介绍
叶绿素a荧光（ChlF）已被广泛用作可测量信号来探测植物中的光化学反应[ 1 ]。常用的基于 ChlF 的测量是根据响应光化光或饱和脉冲的测量 ChlF 幅度（绝对水平）计算的。然而，在缩放和测量 ChlF 等量的绝对量级时存在固有的不确定性，这影响了现有方法的实用性。

当叶子接收到光时，光子能量被叶绿体内的天线捕获[ 2 ]。部分捕获的光子将向前传输进行光化学反应[ 2 , 3 ]，其余部分将以热量或 ChlF 的形式发射[ 4 ]，这通常称为即时荧光[ 5 ]。由于光系统 II (PSII) 中涉及质体醌 Q A和 Q B的光化学反应荧光的形式发射[ 6-9 ]，但这种发射比瞬发荧光弱得多，因此对测得的 ChlF 贡献很小[9 ]。产生热量以防止光氧化损伤[ 10-15 ][ 14-18 ]。ChlF、光化学猝灭和 NPQ 在能量上是互补的，因此可以通过测量 ChlF 来推断光合作用的重要特征。15 ]通过非光化学猝灭(NPQ)[ 14-18 ]。光适应过程主要通过高光下的叶黄素循环受 pH 调节 [ 19 – 23 ]，并在低光下在 2 个光系统之间进行调节 [ 24]

常用的 ChlF 幅度包括暗适应条件下用 F 0、F m和 F v表示的量级，以及光适应条件下用F 0 '、F m ' 和 F v ' 表示的量值 [ 25 ]。F 0表示当光不足以触发光电子传输时的最小荧光值。F m是对初始暗适应样品施加饱和脉冲后测得的可能最大荧光。可变荧光 F v是 F m和 F 0之间的差值。在光适应条件下，用F表示分别为0 '、F m ' 和 F v '。F'是光化光下的稳态荧光。这些测得的 ChlF 水平可以计算各种差异和比率，作为 PSII 量子效率（最大或光化光下）、NPQ、光化学猝灭和 PSII 其他方面的测量[ 26-29 ]。一个主要的困难是 F 0 , F 0'和F'很容易在暗适应或光适应状态以及环境照明方面发生变化。这些重要基线水平的不确定性会降低基于 ChlF 的措施的有效性。幅度或水平的测量常常遇到使用绝对标度所固有的困难。对可变激励的动态响应可能是某些应用的有利替代方案，但很少被探索。

在这项研究中，我们的目的是分析强光化照明期间 ChlF 对时变激发的动态响应。最初的尝试包括时域观察，但重点关注频域分析。设计了伪随机二进制序列（PRBS）并用作多频激发照明，并测量了不同植物样品的动态 ChlF 响应。使用功率谱分析来计算作为激励频率的函数的幅度增益。频域分析揭示了强光化照明期间的额外变化，并产生了一种补偿方法来减少 ChlF 测量中这些变化的影响。

材料和方法
植物样品
使用菠菜、拟南芥、柑橘、沼泽栎和茉莉植物。新鲜甘蓝样品购自当地市场。拟南芥植物在自然光照下的温室中生长，未经任何处理。选择这两种植物是因为它们常用于光合作用相关研究。C. mitis和J. officinale是带有识别标签的盆栽植物，购自当地 Lowe's 商店，并保存在自然光下。沼泽栎是一棵生长在密苏里州哥伦比亚市户外的树，由美国农业部树木科学家鉴定。选择这些室外或室内木本植物是为了扩大植物的使用范围。这些植物生长状况正常，没有明显的病害。样本采集是根据相关准则和法律进行的。每次切下五片叶子作为复制品进行测量。除了下面小节中描述的水分损失测试之外，新鲜的完整叶子样品在被切断后立即用于荧光测量。

荧光测量
ChlF使用制造商为本研究定制的调制叶绿素荧光计（型号 OS5p + ，Opti-Sciences，Hudson，NH，USA）进行测量。该装置的照明、传感和采样机制没有改变。主要变化在于存储器容量和可编程性，以允许实现时变激励信号。为了捕获不同测量周期中的变化，在前 0.1 s 内以 100 kHz 采样频率测量 ChlF，然后在 50 s 之前以 100 Hz 采样频率测量 ChlF，在 PRBS 变化期间以 50 Hz 采样频率测量 ChlF，如下所述。

激励信号
激发信号由宽强光化脉冲组成，后跟高光强度和低光强度的 PRBS，如下所述。采用OS5p +仪器内置白色发光二极管光化光作为激发源。根据文献报道，首先施加2,500 μmol/m 2 /s 的恒定强光化光 50 秒（宽脉冲），以确保在施加 PRBS 信号之前开始适应活动 [ 30 , 31]。样品最初在测量夹中进行暗适应 30 分钟。因此，宽脉冲允许测量 ChlF 的初始 OJIP 阶段和适应强光化照明期间的片段。然后 PRBS 产生多频激励。PRBS 设计的细节可以在许多参考文献中找到[ 32 , 33 ]。选择 PRBS 的单位脉冲宽度、寄存器数量和逻辑多项式，以使激发能量集中在 0.004 至 2π rad/s 之间。从之前的研究来看，ChlF 主要在 2π rad/s 范围内变化[ 34 ]。下限是通过实验确定的，以便可以观察到与强光化照明或 NPQ 活性相关的缓慢变化。

选择PRBS信号的平均水平等于初始恒定光化光的强度，使得PRBS信号会添加高频或快速变化的扰动，而不改变2,500μmol/m 2 / s的平均照明水平。PRBS的低光强度水平和高光强度水平分别为1,000和4,000 μmol/m 2 /s。

为了探索 PRBS 幅度的影响，在不改变平均照明水平的情况下对 2 个附加幅度进行了测试。对于高振幅测试，PRBS信号的高强度和低强度分别为500和4,500μmol/m 2 /s，对于低振幅测试，PRBS信号的高强度和低强度分别为1,500和3,500μmol/m 2 /s。根据文献中报告的范围和值选择照明强度以避免极端条件。

水分含量测量
水分损失用于诱导样品中光能收集和传输过程的变化，并观察分析在水分胁迫条件下是否仍然有效。失水量用常用的相对含水量（RWC）来表示，即（样品重量-干重）/（饱和重量-干重）×100。首先将样品浸入水中至少8 h，使其达到沉重的重量和压力。然后对样品进行称重并进行 ChlF 测量，同时样品在室内条件（22°C、30% 相对湿度和荧光灯）下逐渐失去水分。最后将样品放入烘箱中干燥6 h，得到干重。使用精密天平（型号 PX323/E，Ohaus，Parsippany，NJ，USA）对样品进行称重。
数据分析
使用 Matlab（R2018a 版，MathWorks，Natick，MA，美国）对测量的 ChlF 响应于 PRBS 激励进行频率分析。对PRBS激励信号的时间光强度变化（注意：不是电磁波的光谱）和相应的ChlF响应进行功率谱分析，两者都是时间序列

时域观察 NPQ 对 ChlF 响应的影响
图2显示了最初暗适应的甘蓝样品对宽脉冲（2,500 μmol/m 2 /s 下 50 秒）和随后的 PRBS 信号的 ChlF 响应（为了清晰起见，仅显示了 3 个样品，其他样品的测量结果为相似的）。对宽脉冲的响应遵循已知的模式，首先通过通常所说的 OJIP 阶段上升，然后通过叠加对PRBS 信号的响应的 PSMT 阶段 [ 36 , 37 ] 下降。超过峰值点（通常标记为 P）后，由于最初的光化学猝灭以及随后的光适应或 NPQ 活性，ChlF 开始下降。 38]。虽然这种一般模式是熟悉的，但可以很容易地对 NPQ 对 ChlF 反应的影响进行一些观察。

当比较来自同一植物或同一植物叶簇的重复样品时，尽管这些样品可能处于相似（如果不相同）的条件下，但它们的反应有所不同。首先，ChlF 响应达到不同的峰值（见图2B）。更重要的是，在超过峰值的 NPQ 机制激活后，ChlF 在 PSMT 阶段以不同的速率下降，导致对 PRBS 信号的响应缓慢且不相等的平均值（或偏差）。如图。2B显示，样品1比样品2具有更高的峰值和降低率。样品3具有与其他2个样品相似的降低率，但具有更高的峰值和更高的最终稳定平均ChlF。这表明，即使在复制的样品中，NPQ 启动时的峰值荧光以及光适应导致的 PSMT 相中 ChlF 减少的速率和量也不一致。

从图2A可以看出，随着适应的进展和总体ChlF水平趋于下降，对PRBS激励的响应幅度减小。这种减少在稍后显示的图4A中更加明显。这是有道理的，因为光适应活动减少了光子捕获，同时增加了 NPQ 和热量产生，这将减少以 ChlF 形式重新发射的光子。然而，这种幅度调制效应将使与光化学反应相关的 ChlF 动力学观察复杂化，同时适应处于活跃状态，因为测量的 ChlF 响应在幅度随时间变化的意义上将是非平稳的。这解释并体现了测量的 F 0 '、F m ' 和 F的变化v'与光适应程度的变化相关[ 25 ]。

图3是一个样品对PRBS照明的ChlF响应的放大图。可以注意到 ChlF 在很大程度上与光照“同相”，因为它随着高和低 PRBS 水平之间的快速（或高频）切换而上升和下降，这导致过度光照的快速变化，从而ChlF 排放量。这与使用激励脉冲测量F m '的方式类似。然而，ChlF 在高脉冲或低脉冲间隔期间继续变化，最初与 PRBS 电平变化方向相同但大部分方向相反（高电平期间向下，低电平期间向上），如在较宽脉冲期间可观察到的如图3所示。当施加更强的光化光时，会观察到相同的现象[25 ]。ChlF 的这种反向变化表明负反馈。这与引言部分中简要总结的光适应和光保护的已知机制一致[ 22 , 23 ]。

如图3所示，这些脉冲期间变化并不对称。对所有样本的仔细检查表明，这些脉冲期间反向变化或反转取决于照明强度，并且在短时间间隔内可能很明显，也可能不明显。这与 NPQ 活动是非线性的事实相一致 [ 17 , 18] 并表明 NPQ 活动与 ChlF 对 PRBS 扰动的响应以非线性方式复合。有趣的是，当照明在脉冲期间保持恒定（因此频率较低）时，这些反向变化表现为缓慢变化，而在激励的阶跃变化之后发生快速变化（因此频率较高）。这表明有机会分析频域中的响应。

频域分析
为了建立强光化照明似乎影响低频 ChlF 变化的观察结果，在频域中分析了 ChlF 对 PRBS 激励的响应。图4A重新绘制了图2中所示的ChlF响应的PRBS段，并且图4B是ChlF响应相对于照明激励的相应幅度增益（或比率）图。图4A中的幅度增益与时域中缓慢 PSMT 趋势的水平之间存在明显的对应关系（图4中振荡响应的平均值或偏差）A)，表示强烈照明效果的程度。平均值越高，表明 NPQ 机制的能量转移和热量产生程度越低，因此 ChlF 响应的振幅增益越高。这再次与 pH 介导的光适应过程 [21-23] 是负反馈这一事实相一致，它减少了 ChlF 对光照的反应。值得注意的是，低频和高频的振幅增益均发生了偏移（图4B），对应于图4A中的平均 ChlF 水平，表明强烈的照明效应影响低​​频和高频响应。

图4 B 显示截止频率 ω c = 0.03 rad/s（或 0.01π rad/s）附近增益急剧下降。所有样本，包括测试的其他植物物种（C. mitis、Q. palustris和A. thaliana）的样本，都以大致相同的频率一致地显示出这种增益减少。低通曲线（低频增益高于高频）可能与时域中观察到的光化照明导致的PSMT 相位缓慢下降趋势（图2 A 或4 A）有关 [ 36 , 37 ]。

为了进一步分析上述低通特性，通过高通滤波对 ChlF 响应进行去趋势处理，以抑制低于 ω c = 0.03 rad/s 的频率。去趋势时间响应如图4C所示，幅度增益图如图4D所示。滤波后，高频样本之间的增益差异基本保持不变（对比图4）D 与 B)。有趣的是，滤波操作抑制了低于 0.03 rad/s 的频率（如增益图所示），很大程度上消除了时域响应的趋势并消除了非零均值（或偏差），而不会显着改变高频响应。这表明低于 0.03 rad/s 的幅度增益是由于 PSMT 相位的缓慢趋势造成的，因此低频增益可以作为 NPQ 能量转移程度的指标。

为了确认低频增益是 NPQ 的指标，在​​与 PRBS 测量中使用的相同的强光化照明下，使用 7,000 μmol/m 2 /s 的饱和脉冲测量 Fm'，并使用以下公式计算 NPQ： Fm-Fm′)/Fm′。甘蓝样品的测量 NPQ 与低频增益和增益差的回归结果如图5 A 和 B所示。数据显示 NPQ 和低频增益之间存在负线性关系，并且 NPQ 和低频增益之间没有明显相关性。 NPQ 和增益差异。每个样本都产生相似的线性负相关，但线性回归的斜率和截距因样本而异（图5 ）A) 正如之前的讨论所预料的那样。当单独为每个样本拟合回归线时，R 2值的范围为 0.721 至 0.892。这表明低频增益与 NPQ 线性相关，并且可以用作补偿强光化照明期间测量的 ChlF 变化的影响的参考，如以下部分中进一步测试和探讨的。

励磁幅度测试
作为低频光适应活动对 ChlF 动力学影响的进一步观察，PRBS 激励信号的幅度发生变化，而初始宽脉冲和 PRBS 平均值保持不变。图6A至C显示了针对3种不同PRBS幅度的C.mitis样本的幅度增益图，并且图6D是测量的作为时间函数的ChlF响应，其显示了与图6A至C中的类似的总体PSMT趋势。与图2和图4类似，但响应幅度随激励幅度变化。从图中可以看出，当光照幅度变化时，增益曲线的大致形状（图6 ）A到C和低频增益值变化不大。截止频率 ω c保持在大约 0.03 rad/s。然而，高频增益随照明幅度而变化。Tukey多重比较表明，3个激励幅值的高频增益差异显着（P < 0.05），而低频增益则差异不显着（P > 0.05）。这表明 ChlF 动力学系统是非线性的，因为增益（至少在高频下）随激励幅度变化（对于线性系统，增益不随激励幅度变化）。这解释并支持了所观察到的测量 F m '（以及因此 F q ' 和 F v'）对所使用的激发脉冲和强光化照明的影响[ 25 ]。有趣的是，低频增益没有显着变化，因为影响强光照适应的宽强光化脉冲和PRBS信号均值在实验中没有改变，再次证实低频增益反映了NPQ。

水分损失测试
植物水分状况对 ChlF 反应有很大影响 [ 39 – 41 ]。众所周知，水分损失会影响光电子传输，从而影响光化学反应[ 42 ]。它还可能改变植物的NPQ活性。为了测试当应力引起的变化发生时观察到的 ChlF 响应的低频特征是否成立，在样品叶子在室内条件下逐渐失去水分的同时进行了一系列测量，直到 ChlF 响应和激励之间的相干值开始达到减少，表明样品已经干燥到测量的荧光信号不再是对变化的激发的响应的程度。水分损失的进展由 RWC 指示。

图7显示了几种S. oleracea、C. mitis、Q. palustris和A. thaliana样品在不同水分损失水平下的振幅增益图。如图所示，曲线的低通形状保持为 0.03 rad/s 左右的截止频率 ω c，并且低频和高频增益在样本之间有所不同。一般来说，0.08 至 1 rad/s 之间的高频增益通常会随着水分损失​​的增加（减少 RWC）而降低，但并不总是与 RWC 的顺序相同。例如，对于图7中的C. mitisB，59.38% RWC 的增益曲线高于而不是低于 69.02% RWC 的增益曲线。这种不一致显然与强光化照明的不一致效应有关，这会影响低频增益。如图4 A中的时域响应所示，即使是重复的样品，缓慢的 PSMT 衰减速率也明显不同，表明强光化照明的效果不同。这支持了 ChlF 测量容易受到环境照明和其他变化影响的观察结果 [ 22 , 25 ]，因为强光化照明的影响可能会有所不同。由于低频增益与慢衰减和NPQ相关，因此低频增益的差异（例如图7 ）B) 可以提供帮助。

为了测试增益值如何随水分流失而变化，以 RWC 百分比作为输入并以 3 个增益值之一作为响应进行回归分析：(a) 0.004 至 0.01 rad/s 之间的平均低频增益，(b) 平均值0.08 和 1 rad/s 之间的高频颗粒，或 (c) 平均低频和高频增益之间的增益差。回归R 2值显示在表中。

回归分析表明，高频增益比低频增益更依赖于水分损失，并且增益差异对水分损失最敏感。这意味着几点：首先，失水主要影响高频颗粒。其次，低频增益随水分流失而变化，但程度要小得多。第三，通过以增益差去除低频增益作为基线，R 2值得到改善，这意味着低频增益虽然明显受到失水的影响，但在适应过程中解释了NPQ的某些变化在强光化照明下。R 2仅略有改善，而Q. palustris甚至略有减少和拟南芥样品进行了测试。这显然与2组样品的低频增益差异不显着（P >0.05）有关，表明在失水测试过程中强光化照明的效果变化不大。因此，使用低频增益作为基线并没有比单独使用高频增益带来重大改进。

进行多次失水实验，结果与表相似。以增益差作为响应变量，甘蓝、小芥菜、Q. Palustris和拟南芥的R 2值落在 [0.7259, 0.7561]、[0.655, 0.881]、[0.790、分别为[0.915]和[0.810，0.995]。示例图如图8所示。通过使用低频增益来解释适应强光化照明期间的变化，增益差异显示出对水损失的明​​显依赖性。图8可以看出，对于测试的样品来说，直到RWC下降到80%到85%时，增益差异才出现明显的变化。室内和室外植物的RWC和增益差异之间存在关系。

虽然需要进行额外的实验，尤其是现场实验，但数据表明，动态 ChlF 分析的增益值表现出与一些传统定义的 ChlF 测量值相似的特性，正如动态增益对 NPQ 和湿度的依赖性所表明的那样。增益越高表示 ChlF 响应越强，因此常用测量值（例如 F m和 F m '）的值越大。显然有必要进行进一步的研究。
为了消除或分离强光照下 ChlF 测量的额外变化并了解分子机制，光适应动力学最终需要基于进一步研究的数学模型。在这样的模型可用之前，如本初步研究所示，低频增益可以用作参考，通过至少部分地消除与不同适应程度相关的变化来改进 ChlF 测量。

结论
这项研究表明，动态测量和分析可以提供额外的途径来增强 ChlF 测量在植物研究中的应用。强光化照明似乎在低频下对 ChlF 的影响更大，最显着的是低于 0.03 rad/s。低频增益与 NPQ 线性相关，并且可作为抑制 ChlF 测量变化的参考。强光化光照会影响 ChlF 的振幅，使 ChlF 对光照激发的响应呈现非线性和非平稳性。低频和高频之间的幅度增益差异显示出对植物水分损失的强烈依赖性。