介绍
使用植物提取物或植物生素促进鱼类生长和健康是水产养殖营养中的一个重要问题。植物生素富含各种生物活性化合物，如生物碱、精油、黄酮类、萜类化合物、皂苷、单宁和类固醇，它们具有促进生长的生化特性，并可作为免疫刺激剂、抗病毒剂、抗菌剂和抗寄生虫剂（Jana et al.，2017）。 ，2018）。例如，Abd-Elaziz 等人。(2023)观察了草药提取物（辣木、银杏、 水飞蓟、肉豆蔻和 黄芪）用于鲶鱼鱼种。核桃（Juglans regia）叶提取物被发现对尼罗罗非鱼具有免疫调节、基因表达反应和抗病性（Yilmaz 等人，2023）。查克拉博蒂等人。(2014)证明植物化学物质作为饲料添加剂的应用是鱼类养殖中潜在的生长促进剂和内分泌调节剂。此外，在水产养殖中使用植物素具有成本效益，更容易生物降解，并且细菌耐药性和组织中残留积累较少（Abdel-Latif等人，2023年；Abdul Kari等人，2022年； de Rezende等人，2021年））。

黑胡椒（Piper nigrum Linn）是一种重要的药物，含有酚类、类黄酮、生物碱、挥发油、类固醇、萜烯、蛋白质、碳水化合物、纤维、多糖、酰胺和木脂素（Meghwal & Goswami，2013）。它还含有 3.5% 的精油，由阿拉伯烯、蒎烯、柠檬烯、芳樟醇和水芹烯组成（Murlidhar & Goswami, 2012），以及多种植物成分，即。胡椒碱、胡椒胺、哌酰胺、哌啶、杀哌啶、胡椒碱、毛胆素、莎门汀、莎门糖碱和香芹酮（Ghosh 等人，2014 年））。黑胡椒作为一个整体或其次生代谢物具有治疗作用，包括抗炎、刺激生长、化学预防和免疫调节活性。胡椒碱是多种胡椒品种中的主要生物活性生物碱，主要是黑胡椒（Srinivasan，2007）。黑胡椒含有3%~8%的胡椒碱及其异构体；异胡椒碱、chavicine 和 isochavicine ( Mohammed et al., 2016 )。

胡椒碱具有多种药理功效，包括免疫调节、抗氧化、抗炎、抗菌、抗真菌、降高脂血症、抗肿瘤和抗细胞凋亡作用（Ahmad et al., 2012）。研究发现胡椒碱可以增强鱼类的吞噬细胞活性、补体活性、刺激自然杀伤细胞、增殖淋巴细胞、抗体和溶菌酶反应（Bae 等，2010）。胡椒碱通过抑制 TNF-α 的产生、脂多糖诱导的内毒素休克和白细胞积聚来发挥抗炎活性（Bae 等，2010））。除了一系列药理作用外，胡椒碱还被发现可以提高药物（利福平、四环素和磺胺嘧啶）和其他营养物质（如胡萝卜素、吡啶、姜黄素、葡萄糖和氨基酸）的生物利用度（Gorgani 等，2017））。此外，胡椒碱已被证明可以刺激鱼类的消化酶活性，改善消化，并减少胃肠道食物传输时间（Platel＆Srinivasan，2000）。几项研究评估了黑胡椒、其提取物或其主要生物活性化合物胡椒碱对水生物种生长和健康的药理作用（马蒂乌拉等人，2016；尼拉万等人，2017）。膳食胡椒碱对印度主要鲤鱼（ Labeo rohita ）的血液免疫反应产生了有利影响，增强了生长和对嗜水气单胞菌的抵抗力（Nilavan 等，2017）。普尼萨等人。(2008 )观察到胡椒碱可以提高石斑鱼( Epinephalus tauvina )的先天免疫力、对哈维氏弧菌感染的抗病性 和生长指数。此外，胡椒碱被发现是一种潜在的抗寄生虫剂，可用于控制乌鳢属 寄生在金鱼 ( Carassius auratus ) 上（Kumar 等，2012）。

在水产养殖中，使用黑胡椒或胡椒碱作为免疫刺激剂是治疗一系列疾病的补充疗法的新前沿替代方案。然而，关于膳食胡椒碱对水生动物影响的信息很少。此外，它需要量化对鱼类生长、免疫力和生理的剂量依赖性刺激作用。红鲷（真鲷）是韩国广泛养殖的海水鱼类。据我们所知，尚无研究调查膳食胡椒碱对红鲷的免疫反应、生长和健康特性的补充作用。因此，本研究旨在确定膳食胡椒碱作为天然免疫刺激添加剂在红鲷配方饲料中的作用。

材料和方法
实验鱼和伦理声明
红鲷幼鱼从孵化场（韩国金海市 Daedong susan）获得并适应实验条件 15 天，在圆形玻璃纤维池中饲养，同时饲喂商业饲料（含 87.5% 干物质、52% 粗蛋白、12 % 粗脂和 10.8% 灰分；Suhyup Feed，首尔，韩国）。驯化期间，每天喂食3次（8:30、12:30和17:30），直至明显饱足。每天光照周期保持在12小时：12小时光照/黑暗条件。自动流通系统将过滤后的海水（4升/分钟）连续输送到水箱中。饲养水持续曝气以维持最佳溶解氧。

实验饮食
六种实验日粮配制成等氮、同脂，其中粗蛋白为45%，粗脂为15%。日粮中添加 0.0、0.25、0.50、1.00 和 2.00 g/kg 水平的胡椒碱（分别为 Con、P25、P50、P100 和 P200）或 1.0 g/kg (BP100) 的黑胡椒粉。胡椒碱和黑胡椒粉由韩国富川市的 Synergen 提供。在混合过程中，用羧甲基纤维素（CMC）和胡椒碱以1:0.2的比例制备预混料，其相当于P200日粮。对于每种饮食，提供足量的预混料以满足所需的胡椒碱水平。根据配方，提供的CMC相当于每种日粮中1%的CMC。根据配方称量干成分、蒸馏水（15%）和鱼油，并使用食品搅拌机（NVM-14，Daeyung，Seoul，Korea）充分搅拌在一起；将每个湿面团造粒至直径3毫米。将颗粒在 25°C 下干燥 8 小时，以实现水分含量 < 10%。饮食在25°C真空条件下储存。使用标准技术测量日粮干物质、蛋白质和灰分含量（将颗粒在 25°C 下干燥 8 小时，以实现水分含量 < 10%。饮食在25°C真空条件下保存。使用标准技术测量日粮干物质、蛋白质和灰分含量（将颗粒在 25°C 下干燥 8 小时，以实现水分含量 < 10%。饮食在25°C真空条件下保存。使用标准技术测量日粮干物质、蛋白质和灰分含量（AOAC，2005）。

实验设计和喂养试验
幼鱼（7.6 ± 0.1 g）随机放入 18 个圆形水箱（220 L）中，每个水箱密度为 30 条。将三组鱼分配给每种实验饲料，并每天喂食三次（8:30、12:30 和 17:30）至明显饱足。每次喂食30分钟后，将未吃完的食物​​吸出并干燥。从饲喂量中减去干重以计算采食量。过滤后的海水通过流通系统（4 升/分钟的速率）连续供应到水箱中，并进行曝气以保持最佳的溶解氧水平。生长试验进行了8周。饲养水质保持如下：温度23.1±1.7℃，盐度 31 ± 1 ppt，溶解氧 7.65 ± 0.91 mg/L，pH 8.28 ± 0.25，氨 0.062 ± 0.006 mg/L。每天维持 12 小时：12 小时（亮/暗）光周期。

生长评估和取样
饲养试验8周后，在称重和取样前24小时停止饲养，以减轻对鱼的应激。获得每个池中的鱼数和个体重量以确定生长指数；平均最终体重（FBW）、增重（WG）、特定生长率（SGR）、体况因子（CF）、肝体指数（HSI）、饲料转化率（FCR）和蛋白质效率比（PER）。从每个水箱中随机捕获四条鱼，并使用 2-苯氧乙醇（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国，77699）200 ppm 浓度溶液麻醉。从尾静脉采集血样，并在室温下凝固 30 分钟。然后将样品以5,000×g离心10分钟以分离血清。另一组血样从肝素注射器中取出并以 5,000×g 离心 10 分钟以分离血浆（Hasanthi 等人，2023）。血浆和血清样本储存在 –80°C 下用于生化和免疫分析。为了进行组织学观察，取1厘米长的前肠样本（幽门盲肠后1厘米）并储存在Bouins溶液中以固定组织。为了进行基因表达分析，在无菌条件下获得肝脏样本，随后立即冷冻在液氮中，并储存在 –80°C 下。

先天免疫和抗氧化能力分析
血清髓过氧化物酶 (MPO) 活性按照Medagoda & Lee (2023)的描述进行测定。使用Anderson 等人中概述的技术。(1992)，使用硝基蓝四唑 (NBT) 测试对呼吸爆发期间吞噬细胞氧化自由基的产生进行定量。全血样本用于 NBT 测定。随后进行比浊测定来分析血清溶菌酶活性。如Hasanthi & Lee (2023)中所述，测量了由于溶壁微球菌裂解而导致的浊度降低 。根据Ellis (1990)方法，通过其抑制胰蛋白酶活性的能力来评估血清抗蛋白酶活性。Siwicki 等人描述的方法。(1994)用于测定血浆总免疫球蛋白（Ig）的水平。使用测定试剂盒（Sigma-Aldrich，19160）测量血清超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性。微量血细胞比容技术通过将毛细管中的全血以 650×g 离心 10 分钟来测定血细胞比容。血红蛋白（使用全血）、血浆葡萄糖、血浆甘油三酯、血浆胆固醇和血浆总蛋白的血液学参数由血液分析仪（SLIM，SEAC，佛罗伦萨，意大利）测定。

肠道组织学分析
固定的肠道样品使用乙醇系列脱水。将样品片段包埋在熔融石蜡中后，将所得块放在切片机上并切成 5 µm 的厚度。将切片附着到显微镜载玻片上，然后在二甲苯脱蜡后再水化。对于一般组织学分析，样品用 Harris 苏木精和 0.5% 伊红染色。使用ImageJ 1.44分析程序测量绒毛长度。

用于胰岛素样生长因子-I (IGF-I) 基因表达分析的定量实时聚合酶链反应 (qRT-PCR)
肝脏样本用 TRIzol 试剂（Sigma-Aldrich，T9424）处理以提取总 RNA。使用 NanoDrop 分光光度计（Thermo Scientific，美国）在 260 nm 处测定提取的 RNA 浓度。使用Prime Script™第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa，日本）逆转录2.5 μg总RNA，稀释40倍，然后保存在-80°C。对于 qPCR 分析，反应混合物含有 0.5 μL 引物 (10 pmol/μL)、5 μL TaKaRa Ex Taq™ SYBR 预混液、3 μL 稀释 cDNA 和 5 μL dH 2评估总体积 10 μL 中的 O。18S rRNA（GenBank 登录号 AY550956）被认为是看家基因。基于NCBI GenBank，创建基因引物序列（IGF-I，登录号：CM040953.1）。PCR程序如下：95℃10s 1个循环，95℃5s、58℃20s、72℃20s 45个循环。根据Pfaffl (2001) [2−ΔΔCT; 阈值循环(CT)]，计算相对mRNA表达值。

统计分析
数据通过 SPSS 22.0 版（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）中的单因素方差分析 (ANOVA) 进行分析。当方差分析显示组间差异时，使用Tukey 的 HSD 检验 ( p < 0.05) 来比较平均值。数据以平均值±标准差表示，所有百分比数据在分析前均进行反正弦变换。

结果
生长性能和饲料利用率
胡椒碱和黑胡椒对生长性能和饲料利用率的补充效果见表2。与对照组相比，膳食中补充胡椒碱 (0.25-2.0 g/kg) 显着增加 ( p < 0.05) FBW、WG 和 SGR。与对照组饮食相比，0.5-2.0 g/kg 饮食胡椒碱的 FCR 显着降低 ( p < 0.05)，而 PER 更高。在饲喂胡椒碱或黑胡椒的鱼中观察到较高的 CF（p < 0.05）。恒指下跌 ( p < 0.05) 与 Con 组相比，用 BP100 喂养的鱼。

先天免疫和抗氧化酶活性
补充胡椒碱可增强先天免疫力和抗氧化酶活性（表 4）。与Con组相比，膳食胡椒碱显着增加（p <0.05）MPO和抗蛋白酶活性，而在1.0g/kg水平时观察到最高值。BP100 饮食和胡椒碱浓度为 0.5-2.0 g/kg 时，溶菌酶活性和 Ig 水平增加（p < 0.05），而 BP100 组观察到最大值。同样，SOD 活性也显着升高 ( p< 0.05）在胡椒碱 0.25-2.0 g/kg 水平和 BP100 饮食中的值。

血浆血液学参数
总蛋白和葡萄糖的血液学参数没有因膳食胡椒碱或黑胡椒而显着改变（表5）。虽然Con组和BP100组之间的血浆血细胞比容和血红蛋白值没有显示出显着差异（p >0.05），但与Con饮食相比，饲喂BP100饮食的鱼的血细胞比容和血红蛋白水平较低。然而， 0.5-2.0 g/kg 胡椒碱或 BP100 饮食可显着降低血浆胆固醇 ( p < 0.05)。

肠道组织学参数
鱼肠形态学的对比分析如表6和图1所示。当在饮食中添加黑胡椒或胡椒碱时，肠绒毛高度和分泌粘液的杯状细胞增加。饲喂 0.25 g/kg 胡椒碱或 BP100 饲料的鱼的杯状细胞计数显着较高 ( p < 0.05)。膳食胡椒碱 0.25–1.0 g/kg 水平显着增加 ( p < 0.05) 红鲷肠绒毛长度。

讨论
本研究表明，黑胡椒及其主要生物活性化合物胡椒碱对改善红鲷的生长性能、先天免疫、血液学参数和肠道形态有积极影响。同样，在几项研究中，黑胡椒和胡椒碱被认为是养殖鱼类的生长促进剂。例如，日粮中添加黑胡椒可以提高印度鲤鱼的生长和饲料利用率，而0.5%的水平则表现出最高的生长性能（Matiullah等，2016）。同样，Nilavan 等人。(2017)观察到日粮中添加胡椒碱可改善南亚野鲮的 WG、SGR、FCR 和 PER，并发现在 0.2% 的水平下性能更高。含有荜荠 ( Piper longum )、百慕大草 ( Cynodon dactylon )、生姜 ( Zingiber officinalis )、Tridax procumbens ( Tridax procumbens ) 和碎石 ( Phyllanthus niruri ) 植物提取物的饮食使石斑鱼 ( E. tauvina）（Punitha 等人，2008）。

在之前的研究中，胡椒碱和黑胡椒被发现可以提高营养物质的消化率和生物利用度，从而提高蛋白质合成、饲料转化率和鱼类生长（Nilavan 等，2017；Shin 等，2023）。研究发现胡椒碱可以改善鱼类的胃肠道功能（Meghwal & Goswami，2013）。它增加胰腺消化酶的分泌（脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶），刺激营养物质消化（Meghwal & Goswami，2013））。此外，在小鼠研究中发现胡椒碱的摄入会增加胃分泌、唾液和肠粘膜（Bajad等人，2001；Capasso等人，2002）。艾哈迈德等人。(2012)证明胡椒碱激活空肠上皮细胞和细胞膜，增强大鼠的营养吸收。卡朱里亚等人。(2002)据报道，胡椒碱由于其蛋白质折叠能力而提高酶活性，从而改变肠上皮细胞的超微结构并增加肠绒毛长度。此外，研究表明胡椒碱和黑胡椒会改变刷状缘膜的被动渗透性和流动性，刷状缘膜与延长的微绒毛和肠道吸收表面相连。

此外，胡椒碱和黑胡椒被证明可以改变刷状缘膜的流动性和被动渗透性，与微绒毛长度和肠道吸收表面增加相关（Srinivasan，2016））。在本研究以及之前的研究中也观察到了类似的结果，即增加了肠道微绒毛长度和分泌粘液的杯状细胞。因此，本研究中生长、饲料利用效率和肠道形态的改善可能是由于胡椒碱的作用。然而，影响营养物质生物利用度的机制尚未明确。据推测，吸收增强的机制可能是由酶分泌的调节和肠道内膜脂动力学的改变引起的。

血浆胆固醇通过肝脏中的从头合成和胆汁酸形成进行调节。我们的研究观察到喂食胡椒碱和黑胡椒的鱼血浆胆固醇和 HSI 降低。维贾亚库玛与纳里尼 (2006)据报道，胡椒碱对胆汁酸形式的胆固醇排泄具有刺激作用，这意味着其具有降胆固醇作用。以胆汁酸形式增加的胆固醇排泄可能是由于用胡椒碱喂养的鱼降低了血浆胆固醇。这可能是由于肝脏胆固醇生成减少和肝脏中7α羟化酶活性增加引起的。此外，膳食胡椒碱补充剂显示出高胆固醇 7α 羟化酶活性，抑制大鼠肝脏中的胆固醇生物合成（Srinivasan & Sambaiah，1991）。因此，用胡椒碱和黑胡椒喂养的鱼，胆固醇生物合成减少和胆固醇排泄增加可能会降低血浆总胆固醇和HSI。此外，在这项研究中，与Con饮食相比，补充黑胡椒显示血浆血红蛋白和血细胞比容略有降低。乌拉等人。(2021)结果表明，补充黑胡椒叶提取物后， Labeo rohita的红细胞、白细胞总数和淋巴细胞有所增加，结果相互矛盾 。哈桑等人。(2023)研究表明，补充红辣椒油显着增加了肉鸡的红细胞计数和血红蛋白。因此，根据我们降低血红蛋白和血细胞比容的结果，我们不能直接假设黑胡椒可以降低鱼的红细胞，建议进一步研究进行更多研究。

这项研究的结果表明，饮食中的胡椒碱和黑胡椒可以增强鱼类的抗氧化酶活性和先天免疫力。各种体外和体内实验结果证明了黑胡椒及其活性成分的自由基清除和抗氧化特性（Andrade & Ferreira，2013；Hu 等人，2022）。据报道，由于黑胡椒中含有酚类化合物和类黄酮，因此具有抗氧化和 DNA 损伤保护活性（Andrade & Ferreira，2013））。它有利于抑制脂质过氧化，防止高脂肪饮食引起的氧化应激，猝灭超氧化物和羟基阴离子的自由基，并抑制脂氧合酶和致癌作用( Hu et al., 2022 )。此外，还发现黑胡椒或胡椒碱可减少高脂饮食大鼠体内的硫代巴比妥酸反应物质，并维持 SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽 (GSH) 水平、GSH S-转移酶和 GSH 过氧化物酶抗氧化酶活性（Gorgani 等）等人，2017 年；Vijayakumar 等人，2004 年）。胡椒碱表现出肝脏保护活性主要是由于其抗氧化机制。体内和体外研究表明，胡椒碱可以减少脂质过氧化，减轻谷胱甘肽和总硫醇的降解（Khajuria 等，1999）。 萨宾娜等人。(2010)报道胡椒碱的化学保护活性可对抗小鼠的肝损伤，由于其自​​由基清除能力而显示出肝保护作用。纳哈克与萨胡 (2011)证明黑胡椒富含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，可以防止氧化损伤。此外，Zarai 等人。(2013)还揭示了黑胡椒及其活性胡椒碱的抗氧化功效与 α-生育酚相当。

本研究发现，口服胡椒碱可通过增加溶菌酶活性、MPO活性、抗蛋白酶活性和血浆Ig来引起鱼类免疫增强。溶菌酶是一种抗菌酶，可调节宿主对引起细菌细胞裂解的感染的免疫反应（Ferraboschi 等人，2021）。MPO 是中性粒细胞释放的一种过氧化物酶，可防御入侵的病原体和炎症 ( Frangie & Daher, 2022 )。抗蛋白酶可预防过量蛋白酶引起的炎症损伤（Meyer & Jaspers，2015）。Ig 是抗体，具有识别和结合特定抗原（例如细菌和病毒）的功能，从而导致其被破坏（Woof & Kerr，2006）。已知胡椒碱对炎症和先天免疫具有治疗作用。 维贾亚库玛等人。(2004)证明胡椒碱可减弱 TNF-α 诱导的 IkB 激酶活性并阻断 IkBα 的磷酸化和降解。此外，胡椒碱的施用可以抑制黑色素瘤细胞的胶原基质侵袭，并减少 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 等促炎细胞因子（Singh & Duggal，2009））。胡椒碱给药可抑制小鼠体内 1 型干扰素的产生和脂多糖诱导的内毒素休克，考虑到它可能是一种功能性胃肠道抗炎剂（Bae 等，2010）。多项研究表明，胡椒碱可以提高水生动物的先天免疫力（Nilavan 等，2017；Shin 等，2023）。例如，膳食中添加 0.2% 的胡椒碱对血液免疫反应有刺激作用，增加呼吸爆发活性、血红蛋白水平、溶菌酶和吞噬细胞活性，同时提高对细菌的抵抗力。 Labeo rohita中的嗜水气单胞菌感染（Nilavan 等人，2017）。

黑胡椒和胡椒碱已在各种研究中进行了研究，并证实了它们对不同致病菌的抗菌和抗寄生虫作用。 布莱西等人。(2015)显示了P. nigrum对 葡萄球菌属的抗菌特性。古普塔等人。(2013)观察到黑胡椒提取物对大肠杆菌表现出有效的抗菌活性。此外，发现黑胡椒油的抗菌活性可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。斑节对虾 ( Swathy et al., 2018 )。扎莱等人。(2013)揭示黑曲霉 的抗菌效力可能与其所含的酚类化合物和黄酮类化合物高度相关。抗菌作用机制被发现是细胞膜通透性丧失以及细菌生物膜和外排泵的抑制( Karsha & Lakshmi, 2010 )。辣椒品种（尤其是胡椒碱）的抗真菌特性主要由细胞质膜和真菌细胞壁的裂解决定（Pundir & Jain，2010））。在这方面，库马尔等人。(2012)显示了胡椒碱的抗真菌和抗寄生虫作用，其中胡椒碱的体内和体外作用导致Argulus spp 100%死亡率。9.0 mg L –1，金鱼。多项研究证明胡椒碱对大鼠模型和鱼类的先天免疫、抗氧化活性、抗炎和抗寄生虫活性具有临床作用（Derosa 等，2016；Dogra 等，2004； Nilavan 等，2017））；然而，其背后的机制尚未得到全面了解，需要进行进一步的详细研究以进行更彻底的调查。

综上所述，鱼饲料中胡椒碱的最佳添加量为0.25~1.0 g/kg。膳食中添加胡椒碱可以提高鱼类的先天免疫力、抗氧化酶活性和生长性能。在这方面，黑胡椒和胡椒碱可以成为水生动物有效的免疫刺激剂。胡椒碱可以增加肠道微绒毛长度，从而提高鱼的饲料利用率。