细胞外小泡(sev)主要分为两种类型，质膜来源的sev和内膜来源的sev。后一种类型(本文称为外来体)起源于晚期内体或多泡体(MVB)。为了在细胞外释放外来体，MVBs必须与质膜融合，而不是与溶酶体融合。与MVB-溶酶体融合的机制相反，MVB-质膜融合的机制知之甚少。在这里，我们系统地分析可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)家族蛋白，并鉴定VAMP5为外来体释放所需的MVB定位SNARE蛋白。HeLa细胞中VAMP5的缺失削弱了外来体的释放。从机理上讲，VAMP5通过与SNAP47和质膜陷阱突触融合蛋白1 (STX1)或STX4相互作用来释放外来体，从而介导外来体的释放。还发现VAMP5通过与不同的Q-SNAREs组相互作用，介导极化的马丁-达比犬肾(MDCK)上皮细胞的不对称外来体释放，这表明VAMP5是极化细胞和非极化细胞中的一般外来体调节剂。

关键词:外来体，细胞外小泡，多泡体，圈套器，VAMP5

介绍
外来体是晚期内体/多囊体(MVB)衍生的膜包裹的纳米颗粒，几乎所有类型的细胞都将其释放到细胞外空间。虽然外来体现在被归类为内膜来源的sev，但我们在此将其称为外来体，以区别于质膜来源的sev。已知外来体携带特定的生物活性分子，如蛋白质、脂质和核酸，它们现在被认为是细胞间通讯的新模式，其中它们的货物通过体液从供体转移到受体细胞(卡鲁里和勒布勒，2020年; 马修以及其他人, 2019; 佩格特尔和古尔德，2019年; 范·尼尔以及其他人, 2022).外来体还与几种病理学有关，包括癌症、神经退行性疾病和感染(卡鲁里和勒布勒，2020年; 平内尔以及其他人, 2021; 许以及其他人, 2018).

在1983年，首次报道MVBs与质膜融合，并且该融合导致外来体释放(哈定以及其他人, 1983; 潘和约翰斯通，1983年).在此后的几十年中，有三个步骤被认为是外泌体释放的关键。在第一步中，通过MVBs的界膜向内出芽进入管腔侧来形成包含未来外体货物的管腔内小泡(ILVs ),在第二步中，分泌型MVBs被特异性地转运到质膜。在第三步也是最后一步，这些MVB与质膜融合，导致ilv作为外来体(赫斯维克和略伦特，2018年; 范·尼尔以及其他人, 2018; 范·尼尔以及其他人, 2022).因为已知大多数MVBs与溶酶体融合，其中它们的内容物通过内吞途径被降解(霍塔里和赫莱纽斯，2011年; 杨和王，2021)，分泌型MVBs必须选择性地与质膜融合，而不是与溶酶体融合，以释放外泌体。

分泌型MVBs如何与质膜融合尚未完全阐明。一般来说，特定的膜融合事件是通过可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)复合物(洪，2005; Jahn和Scheller，2006年).在膜融合过程中，由Qa-、Qb-、Qc-和R-圈套器组成的圈套器复合物形成平行的四螺旋束，每个圈套器为该束贡献一个螺旋。几种单独的SNARE蛋白，包括突触融合蛋白5(stx 5；QA-圈套器)、ykt 6(R-圈套器)和vamp 7(R-圈套器)据报道参与外来体释放(音量控制器以及其他人, 2009; 冈萨雷斯-门德斯以及其他人, 2020; 总的以及其他人, 2012; 海恩以及其他人, 2015; 山峰以及其他人, 2020; 韦尔韦伊以及其他人, 2018; 王（姓氏）以及其他人, 2021; 魏以及其他人, 2017).然而，由于YKT6和STX5参与内质网(er)到高尔基体的运输(哈德威克和佩勒姆，1992年; 麦克纽以及其他人, 1997)，它们的抑制可能广泛影响其他膜融合事件。此外，尽管VAMP7，一种众所周知的晚期内体和溶酶体R-圈套器(阿德瓦尼以及其他人, 1999)，已显示促进人白血病K562细胞的外来体释放(音量控制器以及其他人, 2009)，据报道VAMP7抑制不影响上皮马丁达比犬肾(MDCK)细胞的外来体释放(普劳克斯-吉尔拉德以及其他人, 2007).因此，还没有发现直接介导MVB-质膜融合的一般陷阱蛋白，特别是特异性陷阱复合物。

在这项研究中，我们系统地筛选了介导外泌体释放的SNARE蛋白，并成功地将R-SNARE VAMP5鉴定为外泌体释放的MVB定位调节因子。VAMP5的缺失损害了HeLa细胞的外来体释放。我们还发现VAMP5与SNAP47和STX1或STX4形成两种不同的陷阱复合物来介导外泌体释放。此外，我们发现VAMP5和不同的Q-SNAREs以不同的方式介导极化MDCK细胞顶端和基底外侧的外泌体释放。我们的发现表明，VAMP5是各种细胞类型的外泌体释放的一般中枢调节因子。

材料和方法
细胞培养
HeLa、HEK293T和MDCK-II细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) (Fujifilm Wako Pure Chemical，Osaka，Japan)中培养，培养基中添加了10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的5% CO2孵化器。纯化极化MDCK细胞释放的sev或外来体，1 × 106将MDCK细胞铺在细胞培养插入物上(140640，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)。培养基每24小时更换一次，3天后细胞用PBS洗两次，用不含FBS的DMEM洗一次。然后将细胞在1毫升含1%去EV FBS的DMEM中培养24小时。通过100，000 ×超速离心获得EV-耗尽的FBSg持续24小时并通过0.22微米过滤器过滤。

质体
如前所述制备pMRX-IRES-blast-人CD63(松井以及其他人, 2021).使用小鼠或人脑马拉松就绪cDNA作为模板(Clontech/Takara Bio，Shiga，日本)，通过PCR扩增小鼠或人的SNARE cDNAs。将cDNAs与增强型GFP (EGFP)、3 × FLAG或3 × Myc一起插入pMRX-IRES-puro。SNARE表达质粒可从日本理研生物资源研究中心(https://dnaconda.riken.jp/search/depositor/dep005893.html；分类编号RDB 20035–RDB 20073)。

抗体和试剂
本研究中使用的所有一抗列于表S1。如前所述制备兔多克隆抗podocalyxin抗体(Mrozowska和福田，2016年).辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG山羊多克隆抗体(Southern Biotech，Birmingham，al，USA)、HRP缀合的抗兔IgG驴抗体(GE Healthcare，Chicago，IL，USA)、HRP缀合的蛋白-G (Abcam，Cambridge，UK)和Alexa Fluor 488/555/633缀合的抗山羊/小鼠/大鼠IgG驴或山羊多克隆抗体(Thermo Fisher Scientific)用作第二抗体。Alexa Fluor 488-缀合的鬼笔环肽(Thermo Fisher Scientific)用于显现肌动蛋白。

从细胞培养基中分离CD63阳性sev(主要是外来体)
收集的培养基首先经受700 ×的离心步骤g5分钟以沉淀并去除细胞，上清液以3，000 ×g10分钟以去除细胞碎片和凋亡小体。将第二上清液以16，500 ×离心g30分钟以去除重的微泡，并且通过将最终上清液通过0.22-微米孔PES过滤器(Millipore，Burlington，MA，USA)来去除任何剩余的大EVs。然后将获得的上清液(预澄清的培养基)进行直接免疫亲和捕获，以去除膜联蛋白I阳性小囊泡(即微泡)。如前所述进行直接免疫亲和捕获(杰佩森以及其他人, 2019).简而言之，预澄清的培养基在4℃下与直接缀合抗CD63抗体的dyna beads(Thermo Fisher Scientific)一起旋转孵育16小时。然后用0.22微米过滤的冰冷的0.1% BSA-PBS洗涤珠子两次，用0.22微米过滤的PBS洗涤一次。最后一次洗涤后，立即将加载了外来体的珠子悬浮在不含还原剂的SDS样品缓冲液中(在本研究中称为外来体样品，除非另有说明)。用磁铁从悬浮液中除去珠子，将澄清的裂解物用于免疫印迹。对于NTA，通过在室温下在0.22-微米过滤的0.1 M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 3.0)中孵育装载外来体的珠子5分钟，然后用四分之一体积的0.22-微米过滤的1 M Tris-HCl (pH 8.0)平衡，从珠子中洗脱外来体。用磁铁去除珠子后剩余的上清液悬浮在0.22微米过滤的PBS中。

逆转录病毒感染和稳定细胞系的产生
使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)用逆转录病毒载体pCG-gag-pol和pCG-VSV-G(由T. Yasui，日本大阪国立生物医学创新、健康和营养研究所提供)瞬时转染HEK293T细胞。转染后两天，收集含有逆转录病毒的培养基，并通过0.22微米孔PES过滤器过滤。用逆转录病毒和8 μg/ml凝聚胺培养HeLa细胞和MDCK细胞，用5 μg/ml杀稻瘟菌素S和/或1 μg/ml嘌呤霉素去除未感染的细胞。

建立VAMP5-KO HeLa细胞
设计用于靶向人类的CRISPR指导RNA (gRNA)序列VAMP5基因克隆到pSpCas9(BB)-2A-bsr载体(小口以及其他人, 2020).目标序列是人类VAMP5，5 '-gctccaacttctattctgcc-3 '。使用Lipofectamine 2000和携带上述gRNA序列的pSpCas9(BB)-2A-bsr载体转染HeLa细胞。24小时后，用5 μg/ml杀稻瘟菌素s去除未转染的细胞。通过基因组DNA测序和免疫印迹鉴定两个等位基因均有突变的克隆。两个独立VAMP5-KO细胞系，这两种细胞系都显示出外泌体分泌减少，并且#13克隆用于该研究。单核苷酸插入(粗体；5'-GGCAAGGAATAGAGTTGGAGC-3’)或单核苷酸缺失和单核苷酸取代(分别为连字符和下划线；5'-GG-AGGT在#13克隆的靶序列中发现了atagagtggagc-3’)。

RNAi
siRNA寡核苷酸购自Nippon Gene(东京，日本)和Thermo Fisher Scientific。所用的靶序列列于表S1。根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific)用siRNA寡核苷酸转染细胞。

免疫沉淀和免疫印迹
在裂解缓冲液(50 mM HEPES-KOH，pH 7.2，150 mM NaCl，1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物[完全铥、不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒；瑞士巴塞尔罗氏])。在16，500 ×离心后g用抗FLAG M2亲和凝胶(适马-奥尔德里奇公司，圣路易斯，密苏里州，美国)对上清液进行免疫沉淀10分钟。获得的免疫复合物在洗涤缓冲液(50 mM HEPES-KOH，pH 7.2，150 mM NaCl和1% Triton X-100)中洗涤三次，并在SDS样品缓冲液中煮沸。随后通过SDS-PAGE分离样品，并转移至Immobilon-P聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。用所示抗体进行免疫印迹分析，并用Immobilon Western化学发光HRP底物(Millipore)实现可视化。

从HeLa细胞中分离CD63阳性MVBs
用匀浆缓冲液(20 mM HEPES-KOH，pH 7.2，40 mM蔗糖，1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物)悬浮稳定表达CD63-3 × FLAG的HeLa细胞，并通过25号针匀浆。在3000×离心后g10分钟后，通过使用抗DYDDDDK-tag抗体磁珠(Fujifilm Wako Pure Chemical)对上清液进行免疫沉淀4小时。将获得的CD63-3 × FLAG阳性MVBs在均化缓冲液中洗涤三次，在最后一次洗涤后，立即将负载MVB的珠子悬浮在不含还原剂的SDS样品缓冲液中。用磁铁从悬浮液中除去珠子，将澄清的裂解物用于免疫印迹。

纳米粒子跟踪分析(NTA)
使用Malvern NanoSight ns 300(mal vern Panalytical，mal vern，UK)描述的NTA方法分析纯化的外来体样品的颗粒浓度和大小分布。根据制造商推荐的方案进行分析。简而言之，用0.22微米过滤的PBS稀释的外泌体制剂的三个独立副本以恒定的速率注射到配有注射泵的跟踪室中，并在室温下跟踪标本60秒。手动调节快门和增益以实现最佳检测，并保持所有样品的最佳设置。用NTA软件(版本3.4，马尔文Panalytical)捕获并分析数据。在我们的实验条件下，大多数CD63阳性外泌体以50-100nm大小的部分(即典型的外泌体大小)回收，但峰值经常向更低或更高的值移动，并且有时在每次试验中观察到分裂峰，即使使用对照样品时也是如此。由于这一技术问题，我们不认为这项研究中50-100纳米范围内的峰移动或分裂是显著的。除了典型大小的外泌体之外，我们经常观察到100-150nm的较大囊泡，它们的数量因实验而异，甚至在对照样品中也是如此。这些较大的囊泡可能是在纯化过程中人工形成的两个以上外来体的聚集体。

免疫细胞化学
用PBS洗涤在盖玻片(Kishiwada，Osaka，Japan)或玻璃底皿(MatTek，Ashland，MA，USA)上生长的细胞，并在室温下在4% PFA或10% TCA中固定10分钟。用PBS中的50 μg/ml洋地黄皂苷(适马-奥尔德里奇)渗透固定的细胞5分钟，用PBS中的3% BSA封闭30分钟，然后与第一抗体一起孵育1小时。用PBS洗涤三次后，将细胞与Alexa Fluor 488/555/633-缀合的抗驴或羊IgG第二抗体一起孵育1小时使用Photoshop 2022软件(Adobe，San Jose，CA，USA)处理图像。

表皮生长因子受体(EGFR)降解试验
将HeLa细胞在90%汇合的无血清DMEM中培养20小时，然后用含有200 ng/ml EGF的DMEM(Thermo Fisher Scientific)孵育，时间如图S2C所示。用指定的抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。

电子显微镜
将细胞培养在cell tight C-2细胞盘(Sumitomo Bakelite，Tokyo，Japan)上，并在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的2.5%戊二醛(Electron Microscopy Sciences，Hartfield，PA，USA)中在冰上固定2小时。用pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中的1%四氧化锇中后固定2 h，脱水，并根据标准程序包埋在Epon 812中。超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。用JEM-1400闪光电子显微镜(日本Akishima的JEOL)检查所有样品。

统计分析
两组数据由不成对的双尾学生进行评估t-检验，并通过单向方差分析(ANOVA)进行多重比较，然后进行Tukey检验。用Prism9 (GraphPad软件)进行统计分析。

结果和讨论
VAMP5是MVB本地化的R-圈套器
为了确定直接参与外泌体释放的陷阱，我们首先筛选MVBs上的Qa-或R-陷阱，因为当Qa-陷阱出现在MVBs上时，它的伙伴R-陷阱应该在质膜上，反之亦然。为此，我们建立了稳定表达每个EGFP标记的哺乳动物Qa-或R-SNARE的HeLa细胞，并研究了其与MVB标记CD63的共定位。在研究的25个Qa-和R-陷阱中，7个陷阱(STX1A、STX1B、STX11、VAMP4、VAMP5、VAMP7和SEC22C)在HeLa细胞中与CD63很好地共定位(图一a；以及图S1A和S1B)。因为，如上文介绍中所述，VAMP7似乎只参与特定细胞系(音量控制器以及其他人, 2009; 普劳克斯-吉尔拉德以及其他人, 2007)我们的初步数据显示，在HeLa细胞中VAMP7的缺失反而增加了外来体的释放(数据未显示)，因此我们将VAMP7从候选物中排除。在剩余的6个候选陷阱中，我们发现VAMP5与CD63在极化的MDCK细胞中最广泛地共定位(图一b；以及图S1C和S1D)。此外，在分离的CD63阳性MVB样品中也检测到内源性VAMP5(图一c)。因此，VAMP5可能是一种MVB定位的SNARE蛋白。VAMP5是一种普遍表达的SNARE蛋白，除了其SNARE结构域和跨膜区(曾以及其他人, 1998).已经证明VAMP5是葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4)向质膜转运所必需的(施文克以及其他人, 2010)，以及Vamp5-KO小鼠出生率低，并表现出泌尿和呼吸系统异常(池泽以及其他人, 2018).然而，由于对VAMP5在外泌体释放中的作用一无所知，我们选择它作为一种新的MVB定位圈套的主要候选，该圈套通常调节外泌体释放，并研究其缺失对外泌体释放的影响。


图一
常驻MVB的VAMP5是HeLa细胞释放外来体所必需的

(A)鉴定MVBs中存在的Qa/R-SNARE蛋白的策略。

(B)用抗CD63抗体对稳定表达EGFP-VAMP5的HeLa和MDCK细胞进行免疫染色。比例尺，20 μm

(C)将稳定表达CD63-3 × FLAG的HeLa细胞在无去污剂的情况下匀浆，用抗FLAG抗体从匀浆中免疫分离CD63阳性MVB。用所示抗体通过免疫印迹分析总匀浆和MVB蛋白。值得注意的是，仅在缺乏Triton X-100的情况下，在MVB样品中检测到VAMP5，这表明内源性VAMP5定位于MVBs。

(D)重量，VAMP5-KO，并拯救在完全培养基中培养48小时的HeLa细胞。然后，用EV耗尽的培养基替换培养基。一天后，用抗CD63抗体通过直接免疫亲和捕获分离外来体。用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物和分离的外来体蛋白。

(E)用甘氨酸缓冲液从珠子上洗脱(D)中制备的外来体，并通过NTA分析。量化在五个独立实验中获得的NTA数据。*P<0.01 (one-way ANOVA and Tukey’s test). Means ± s.e.m. are shown.

(F)显示了典型的NTA痕迹。

VAMP5是HeLa细胞释放外来体所必需的
为了确定VAMP5是否参与外来体释放，我们建立了VAMP5-KO HeLa细胞，然后从野生型(WT)细胞的培养基中收集CD63阳性外来体，VAMP5-KO细胞和拯救的细胞(VAMP5-稳定表达小鼠Vamp5的KO细胞)通过用抗CD63抗体(杰佩森以及其他人, 2019).如所示图一d，VAMP5-KO显著降低了外泌体样本中CD63、CD9和TSG101的数量，这种表型通过小鼠Vamp5的再表达得以挽救。纳米粒子跟踪分析(NTA)的结果也表明，外来体从VAMP5-KO HeLa细胞显著减少，对外泌体大小(主要在50-100纳米左右)几乎没有影响(图一e和1f)。

排除…的可能性VAMP5-KO影响外泌体生物发生和/或MVB形成和功能，而不是外泌体释放本身，我们对MVBs进行了免疫荧光和电子显微镜分析。正如预期的那样，在中没有观察到MVB本地化的变化VAMP5-KO HeLa细胞与WT细胞的比较(图S2A)。电子显微镜分析也证实了正常的MVB形态和大小VAMP5-KO HeLa细胞(图S2B)，表明MVB形成正常发生在KO细胞中。此外，EGFR降解试验表明，内吞途径不受VAMP5——柯(图S2C)。综上所述，这些发现表明VAMP5调节外泌体的释放而不影响外泌体的生物发生。

SNAP47是一种VAMP5结合Qbc-SNARE蛋白，是外来体释放所必需的
由于VAMP5是一种R-陷阱，它应该与Qa-、Qb-和Qc-陷阱相互作用来介导陷阱催化的膜融合(洪，2005; Jahn和Scheller，2006年).在测试的Qb-和Qc-陷阱中，VAMP5能够与Vti1B(Qb-陷阱)、SNAP23、SNAP25和snap 47(Qbc-陷阱；图2a)，但由于SNAP47与VAMP5的交互最强，我们在其中重点关注SNAP47。尽管已经报道SNAP47存在于CD63阳性的内涵体(库斯特以及其他人, 2015)并参与神经元分泌(乌尔维纳以及其他人, 2021)和自噬(青柳以及其他人, 2018; 电晕以及其他人, 2018)，但从未研究过它与外泌体释放的关系。


图2
SNAP47，一种VAMP5结合Qbc-SNARE，介导HeLa细胞释放外来体

(A)裂解瞬时表达3 × FLAG标记的Qb-、Qc-或Qbc-SNAREs和/或3 × Myc-VAMP5的HEK293T细胞，用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物。

(B)用siControl或siSNAP47s转染HeLa细胞。48小时后，用EV耗尽的培养基替换培养基。一天后，用抗CD63抗体通过直接免疫亲和捕获分离外来体。用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物和分离的外来体蛋白。

(C)用甘氨酸缓冲液从珠子上洗脱(B)中制备的外来体，并通过NTA分析。量化在五个独立实验中获得的NTA数据。*P<0.01 (unpaired two-tailed Student’s t-测试)。显示的是平均值。

(D)显示了典型的NTA痕迹。

因此，我们继续研究SNAP47敲除对HeLa细胞释放外来体的影响。如所示图2b，SNAP47敲除减少了外泌体样品中CD63、CD9和TSG101的数量，与VAMP5-如上所述的KO(图一d)。类似地，SNAP47的缺失显著减少了外来体的数量(图2c和2d)。此外，在SNAP47敲除的HeLa细胞中，MVBs的亚细胞定位和大小不受影响(图S3A)。这些发现表明SNAP47可能与VAMP5一起调节外来体的释放。

SNAP47结合和质膜定位的质量保证陷阱的鉴定
我们接下来试图通过对哺乳动物Qa-SNAREs进行结合分析来鉴定与VAMP5和SNAP47一起发挥作用的Qa-SNARE，结果显示SNAP47与STX1A、STX1B、STX4和STX17(图3a)。因为VAMP5主要位于MVBs(图一b)中，我们寻找定位于质膜的Qa-陷阱，并将STX1A、STX1B和STX4确定为候选(图3b)。STX1A/B(以下称为STX1)和STX4是众所周知的质膜圈套器(Jahn和Scheller，2006年; 滕以及其他人, 2001)，并参与各种类型的胞吐作用，包括神经递质释放(STX1贝内特以及其他人, 1992)、胰岛素分泌(STX1马丁以及其他人, 1995)，以及GLUT4和谷氨酸受体向质膜的移位(STX4箱子以及其他人, 2018; 森田一义以及其他人, 1998).STX1A和STX4最近被证明参与了果蝇细胞和人类细胞分别(冈萨雷斯-门德斯以及其他人, 2020; 科莱斯以及其他人, 2012; 韦尔韦伊以及其他人, 2018)，在我们的实验条件下，HeLa细胞中STX1或STX4敲低显著抑制了外来体释放(图3c–3e)不影响MVB形态或分布(图S3A)。STX1和STX4的缺失显示了对外泌体释放的附加效应(图3c–3e)，强烈表明STX1和STX4相互独立地介导外来体释放。


图3
SNAP47结合的Qa-SNARE STX1A/1B/4是HeLa细胞释放外来体所必需的

(A)裂解瞬时表达3 × FLAG-Qa-SNAREs和/或3 × Myc-SNAP47的HEK293T细胞，用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物。

(B)稳定表达EGFP标记的STX1A、STX1B、STX4或STX17的HeLa细胞被固定并通过共聚焦显微镜检查。每个圈套的质膜定位用黄色箭头表示。比例尺，20 μm

(C)用siControl或所示的siRNAs转染HeLa细胞。48小时后，用EV耗尽的培养基替换培养基。一天后，用抗CD63抗体通过直接免疫亲和捕获分离外来体。用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物和分离的外来体蛋白。

(D)用甘氨酸缓冲液从珠子上洗脱(C)中制备的外来体，并通过NTA分析。量化在五个独立实验中获得的NTA数据。*P<0.01 (one-way ANOVA and Tukey’s test). Means ± s.e.m. are shown.

(E)显示了典型的NTA痕迹。

(F)裂解瞬时表达3 × FLAG-STX1A/1B/4和/或3 × Myc-SNAP47的HEK293T细胞，用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物。

(G)提出的从HeLa细胞释放VAMP5介导的外来体的模型。

我们接下来研究了VAMP5是否与SNAP47和STX1A、STX1B或STX4形成复合物。我们的免疫沉淀试验的结果显示，内源性VAMP5仅在表达Myc snap 47的条件下与FLAG-STX1A/1B/4以及Myc snap 47共沉淀(图3f)，提示VAMP5可与SNAP47和STX1A/1B/4形成三元复合物。这些发现让我们得出结论，MVB驻留的R-SNARE VAMP5与Qbc-SNARE SNAP47和质膜Qa-SNARE STX1或STX4一起调节HeLa细胞的外来体释放(图3g)。

VAMP5是上皮MDCK细胞释放极化外来体所必需的
为了评估调节单细胞外泌体释放的两组不同Q-SNAREs的存在的重要性，我们将注意力集中在极化的上皮细胞系MDCK，因为我们以前表明极化的MDCK细胞不对称地从顶膜和基底外侧膜释放两种不同类型的外泌体(分别命名为顶外泌体和基底外侧外泌体) (松井以及其他人, 2021).这些外来体具有不同的蛋白质组成，并且来源于不同的MVBs。我们还发现每个分泌型MVBs通过不同的机制运输到顶膜或基底外侧膜(松井以及其他人, 2022).然而，介导MVB-顶端膜或MVB-基底外侧膜融合的圈套复合体尚未被确定。

在最后一组实验中，我们研究了VAMP5、SNAP47和STX1或STX4是否参与极化MDCK细胞的不对称外来体释放。为此，我们建立了稳定表达人CD63的MDCK细胞，并通过抗CD63抗体的直接免疫亲和捕获分别收集顶端和基底外侧CD63阳性外来体。如所示图4a，在极化MDCK细胞中敲除VAMP5、SNAP47或STX1降低了顶端和基底外侧外泌体样本中CD63、CD9和TSG101的数量。另一方面，STX4敲除特异性地减少了基底外侧外来体蛋白的量，而不改变顶端样品中的蛋白量。NTA得出了类似的结果(图4b和4c)。重要的是，VAMP5、SNAP47、STX1或STX4本身的缺失对MVB形成或定位没有影响(图S3B)。此外，在每个敲除细胞中建立了正常的顶端-基底外侧不对称，与对照细胞相同:在细胞的上侧(顶端部分)检测到Podocalyxin(一种顶端膜标记)信号，并且还观察到ZO-1阳性紧密连接(图S3C)。这些发现表明，VAMP5、SNAP47、STX1和STX4介导不同细胞类型的外来体释放，即非极化的人HeLa细胞和极化的犬MDCK细胞。


图4
VAMP5、SNAP47或STX1A/1B/4是极化MDCK细胞释放外来体所必需的

(A)用siControl或所示的siRNAs转染MDCK细胞，将细胞转移到细胞培养插入物中并培养4天。在最后一天，用EV耗尽的培养基替换培养基。使用抗CD63抗体通过直接免疫亲和捕获从预清除的培养基中分离sev。用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物和分离的外来体蛋白。

(B)用甘氨酸缓冲液从珠子上洗脱如(A)中制备的外来体，并通过NTA分析。量化在五个独立实验中获得的NTA数据。*P<0.01 (one-way ANOVA and Tukey’s test). Means ± s.e.m. are shown.

(C)显示了典型的NTA痕迹。

(D)将稳定表达EGFP-STX1A/1B/4的MDCK细胞培养72小时，然后将细胞固定并通过共聚焦显微镜检查。比例尺，20 μm

(E)如(D)中所述培养细胞，并用抗ZO-1抗体进行免疫染色。用鬼笔环肽观察肌动蛋白。比例尺，5 μm

(F)提出了VAMP5介导的极化MDCK细胞释放外来体的模型。

据报道，STX4仅存在于极化MDCK细胞的基底外侧膜(低的以及其他人, 1996).与本报告一致，我们证实了EGFP-STX4位于基底外侧膜，而EGFP-STX1A和-STX1B位于质膜的两侧(图4d和4e)。这些发现表明，vamp 5–snap 47–stx 1复合物介导顶端和基底外侧的外泌体释放，而vamp 5–snap 47–ST x4复合物仅介导基底外侧的外泌体释放(图4f)。

在这项研究中，我们系统地筛选了参与外泌体释放的SNARE蛋白，并成功地将R-SNARE VAMP5鉴定为一种新的外泌体调节因子。我们证明VAMP5存在于MVBs，并通过SNAP47和STX1或STX4形成的SNARE复合物调节外来体的释放。因为STX1和STX4可能在HeLa细胞中彼此独立地发挥功能(图3c–3e)和STX4仅在MDCK细胞的基底外侧起作用(图4答–4c)中，我们提出两种不同的SNARE复合物，即vamp 5–snap 47–stx 1和vamp 5–snap 47–ST x4，在人类细胞和犬细胞中介导MVB–质膜融合(图3g和图4f)

在MVB-质膜融合中，STX1和STX4是如何区别使用的？最近已经报道了外泌体异质性，即从单个细胞释放各种类型的外泌体，但是对它们释放的机制知之甚少(科伦坡以及其他人, 2013; 卡鲁里和勒布勒，2020年; 科瓦尔以及其他人, 2016; 松井以及其他人, 2021; 张（姓氏）以及其他人, 2018).因此，STX1和STX4可能用于不同类型的VAMP5阳性MVB，其包含不同外来体(例如，顶端和基底外侧外来体)的种子，从而释放异质外来体。

先前的研究表明STX5是MVB-质膜融合所必需的C.线虫并且它的缺乏导致MVB在质膜下积聚(海恩以及其他人, 2015).然而，在SNAP47-、STX1A/B-、ST x4-敲除细胞中没有观察到这种表型，甚至在VAMP5-KO细胞(图S2A；以及图S3A和S3B)。此外，没有观察到任何测试的外来体蛋白在任何SNARE-耗尽细胞的细胞裂解物中积累(例如，VAMP5-KO HeLa细胞在图一d)，表明分泌型MVB仅是哺乳动物细胞中所有MVB的一小部分(在MDCK细胞的情况下，少于所有MVB的1%;松井以及其他人, 2021).因此，即使在缺乏VAMP5或其同源陷阱的情况下，在哺乳动物细胞中没有观察到质膜附近的MVB积累也就不足为奇了。

VAMP5何时以及如何识别分泌型MVB并被其招募？最近的一项研究表明，VAMP5存在于MVBs的腔侧，并且VAMP5本身作为CD63阳性sev或来自Müller细胞(一种视网膜中的放射状胶质细胞(德梅斯以及其他人, 2022).这些发现表明，VAMP5可以在ILVs形成之前存在于MVBs的表面，外来体的种子，并且一些MVB定位的VAMP5可能与外来体蛋白如CD63一起意外地掺入ILVs，从而导致其作为外来体分泌。还报道了在外来体中类似地包含外来体调节物，例如ALIX(巴伊蒂以及其他人, 2012).虽然VAMP5靶向MVB表面的机制尚不清楚，但我们假设VAMP5通过内吞途径转运到MVB表面，因为VAMP5部分位于质膜(图一b；和曾以及其他人, 1998).与我们的假设一致，已知晚期内体/溶酶体VAMP7通过内吞途径从质膜靶向MVBs，这由VAMP7的N-末端longin结构域和Hrb(普赖尔以及其他人, 2008).因此，未来寻找MVB靶向所需的VAMP5相互作用子将是令人感兴趣的，尽管与VAMP7不同，VAMP5仅由陷阱结构域和跨膜区组成，并且不包含任何额外的结构域(曾以及其他人, 1998).

虽然外泌体释放是从酵母到人类普遍保守的现象，但VAMP5在脊椎动物中大多是保守的。因为外泌体的释放在某种程度上得以保留VAMP5-KO细胞(图一d和1e)和在VAMP5敲除细胞中(图4答–4c)，VAMP5介导的外泌体释放不是唯一的机制，还必须有一个尚未确定的VAMP5非依赖性机制。然而，VAMP5或其同源Q-SNAREs的缺失导致HeLa细胞和MDKC细胞释放的外来体减少约50%-80%。因此，根据文献检索，我们可以确定VAMP5介导的外泌体释放是在哺乳动物中发现的第一个也是主要的外泌体释放机制。有必要进行进一步的广泛研究，以确定额外的VAMP5非依赖性外泌体释放机制。