,在牛身上,它主要导致生殖衰竭,包括流产或虚弱的小腿(奥尔森和帕尔默,  2014 )。尽管成功地根除了家畜,大黄石地区的麋鹿和野牛等疾病的野生动物库继续对牧群构成威胁。rb51是1996年由动植物健康检查局批准的一种改良活疫苗。由于rb51缺乏脂多糖(LPS),免疫动物不产生干扰诊断测试的抗体,将rb51指定为一种DVA疫苗(区分感染者和接种动物)。对于牛来说,在野外和实验条件下提供有效保护(马丁斯等人)的RS51已经建立起来。,  2009 奥尔森等人,  1999 , 2009 奥尔森&鲍格亚托,  2022 ;桑兹等人。,  2010 )。有趣的是,Rb51是一种非常有效的牛疫苗,但它降低了野牛(奥尔森等人)的疗效。,  2003 ;帕默等人,  1996 ),并提供最低限度的保护(库克等人)。,  2002 ;克里格等人。,  2002 ).

美国霍尔斯汀的牛奶生产性状的遗传选择大大提高了每只动物的产奶率,从而形成了一个现代化的乳品系统,需要较少的动物、饲料和水来生产年度的牛奶需求,从而提高利润和效率,同时也降低了对环境的影响(卡普等人)。,  2009 )。然而,牛奶生产的遗传选择影响了许多免疫基因(MA等人)。,  2019 )。模拟牛奶生产选择随时间和其他相关特征的影响的工具包括明尼苏达大学开发的一个研究群。从1964年开始,这群奶牛中的霍尔斯坦奶牛和小母牛被培育成平均产奶量的小母牛,并且在这群奶牛中保持了遗传选择(科尔和范拉登,  2018 汉森等人,  1979 韦伯等人,  2007 )。基因组的变化影响了近40%的当代和未选定的霍尔斯汀基因组,包括当代动物的多样性大大减少(Kim等人)。,  2013 ;马等人,  2019 )。这些基因组改变的生物学意义已经通过实验挑战研究得到证明,其中未选择的霍尔斯汀具有更大的肝表达TLR4信号记录(库西拉斯-博姆,  2018 )和血细胞因子反应(库西拉斯-波姆等。,  2020 )之后 i.v .脂多糖给药,一种更强有力的乳腺内防御 大肠杆菌 (利普波利斯等人),  2022 )和更大的细胞因子反应,当整个血液被来自革兰氏阴性细菌的成分孵化时。,  2022 , 2023 ).

为了研究宿主基因组背景是否会改变对布鲁氏菌病疫苗接种的免疫反应,我们用rb51对来自未筛选的和当代的霍尔斯汀的外周血单核细胞进行了质疑,并通过RNASEQ对其反应进行了评估。我们的数据表明,牛奶生产的遗传选择影响了不同转录反应体外 布鲁氏菌 曝光。

材料和方法
动物的
在国家动物疾病中心乳品厂,在相同的环境和管理条件下,对未选择的和当代遗传系的哺乳、初产的霍尔斯坦奶牛进行了保养。所有8只动物(4只当代动物和4只未选定的动物)都在其第一个哺乳周期的两岁和晚期哺乳期。所有的程序都得到了国家动物护理和使用委员会的批准。

实验设计
本研究是一个2×2因子的设计,有两个因素:选择基因型和rb51刺激,每个都有两个层次:当代的或未选择的基因型;被rb51刺激或未刺激。从4头当代和4头未选择的初产牛的颈静脉中采集血液,用于外周血单核细胞,然后用rb51刺激或不刺激,总共为16个样本的RNA后续。所有因素比较的结果见表  S1–S7 .如前所述,已分离出多溴联苯(Boggiatto等人)。,  2020 )。在密度为1x10的六井培养板上清点和电镀多溴联苯 6 完整的细胞/井。对每一种动物,在培养基中单独培养或用重组的Rb51(科罗拉多血清公司)在1x10刺激多溴细胞。 7 群居形成单位/井。经37℃24小时孵化后,含5%钴 2 将盘子放在冰面上10分钟,刮去附着细胞。在2400时收集细胞悬浮液并离心机10分钟  g 在室温下,将上清剂去除,并在特里索中重新悬浮细胞。按照先前的报道(普兹、西瓦桑卡兰等人),在特里索分离协议之后,RNA被分离出来。,  2021 ;扎瓦拉-阿尔瓦拉多和本阿鲁迪,  2020 )。用安捷伦2100生物分析仪对从RNA质量中分离出的RNA进行了评价,并对其进行了定量分析。 奎比特 2.0生命技术荧光计提交转录体分析之前。16个样本的平均浓度为145纳克/欧氏浓度,平均RNA完整性数为6.2。

图书馆筹备
在爱荷华州基因组学中心进行了图书馆的准备和测序,并利用"诺瓦谢克6000"产生了100bp配对端读。在一个SP流电池的单一车道上共对16个样品进行了排序。平均每个样本生成3405万个读取。提供的工具 galaxy.scinet.usda.gov 用于分析顺序读取。 Fstqc 和 多种质量c 用于对读取和检查原始读取数据和计数进行质量控制。 三角形的 (版本0.38.1)用于移除适配器,并在调整前读取20分以下。 牛金牛座 基因组 希萨特2 (版本2.1.0)。生成了原始计数,其默认参数为: 特征尿计数 (版本2.0.1)。用差动基因表达(DEG) Deeq2 (版本2.11.4.6)利用参数适合类型和值来解释零计数的基因。基于模型基因型+刺激+E进行DEG分析,结果为412例(假发现率)。 P < 0.05, log 2 -Rb51刺激后,当代和未选定的霍氏体蛋白之间的折叠变化差异表达基因。 Deeq2 还用于生成样本的主成分分析图和使用特征计数生成的读取计数的样本到样本距离的热图。 Deeq2 利用正则化计数的正则化测井变换进行分析和无监督聚类方法,进行主分量分析和分层聚类,生成样品到样品距离的热映射。

分析
利用细胞景观中的克洛戈插件来识别和聚类显著丰富的生物过程(BP)和分子功能(MF)的基因本体(go),以及《京都基因和基因组百科全书》(KGEG)的途径,这两种途径都具有显著的提升基因(当代霍氏蛋白的表达更大)和降低调节(未选定的霍氏蛋白的表达更大)。使用双面超几何试验测试了浓缩的术语和途径,认为在以下情况下具有重要意义: P 0.05,至少有三个基因映射到术语/路径上,而映射的基因至少占相关基因总数的4%。得出的数字中的节点大小代表术语/路径意义。术语和路径被使用科恩的 κ 无条件条款间协议的协效率度量。在所有术语和边缘之间计算Kapa评分,并建立与一个术语/路径相关的功能组。 κ 上士;0.4。功能组由同一颜色的节点指定.

透射电子显微镜
如上所述,编制并刺激了多溴联苯醚。在29℃条件下孵化24小时后,将盘子放置在冰上10分钟,并将其拆卸以去除附着细胞。在2400时收集细胞悬浮液并纺10分钟  g 然后去除上清剂,细胞再悬浮在5%戊二醛/0.1米的卡索代酸缓冲液中。进一步处理了以前报告的样品(普茨、安德烈森等)。,  2021 ),并用热法菲菲特卡尼G进行分析。 2 生物双胞胎电子显微镜,并配以一个侧置的OCAR数码相机(先进的显微技术)。

结果和讨论
流产的布鲁氏菌 是一种细胞内的病原体,通常是吞噬细胞,如单核细胞(切利,  2019 )。用Rb51培养细胞后,用透射电镜对细胞进行评价,证实细胞内感染来自当代和未选定奶牛(图)。  1 ).

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图1
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扫描电子显微镜 流产的布鲁氏菌 感染的单核细胞。描述了(a)当代单核细胞和(b)未选定的单核细胞内化Rb51的典型例子。黑色箭头显示细胞内 布鲁氏菌 . Magnification 6800×.
在24小时体外刺激下,对受感染的pbmc进行RNASAQ检测,以确定Rb51反应的差异。平均每个样本生成3406万个读取。主要兴趣是基因型之间的差异表达。在多次检测的本雅米尼-霍奇伯格错误发现率修正后,1365个基因在 P < 0.05 (Table  S1 )。其中412个有日志 2 -折1或<-1。在这些412个基因中,128个基因表达更多(上位基因,表  S3 )和284表示较低(向下监管,表  S2 在当代比在未选定的霍尔斯廷。图中显示了明显差异表达基因的火山图  2 .

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图2
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在Rb51刺激的外周血单核细胞中,火山图基因在当代和未选择的霍尔斯汀中的差异表达。共有412人有日志 2 -折1或<-1。在这些基因中,128个基因表达得比未选定的霍斯特林基因更多,284个基因表达得更少(向下调节,绿色显示)。
在当代的霍尔斯汀中,128个被提升的基因包括一个主要的组织相容性复合体(MHC)基因BLLA-DRB2,该基因以前曾被报道在当代和未被选择的霍尔斯汀中有着最大的全基因等位基因频率差异(MA等人)。,  2019 )。当代霍斯特林大学的顶级学位包括 穿透物1 ( 微管壁穿孔器1 ), 安培 ( 羊膜相关跨膜蛋白 ), and 图梅88 ( 跨膜蛋白88 ),如图所示  2 . 穿透物1 与DNA损伤反应有关。,  2010 ). 安培 与信号分子的传递有关,也与正确定位和功能有关。 库本 ,肠道内在因子维生素B12受体(斯特罗等。,  2004 ). 图梅88 是wnt/,  2020 )。这些促炎细胞因子在母乳中的浓度增加更多来自于当代的霍尔斯汀,在乳腺内炎的挑战中,它比未选择的霍尔斯汀更多地经历了更严重的乳腺炎。 E. coli (利普波利斯等人。,  2022 )。有趣的是,在未选择的霍尔斯坦小母牛中,系统给予相当剂量的LPS会增加血浆IL-6浓度。,  2020 )和奶牛(库西拉斯博姆,  2018 )比他们同时代的霍尔斯坦牧群中的伙伴要好。对LPS的系统化管理影响不仅限于ppmc,这可能导致LPS和Rb51研究之间在细胞因子反应上的差异。

当代128个表达率较高的基因与未筛选的霍尔斯汀基因相比,显示了8个BP去、5个MF去、6个KGEG途径的浓缩。有关条款和途径的详细信息见下表  S4 .这19个术语分为7组功能:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(52.63%的术语/途径); 金黄色葡萄球菌 感染(21.05%);骨骼肌细胞分化(5.26%);分割(5.26%);肌动蛋白细胞骨架重组(5.26%);癌症中的中枢碳代谢(5.26%);极化上皮的形态形成(5.26%),如图所示。  3 . 博拉-德雷博2 与G术语集群有关" 金黄色葡萄球菌 感染"(图)  3 )这是当代霍尔斯汀中唯一一个与免疫或疾病相关的丰富集群。当代霍斯汀中的大多数色度与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢KIGG途径有关。这种氨基酸途径与细胞应激反应有关。,  2021 ).

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图3
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当代霍斯特林中表达较高的丰富术语的细胞景观分析。128个基因所确定的途径显著地提升了现代牛的表达水平。功能组由同一颜色的节点指定.未选定的霍尔斯汀中表达较高的丰富术语的细胞景分析。284个基因显著降低调节的途径表明未选牛的表达较高。功能组由同一颜色的节点指定.
相比之下,在未选择的霍尔斯汀中表达较高的基因与免疫防御反应基因有着密切的联系。未选定的霍尔斯廷的顶级学位包括 Klrk1 ( 细胞凝集素样受体K1 ), Gimap4 ( 免疫相关蛋白4 ), and CD3G ( T细胞受体复合体的CD3伽马亚基 ). Klrk1 ,又称 非线性 是一种与NK细胞和细胞毒性T细胞的活化以及与多种配体的相互作用密切相关的MHCI类链相关基因。  2014 ; Lanier,  2015 ). Klrk1 有报道称在 B. abortus 受感染的小鼠巨噬细胞,与我们的研究相似,在感染后24小时内被上浮。,  2017 ). Gimap4 调节细胞因子和雌激素的产生,并参与T型淋巴细胞分化。,  2015 ). Interestingly, Gimap4 在牛身上显示了广泛的等位基因特异性表达(张伯伦等人)。,  2015 ). CD3G 在细胞介导的免疫中,T淋巴细胞的激活起着重要作用,并与母乳体细胞评分有关。,  2019 范德默韦和杜谢克,  2011).

与当代的霍尔斯汀基因相比,在未选定的基因中表达较高的基因包括31个BP去项、4个MF去项和1个KGEG通路。有关条款和途径的详细信息见下表  S5.这36个术语分为13个功能组:自然杀伤细胞介导的免疫(35.9%)、干扰-卵末生成(12.82%)、神经细胞分化(10.26%)、对其他生物的防御反应(10.26%)、IL-10的负调控(7.69%)、清除剂受体活性(5.13%)、细胞趋化(2.56%)、进入细胞核蛋白的正调控(2.56%)、化学反应(2.56%)、吸引剂活性(2.56%)、成骨细胞增殖阳性调节(2.56%)、细胞因子受体活性(2.56%)、自然杀伤细胞介导的细胞毒性(2.56%)和细胞-基质粘附(2.56%)。与我们在当代奶牛中的发现相比,在未选定奶牛中表达较高的基因被丰富了更多的术语和途径,其中许多与免疫反应有关。

这项研究表明,来自未选择的霍氏菌素的pbmc对感染具有更大的免疫活性。 B. abortus RB51 比当代霍尔斯廷公司的多。这种差异调节与我们以前的研究结果是一致的,这些研究表明,未选择的霍尔斯汀对系统性LPS的挑战产生了更大的免疫反应。  2018 库西拉斯-博姆等人。,  2020 比当代的霍尔斯丁。同样地,我们以前的维沃研究与这个未选择的。当代的模型显示,当未选择的霍尔斯汀体内的全血与LPS、脂黄素、或热源性革兰氏阴性已知引起乳腺炎的细菌孵化时,细胞因子反应更大。,  2022 , 2023 ).

我们乳腺内的结果 E. coli 对这些霍斯坦基因型的挑战研究表明,在未选定的霍尔斯汀中,免疫反应的激活程度更高,可以对入侵的病原体产生更大的防御作用(利普波利斯等人)。,  2022 )。尽管同样的数量 E. coli 是被注入的 E. coli 在未被选中的霍尔斯廷,感染主要局限于注射区。相比之下,当代奶牛表现得 E. coli 生长、体温上升、乳腺-血液屏障的破坏更大、感染的系统指标增加,如牛奶中炎症性细胞因子增加,牛奶产量大幅减少,进一步证明了炎症和代谢压力对细菌病原体的反应。,  2022 )。尽管在乳腺内的挑战研究中,基因型差异导致了未选择的和当代的霍尔斯汀的整个血液转录变异,但感染的严重程度可能对观察到的差异有更大的影响。

在我们目前的研究中,没有迹象表明在体外条件下,rb51的生长有所不同。因此,我们认为本文所报告的感染了多溴联苯的不同转录反应。 B. abortus rb51更能反映未选与当代霍氏蛋白的基因型差异。此外,这里报告的结果支持了以前的研究结果,即与当代血统相比,在面临相同的免疫挑战时,未选定的荷斯坦人的免疫反应发生了更大的变化。,  2022 , 2023 ; Cousillas-Boam,  2018 )。目前的研究报告了新的数据,表明与免疫防御和反应相关的基因(例如 Klrk1 , Gimap4 ,以及 CD3G )显示来自未选择的霍尔斯汀的pmbCS表达增加,而与炎症和应激反应相关的基因(包括 穿透物1 , 安培 ,以及 图梅88 在rb51感染后,来自当代霍尔斯汀的ppmc含量增加更多。进一步的研究应该更详细地探讨这些不同的反应,以确定在50年以上的选择中,霍尔斯汀的免疫和炎症反应是如何改变的。

在未选择的牛中,高浓度的学位和生物途径被提升,并与NK细胞和相关的细胞毒性细胞相关,值得关注。虽然NK细胞与预防病毒感染和肿瘤细胞有很大的联系,但它们也与牛对卡介苗(B卡介苗)免疫接种的反应有关,包括激活、增加抗原细胞表达和增强TS1反应(汉密尔顿等人)。,  2016 )。众所周知,牛NK细胞群体具有高度异质性,尤其是在个体和变异MHC群体之间(艾伦等人)。,  2015 )。可能未选择的牛在这些基因家族中保持了更多的多样性,这种多样性有助于细菌控制的有益效果。

目前研究中的数据支持了自1960年代中期以来霍尔斯坦基因组的改变已经影响了对细菌病原体的免疫反应的范式。当牛受到革兰氏阴性菌的挑战时,不同的反应似乎更明显,但为了进行更彻底的评价,需要对革兰氏阴性菌进行额外的挑战研究。进一步的研究,确定这些基因型在体内是否对疫苗接种有不同的反应,以及是否对毒性的挑战有不同的反应 B. abortus 诱导与疾病严重程度和/或保护相关的基因表达差异是有价值的。